CN116162708A - lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用 - Google Patents

lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种lncRNALO95C105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，通过扩增lncRNALOC105376270上下游引物，检测lncRNA LOC105376270基因的表达水平来诊断是否患原发性肝癌，以健康人为对照，若lncRNALOC105376270表达水平显著上调，则表明为原发性肝癌患者。本发明在临床上实验证明个体血清lncRNALOC105376270的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性，降低lncRNALOC105376270的表达能够抑制原发性肝癌的活性和迁移能力，故本发明将为临床早期诊断和/或治疗原发性肝癌提供一种新的理论依据。

Description

lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的 应用
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内的第五种最常见的恶性肿瘤。尽管这些年在HCC的诊疗上有很大的进步，但由于临床上HCC经常会有复发和转移，HCC患者的5年生存率仍然相当低。HCC的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下(B型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉毒素B1的摄入量或酒精滥用等)发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。
肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期调控、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因。
近年来在HCC的基础与临床研究方面虽然取得了一些进展，但始终未能阐明HCC转移复发的机制。因此，寻找有效的转移复发抑制途径，已成为进一步提高生存率的关键。研究提示，在人类肿瘤中，Long non coding RNA(LncRNA)既可以作为癌基因促进肿瘤的发生和发展，也可以发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤。寻找肿瘤相关的LncRNA，并探讨其具体作用的机制或其成为新的分子诊断标志物，已成为肿瘤相关研究中的新方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的引物，所述引物包括扩增lncRNALOC105376270的上下游引物，所述扩增lncRNA LOC105376270的上下游引物的序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，包括上述引物。
优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
优选的，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为健康人的血清。
本发明还提供了一种lncRNA LOC105376270抑制剂在制备治疗原发性肝癌药物中的应用。
优选的，所述lncRNALOC105376270抑制剂包括降低lncRNALOC105376270表达的调节剂和/或降解lncRNALOC105376270产物的蛋白酶。
优选的，所述降低lncRNA LOC105376270表达的调节剂包括敲除或沉默lncRNALOC105376270的试剂。
优选的，所述敲除或沉默lncRNALOC105376270的试剂包括siRNA、shRNA或miRNA。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，通过扩增lncRNA LOC105376270上下游引物，检测lncRNA LOC105376270基因的表达水平来诊断是否患原发性肝癌，以健康人为对照，若lncRNALOC105376270表达水平显著上调，则表明为原发性肝癌患者。本发明在临床上实验证明个体血清lncRNALOC105376270的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性，而且降低lncRNALOC105376270的表达能够抑制原发性肝癌的活性和迁移能力，故本发明将为临床早期诊断和/或治疗原发性肝癌提供一种新的理论依据。
附图说明
图1HCCLM3细胞中lncRNALOC105376270高表达的RNA-seq的结果；
图2为HCCLM3细胞中lncRNALOC105376270高表达的Q-PCR结果，其中1为正常细胞株Lo2中lncRNALOC105376270表达水平；2为肝癌细胞株HCCLM3中lncRNA LOC105376270表达水平；3为肝癌细胞株MHCC97H中lncRNA LOC105376270表达水平；
图3为HCCLM3细胞中lncRNALOC105376270高表达琼脂糖电泳结果，其中，1为DNAmaker；2为正常细胞株Lo2中lncRNALOC105376270 PCR扩增后琼脂糖电泳结果；3为肝癌细胞株HCCLM3中lncRNALOC105376270 PCR扩增后琼脂糖电泳结果；4为肝癌细胞株MHCC97H中lncRNALOC105376270 PCR扩增后琼脂糖电泳结果；
图4为荧光原位杂交实验结果，其中，从上到下依次为肝癌细胞株HCCLM3、肝癌细胞株MHCC97H和正常细胞株Lo2中lncRNALOC105376270的FISH结果；
图5为不同处理组的血清中lncRNALOC105376270表达情况对比结果；
图6为慢病毒构建包装及基因敲低结果；
图7为敲低lncRNALOC105376270体外转移实验。
具体实施方式
本发明提供了一种lncRNA LOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述lncRNALOC105376270的NCBI登录号为XR_007080000.1，GeneID为105376270。本发明将筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的LncRNA并对临床价值进行评估，结果以健康人为对照，用ΔCt法分析，采用GraphpadPrism6.0软件进行数据统计和分析，数据以Mean±SD表示；两组独立样本采用t检验，两组以上采用one-wayANOVA检验，以P<0.05差异判断结果阳性。
本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的引物，所述引物包括扩增lncRNