CN107937519B

CN107937519B - 一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用

Info

Publication number: CN107937519B
Application number: CN201711047984.9A
Authority: CN
Inventors: 季敬璋; 申志发; 冯笑; 金玉; 龚莉莎; 胡雪梅
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN107937519A

Abstract

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的Boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用Western‑blot、RNA染色、免疫荧光等技术验证分离结果。研究在HCCLM3肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与HCC浸润转移过程有关的微小RNA，在临床上实验证明个体血清hsa‑let‑7c‑3p的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性。本发明将为临床诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段，在辅助HCC的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值，通过let‑7c‑3p的ROC曲线，以及let‑7c‑3p与CEA联用、let‑7c‑3p与AFP联用、let‑7c‑3p与AFP和CEA联用的ROC曲线，提高了灵敏度及特异性，诊断价值得到了明显的提高。

Description

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用

技术领域

本发明具体涉及分子生物技术领域，具体涉及一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。

背景技术

肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内的第五种最常见的恶性肿瘤。尽管这些年在HCC的诊疗上有很大的进步，但由于临床上HCC经常会有复发和转移，HCC患者的5年生存率仍然相当低。HCC的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下（B型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、黄曲霉毒素B1的摄入量或酒精滥用等）发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。

肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期调控、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因（见图2）。

近年来在HCC的基础与临床研究方面虽然取得了一些进展，但始终未能阐明HCC转移复发的机制。因此，寻找有效的转移复发抑制途径，已成为进一步提高生存率的关键。研究提示，在人类肿瘤中，microRNA（miRNAs）既可以作为癌基因促进肿瘤的发生和发展，也可以发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤。

寻找肿瘤相关的miRNAs，并探讨其具体作用的机制或其成为新的分子诊断标志物，已成为肿瘤相关研究中的新方向。miRNAs的异常表达参与肿瘤的发生和发展，在肿瘤产生、癌细胞增殖和调亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。相应的研究亦证实：某些miRNAs在HCC的肿瘤产生、肿瘤细胞增殖和凋亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。研究发现miRNAs在肝癌组织中经常表达失调，并且一些特定的miRNAs与肝癌的转移、复发和预后等临床病理特征相关。因此，miRNA可能作为HCC新的分子诊断标志物和治疗靶点。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的提供了一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。

一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法。

本发明采用的技术解决方案是：一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物，所述的特异性生物标志物为miRNA hsa-let-7c-3p。

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)建立HCCLM3细胞模型

(2)从已建成的细胞模型中分离细胞突出和细胞体；

(3) 从分离的细胞突出和细胞体中分别提取 RNA；

(4)在前期miR-SEQ测序结果内筛选本体表达高且差异倍数大的候选miRNAs；

(5)收集HCC患者组织、血浆样本及临床资料，提取miRNA；

(6) 将抽提的 miRNA 逆转录为 cDNA；

(7) 进一步用实时荧光定量PCR分析方法对正常人和HCC患者进行逐个验证筛选，并对筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的miRNA并对临床价值进行评估。

一种检测原发性肝癌的试剂盒，所述的试剂盒包括有检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂。

一种检测原发性肝癌的试剂盒，所述的检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂包含一对特异性引物，引物序列为：

F Primer: GGCGAGTCTGTACAACCTTCTAG；

R Primer: TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT。

一种特异性生物标志物hsa-let-7c-3p在作为肝细胞性肝癌转移性指标上的应用。

一种特异性生物标志物hsa-let-7c-3p联用肿瘤生物标志物AFP、CEA在作为肝细胞性肝癌转移性指标上应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用，在临床上实验证明个体血清hsa-let-7c-3p的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性。本发明将为临床诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段，在辅助HCC的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值，通过let-7c-3p的ROC曲线，以及let-7c-3p与CEA联用、let-7c-3p与AFP联用、let-7c-3p与AFP和CEA联用的ROC曲线，提高了灵敏度及特异性，诊断价值得到了明显的提高。

附图说明

图 1 为本发明 miRNA 筛选及制备的主要流程。

图 2 为显示正常细胞和经过诱导的恶性肿瘤细胞突出形态的对比图。

图 3 为Boyden 培养皿法分离肝癌细胞突出和细胞体。

图 4、5为显示RNA-seq中显示出的miRNA差异表达。

图 6为HCCLM3 细胞株免疫荧光实验结果图。

图 7为HCCLM3 细胞株 EtBr 染色实验结果图。

图 8为免疫荧光和免疫印迹法检验 Boyden 培养皿分离法有效性荧光图。

图9为Ladder质检峰图。

图10为HCCLM3肝癌转移细胞突出质检峰图。

图11 为HCCLM3肝癌转移细胞胞体质检峰图。

图 12为显示差异小RNA的靶基因GO显著性富集分析。

图 13、14 为RNA-seq实验方案。

图 15 为显示正常细胞和经过诱导的恶性肿瘤细胞突出形态的对比图。

图 16、17 为肝细胞肝癌与健康对照组在let-7c-3p中的表达差异。

图 18为 let-7c-3p以及与AFP、CEA联用时的ROC曲线。

图 19为Boyden模式图。

具体实施方式

现结合具体内容对本发明进行进一步说明，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料和方法

实验仪器

表1 主要实验仪器名称及生产厂家

实验材料

表2 主要实验试剂及耗材名称及生产厂家

细胞系

高转移肝癌细胞系 HCCLM3为本实验室液氮中保存，最初均购于中国科学院上海细胞库。

引物设计合成

引物设计合成由上海吉玛制药技术有限公司合成。引物处理如下：减压离心干燥品，制品干燥于管底，为干粉状。加入100μL DEPC水溶解引物，配成终浓度 10 μmol/L，置于- 20°C 冰箱保存。

表3 hsa-let-7c-3p及相应PCR引物对序列

病例来源

所有实验组对象均来自2016年1月至2016年5月在温州医科大学第二附属医院就诊的确诊原发性肝细胞型肝患者，共计21例；健康对照组来自温州医科大学第二附属医院健康查体中心，共计21例。

血清样本处理

将采集的到的全血标本采用EDTA抗凝法处理后，在4℃下4,000 rpm离心10分钟全血标本得到血清。用500μL去RNA酶处理EP管对血清样本进行分装，分装后置于-80℃冰箱保存。

方法

1. HCCLM3细胞的传代培养

（1）关闭紫外，打开风机，点燃酒精灯；（2）75%酒精擦拭超净工作台、双手以及所用器械、试剂瓶、细胞培养皿；（3）细胞用2mLPBS洗2遍；（4）加入胰酶2~3mL消化1.5min；（5）弃掉胰酶，加入2mL全培终止消化，吹下贴壁的细胞，并吹打20次；（6）根据需要留适量的细胞悬液在新的培养皿，加入完全培养基7~10mL，吹打混匀；（7）放入CO₂培养箱继续培养。

皿法分离突出和细胞体

（1）六孔型 1.0μm 孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浸润有浓度为 10μg/mL I型胶原蛋白的培养皿中，二氧化碳培养箱恒温静置2小时；

（2）接着把孵有 I 型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含I型胶原蛋白溶液的六孔板中，并置于4℃冰箱过夜处理；

（3）肝癌细胞培养好后用无血清培养基进行饥饿过夜处理，用胰酶对贴壁肝癌细胞进行消化分离，待显微镜下观察到细胞收缩变圆后，吸走胰酶，接着用含有 10%胎牛血清的新鲜 DMEM培养基终止消化；

（4） 1500rpm离心10min，去除上清液后用无血清培养基重悬混匀；

（5）然后把细胞转移到孵有I型胶原蛋白的1.0μm 孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃二氧化碳培养箱中静置 24~30小时；

（6）分离细胞突出和细胞体 RNA，先用1×PBS 洗涤，倒立Boyden 培养皿，用移液枪吸去Boyden培养皿上侧的残留液体，接着用浸有Trizol的细胞刮铲来搜刮 Boyden 培养皿底部上侧的细胞突出；

（7）当分离细胞体中的RNA时，平放Boyden培养皿，用移液枪吸去Boyden培养皿里的培养基，然后用浸有Trizol的细胞刮铲来搜刮Boyden培养皿内侧的细胞体。（注意：每个Boyden 培养皿只能用来收集一次细胞突出或细胞体，以避免细胞突出和细胞体中的 RNA互相污染）。

Boyden 细胞池培养法是一种实验技术，这项技术的主要材料是 Boyden小室，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，杯子底层的一张有通透性的 PET 膜，这层膜带有微孔，本实验的孔径为 0.1 µm，恰好只允许肝癌细胞突出延伸通过，便于后续肝癌细胞突出和细胞体的分离（见图3）。

细胞预处理

（1）细胞培养至 70-80%的汇合度后，用移液器吸除去培养皿上的培养基，利用1×PBS 溶液进行冲洗，然后去尽1×PBS 残液；

（2）用含有 50mM Tris-HCL（pH7.4），150mM NaCl，0.1% NP40 的RIPA细胞蛋白裂解液和适量的蛋白酶抑制剂组成的混合溶液来浸润皿底，再用细胞刮刮下；

（3）超声3s，暂停10 s，共3个循环；

（4）冰上放置30 min，每隔 5 min 颠倒振荡数次。20000 g，4 ºC 离心10min；

（5）取上清转入EP 管，置冰上待用；

（6）若是测量对比细胞突出和细胞体中相应蛋白的含量，则用 Boyden 皿法分离细胞突出和细胞体后，再用含细胞裂解液的细胞刮分别刮下收集于 EP 管中保存待用。

细胞蛋白提取以及浓度测定

（1）取出预处理细胞（60 mm 细胞培养皿），吸去上清，用 2 mL 1 ×PBS 溶液洗涤3 次；

（2）加入 200 μL NP-40 蛋白裂解液，置冰上裂解5min，用细胞刮刀提取细胞蛋白质；

（3）14800r 4℃离心30min，吸取上清液并记录上清体积；

（4）取 5 μL上清液，用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白浓度定量，剩余蛋白分装后于-20 °C冰箱中保存备用，避免反复冻融。在提取细胞全蛋白的整个过程中所有使用的物品及试剂都需要预冷，防止蛋白降解。

（5）根据样品的数目，每孔样品配置 200 μL 的A-B混合液（A：B=49：1）；

（6）利用PBS、0.5mg/mL的标准蛋白、BCA工作液配置0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL的标准蛋白浓度梯度及未知蛋白体系，置37℃恒温箱中孵育30min；

（7）在酶标仪中测量562 nm处的吸光度值，根据测量结果记录未知蛋白浓度。

免疫印迹实验（Western blot）

（1）根据 BCA 法蛋白定量的结果等量上样（25～30 μg），进行浓度为7.5–15%的Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，定压70V电泳30min左右至其过分离胶，定压110V电泳70min左右；

（2）电泳结束后小心取出凝胶，同时剪裁与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于无水甲醇中活化2min；

（3）按照湿转方法利用转膜筛孔板制成海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵的“三明治”结构，全程用玻璃棒压平防止气泡产生，冰上300mA恒流转膜70min；

（4）转膜结束后取出PVDF膜，接着浸泡于丽春红染色液中，观察转膜效果；

（5）TBST洗涤PVDF膜，去除去丽春红，加入含 5%脱脂牛奶中室温封闭2h；

（6）封闭结束后，用TBST洗涤PVDF膜上残留封闭液，分别用相应一抗进行孵育，4 °C过夜；

（7）回收一抗并用TBST溶液洗涤 PVDF膜5次，每次5分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔的抗体（1：2000稀释），室温孵育1小时；

（8）PVDF膜用TBST彻底清洗3次，每次10min，加入发光底物（ClarityTM WesternECL Substrate 试剂盒），用凝胶成像仪的化学发光系统进行曝光，如果条带不够清晰，可以适当延长曝光时间。

免疫荧光

（1）细胞生长至80%-90%进行传代，取细胞悬液20μl，再加入500μl全陪吹打混匀，加入放有爬片的24孔板；（每孔共计细胞悬液520μl）；

（2）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（3）用4%多聚甲醛室温固定20min（去酶PBS配置）；

（4）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（5）0.5% Triton X-100每孔500μl通透15 min；室温500μl

（6）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（7）加入免疫染色封闭液（0.5%BSA封闭液），室温摇床封闭90min，200μl每孔；

（8）封闭液稀释一抗（1:100）；

（9）标记载玻片C（对照组）、T（实验组）；

（10）免疫组化笔在载玻片上画圈后，加上相应稀释的一抗（对照组200μl稀释的山羊抗兔IgG，实验组200μl稀释的兔源Tubulin 一抗）；

（11）放入湿盒，4℃孵育过夜；

（12）过夜后，回收一抗；

（13）用PBST和PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min，避免干燥；

（14）避光，二抗稀释液（1:100）稀释二抗，每个爬片加250μl稀释过的二抗，避光室温孵育90min；

（15）弃去二抗，用PBST和PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（16）将爬片转入新孔，每孔应加10μl DAPI,正面朝下，扣上爬片，孵育5min;

（17）PBS清洗3次，干净玻片上做标记，每片滴加5μl抗荧光淬灭剂，盖上爬片，指甲油封片，荧光显微镜观察。

细胞胞体与突出中 RNA 提取

（1）通过 Boyden 培养皿法分离的细胞突出和细胞体分别提取 RNA，提分离的细胞突出 RNA 时，倒立 Boyden 培养皿，用移液枪吸去 Boyden 培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有 Trizol 的细胞刮铲来搜刮皿上侧的细胞突出；

（2）当分离细胞体中的 RNA 时，平放 Boyden 培养皿，用移液枪吸去 Boyden 培养皿里的培养基，然后用浸有 Trizol 的细胞刮铲来搜刮皿内侧的细胞体；

（3）将上述第 1 步搜刮的 Boyden 培养皿上侧细胞突出和内侧细胞体的 mRNA分别转移入无 RNase EP 管，加入氯仿(Trizol：氯仿=5：1），迅速剧烈摇匀 15s 至其呈乳状，然后室温静置 3min；

（4）将 EP 管放到高速冷冻离心机中 12,000×g，4℃离心 15min；

（5）吸上层液于另一 1.5 ml 无 RNase EP 管，加入异丙醇（V：V=1：1) ，混匀，使得 RNA 充分沉淀，-20℃放置 1~2 小时；

（6）继续 12000×g，4℃离心 10min，移去上清液，加入 750μl 75%乙醇洗涤管壁和沉淀；

（7）12000g，4℃离心 10min；

（8）去除上清液，再瞬离，去尽上清液，将 EP 管倒置于纸巾并静置 1~2 min；

（9）加入 15~20μl DEPC 水来溶解提取的 RNA；在 Nanodrop 2000 多功能检测仪上测浓度检测所提 RNA 质量，并于-80℃冰箱中进行保存。

染色

（2）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（3）用4%多聚甲醛室温固定20min（去酶PBS配置）；

（4）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（5）500μl去酶PBS溶解稀释5-12.5μl RNase加入实验组，500μl去酶PBS加入对照组，30min；

（6）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（7）0.5% Triton X-100每孔500μl通透10 min；

（8）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（9）EtBr染液染色处理15min（去酶PBS溶解）；

（10）用PBST和PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（11）细胞核DAPI染色，室温5min；

（12）用去酶PBS清洗三次，置于摇床上，每次5min；

（13）载玻片上滴加4μl抗荧光淬灭剂；

（14）指甲油封片；

（15）共聚焦显微镜观察染色结果，4℃避光保存。

分析

从细胞突出和细胞体分别提取RNA后，加热打开RNA的二级结构后用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。向得到的mRNA中加入适量打断试剂高温条件下使其片段化，再以片段后的mRNA为模板，合成cDNA，经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加入碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行质量和产量检测，文库质控合格后使用lllumina HiSeq^TM 2000测序（见图13、14）。

血清miRNA的提取

血清miRNA的提取采用QIAGEN®的miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒，具体步骤如下：

（1）预处理血清样本，将血清置于冰上溶解，待溶解后在16,000×g和4℃下离心解冻的血清样品10分钟以去除冷沉淀。

（2）用移液枪吸取200μL的血清至1.5mL的EP管中，加入1mL的QIAzol LysisReagent，通过震荡或吹吸混合。

（3）将含有裂解物的试管在室温（15-25℃）下静置5分钟。

（4）加入200μL氯仿至含有裂解物的EP管中，盖上盖子，震荡或剧烈摇动15秒使其充分混匀。

（5）将含有裂解物的EP管在室温（15-25℃）下静置2-3分钟。

（6）将裂解物在4℃以12,000×g离心15分钟。离心后，样品分为三层，上层为无色，是含有RNA的水相，中间层白色界面以及下层红色有机相。

（7）将上层水相转移至新的1.5mLEP管，应避免将中间层以及下层转移。加入900μL无水乙醇，并通过上下吹打数次彻底混合。

（8）移取700μl样品，包括可能形成的任何沉淀物，放入含RNeasy MinElute离心柱的2 ml收集管中，轻轻盖上盖子，在室温（15-25℃）下以>8,000×g离心15s，将洗脱过程流下的下液弃去。

（9）重复以上步骤，将剩余的样品已同样的方式用RNeasy MinElute离心柱洗脱。

（10）向RNeasy MinElute离心柱中加入700μL Buffer RWT，轻轻关闭盖子，在>8,000×g离心15 s，以洗柱，将洗脱过程流下的下液弃去。

（11）向RNeasy MinElute离心柱中加入500μL Buffer RPE，轻轻关闭盖子，在>8,000×g离心15 s，以洗柱, 将洗脱过程流下的下液弃去。

（12）向RNeasy MinElute离心柱中加500μL 80％乙醇，轻轻关闭盖子并以>8000×g（>10,000rpm）离心2分钟以洗涤离心柱膜。离心完成后取出离心柱丢弃收集管与流下的下液。

（13）将RNeasy MinElute离心柱放入一个新的2ml收集管中，打开离心柱的盖子，定向盖子，使得它们指向与转子的旋转相反的方向，全速离心5分钟以干燥离心柱膜。取出离心柱丢弃收集管与流出的水。

（14）将RNeasy MinElute离心柱置于新的1.5 ml收集管中，将14μL 去RNA酶水直接加入到离心柱膜的中心，轻轻关闭盖子，全速离心1分钟以洗脱RNA。最终得到样本的RNA，并进行RNA浓度测定与质量检测。

逆转录引物的配置以及miRNA逆转录

miRNA逆转录采用GenePharma®的Hairpin-it^TM miRNAs RT-PCR QuantitationKit 试剂盒，具体步骤如下：

（1）在进行逆转录前，需先配置实验目的基因miRNA的逆转录引物与内参基因逆转录引物的混合RT引物，试剂盒中提供的逆转录引物是10μM的贮存液,以U6 snRNA为内参做相对定量分析，将12μL miRNA逆转录引物和12μL U6逆转录引物混合, 用96μL Rnase freeH2O一起稀释10倍成1μM逆转录引物工作液。

（2）逆转录体系如下：

将反应体系的各组分置于冰上，加入至200μL EP管中，在逆转录反应之前将除逆转录酶外的各种试剂用移液器吸打几次混匀。

（3）将逆转录体系置于PCR扩增仪中，标准的逆转录反应程序: 25 ℃ 30 分钟，42℃30 分钟，85 ℃5 分钟，4 ℃保存。

（4）待逆转录反应完成后，将得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

实时荧光定量PCR分析

实时荧光定量PCR分析采用GenePharma®的Hairpin-it^TM miRNAs RT-PCRQuantitation Kit 试剂盒，具体步骤如下：

（1）实时荧光定量PCR反应体系如下：

将反应将反应体系的各组分置于冰上，加入至八连管中，为确保所有的试剂都在管底或板孔底部进行短暂的离心。

（2）miRNAs 实时定量PCR反应程序如下：

预变性 95℃ 3min

变性 95℃ 12s

退火 62℃ 40s

延伸 62℃ 40s

永久保存 4℃ 0 40个循坏

（3）采用Bio-Rad CFX96 Manager软件对结果进行分析。

统计学分析

（1）所有实验结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示，所有分类变量进行数值化赋值，采用 SPSS 17.0统计分析软件进行统计分析。各组miRNA的相对表达量呈偏态分布，方差不齐，因此以△Ct来衡量，进行2-△△Ct转换，多组间比较采用单因素分析方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用Studengt’s t检验。p< 0.05为差异显著，p< 0.01为差异极显著。p< 0.05具有统计学意义。

（2）利用多元线性逐步回归的统计学方法找出影响实验指标的独立因素，miRNA与临床指标或者是临床特征之间的联系在排除了相关因素干扰后选用Pearson相关分析计量资料，spearman相关分析计数资料，并绘制受试者工作曲线(Received OperatingCharacteristic Curve，ROC)，采用二元logistics回归构建联合模型，并结合相关指标如AFP、CEA等联用制作ROC曲线。

结果

检验肝癌细胞突出中的 RNA

癌细胞在形成其转移侵袭能力之前会形成细胞突出，位于细胞突出里的 RNA常与转移侵袭的过程有关。为了能研究位于肝癌细胞突出部位的核苷酸，我们首先选取了肝癌高转移细胞株 HCCLM3 来做免疫荧光实验，其中细胞质部分用α-tubulin 来染色，细胞核部分用 DAPI 来染色，结果如图 6（a）、（b）和（c）所示。

从上述高转移肝癌细胞株 HCCLM3 的免疫荧光实验结果图可以看到，α-tubulin作为细胞骨架和细胞纤维的重要组成部分，广泛分布于肝癌细胞质当中，且能够较好地通过免疫荧光展现肝癌细胞的形态。从图 6（a）和（c）观察到的细胞形态都有较为明显的细胞突出结构。此外，我们还通过加入 RNase 来设置对比实验来进行 HCCLM3 肝癌细胞的EtBr 染色实验，实验结果如图 7（a）和（b）所示。EtBr 对肝癌细胞的细胞质和细胞核都有较好的染色结果，包括在细胞体和细胞突出部位的核糖核酸和脱氧核糖核酸。图 7（a）是未加 RNase 处理组，在EtBr 染色后展示了较完整的细胞形态；7（b）是加入了 RNase 后的对照组，可以观察到细胞质当中的 EtBr 染色信号明显减弱，特别是细胞突出部位，表明细胞突出部位含有一定量的从细胞核运输过来的定位 RNA。

分离肝癌细胞突出中的RNA

高转移癌细胞在转移过程中多具有细胞突起结构，细胞突出部位往往小于1μm，而细胞体部分的平均粒径大小为 10~20μm，所以我们使用具有 1.0μm 孔径的悬挂式 Boyden细胞培养皿来分离细胞突出和细胞体。该 Boyden细胞培养皿包括两部分，上侧的细胞培养腔室和下侧的细胞培养腔室，中间由1.0μm 孔径 PET 膜分隔，使得在上侧细胞培养腔室上培养的细胞仅有长出的细胞突出部分能够通过培养皿底层的 PET 膜孔径，从而便于后续的分离操作。

在Boyden 细胞培养皿上侧传代培养细胞之前，先将 1.0μm 孔径的 Boyden 悬挂式细胞培养皿放入到浸润有浓度为 10μg/mL I 型胶原蛋白的培养皿中 37℃恒温静置 2小时，再过夜处理，使得培养皿 PET 膜的底层孵上胶原蛋白。细胞培养皿底层下侧孵育的胶原蛋白可以诱导肝癌细胞突出迁移到 Boyden 细胞培养皿下侧培养腔室。我们用细胞质α-tubulin 免疫荧光染色和细胞核 DAPI 染色的方法来验证是细胞突出部位转移迁徙通过了 PET 膜上的小孔进入到 Boyden 细胞培养皿下侧细胞培养腔室而不是整个细胞的转移。如图 8（a）所示，Boyden 细胞培养皿上侧细胞体部分含有细胞质 α-tubulin，而同样培养条件下的细胞培养皿另一侧被棉签抹去上侧细胞体后，在培养皿下侧仍然观察到了 α-tubulin 的染色（如图 8（b）。但是相同培养条件下培养皿的细胞体被抹去后则在 PET 膜的下侧看不到有细胞核DAPI 染色的情况出现，如图 8（c）和 8（d）所示，表明了此 Boyden细胞培养皿能够较为有效地分离细胞体和细胞突出。

此外，我们也通过 Western blot 实验来进一步证实了该 Boyden 细胞培养皿法分离细胞突出和细胞体的有效性。组蛋白是由 histone H2A，H2B，H3 和 H4 各两个分子组成的八聚体和与该八聚体相结合的 DNA 构成了染色质的基本结构核小体(necliosome)。组蛋白的存在确保了基因组 DNA 可以被相对致密而有序地堆放在细胞核中。在对分离的细胞突出和细胞体分别分别做 Histone H3 免疫印迹实验，发现只有在Boyden 细胞培养皿上侧的细胞体部分含有组蛋白 H3（如图 8（e）所示），再次佐证了细胞体在这个实验过程中没有发生从培养皿上侧到下侧的转移。

RNA-Seq测序分析

对HCCLM3的胞体（HB）和突出（HP）进行RNA-Seq测序，，通过与已知的小RNA数据库比对，鉴定测序得到小RNA，。在对胞体和突出的测序结果中我们分别获得19,443,590和22,807,548对序列（见表1）。去除包含测序接头、重复序列、不确定的和其他低质量序列后获得17,630,686和21,772,519对序列。数据过滤后，所得序列和已知的小RNA数据库进行比对，包括miRBase、Rfam、siRNA等（表2），分别获得和16,836,644和20,907,542对序列，其所占比例均较高。

表1 胞体（HB）和突出（HP）测序数据

表2 基因组比对统计

根据HCCLM3细胞胞体与突出的核苷酸序列比对结果（图4、5），对上调和下调miRNAs进行了GO功能富集分析，结果如图12。结果初步提示，这些差异的miRNAs功能基本围绕在细胞信号传导，细胞迁移、细胞粘附和肿瘤相关等功能范围。

实验组与健康对照组一般临床资料的比较

实验组HCC患者与健康对照组间年龄（p>0.05）、性别（p>0.05）间无显著性差异，而作为HCC诊断标志物的AFP（p>0.05）、CEA（p>0.05）等指标亦无显著性差异。（见表4）

实验组HCC患者均经病理学确定，其临床分期以TMN分期为标准，其TMN分期以及其他指标如下。（见表4）

表4 HCC患者与健康对照组的一搬临床资料比较

各组let-7c-3p表达水平的比较

通过RT-qPCR技术对let-7c-3p的表达水平进行测行，以U6snRNA作为内参基因，计算出相对表达值。验证得出let-7c-3p在HCC患者血清中的表达量显著高于健康对照组。（见图16、17）

血清let-7c-3p对于肝细胞性肝癌患者的诊断价值

在临床工作中，患者的实际情况远远比理论上复杂，因此，亟待一种检测手段。本研究通过对HCC组与健康对照组的比较，绘制ROC曲线。同时收集AFP与CEA等应用于诊断HCC的传统肿瘤标志物，建立Logistics回归模型后进行ROC曲线的拟合。纵坐标为敏感性，而横坐标为假阳性率(1-特异性)，分别绘制let-7c-3p的ROC曲线，以及let-7c-3p与CEA联用、let-7c-3p与AFP联用、let-7c-3p与AFP和CEA联用的ROC曲线。并根据约登指数找出let-7c-3p达到灵敏度及特异性最高的截断点，根据建立的logistics回归模型计算血清let-7c-3p诊断HCC时以及与AFP、CEA联用时的曲线下面积AUC。

在经过统计分析后，let-7c-3p的诊断价值再经过与AFP、CEA联用后得到了明显的提高。(见图18，表5 )

表5 miRNA与传统肿瘤标志物AFP、CEA联用的ROC曲线下面积及灵敏度、特异度

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.特异性引物在制备用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物检测试剂盒上的应用，其特征在于，所述的特异性生物标志物为miRNA hsa-let-7c-3p。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括有检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂包含一对特异性引物，引物序列为：

F Primer: GGCGAGTCTGTACAACCTTCTAG；

R Primer: TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT。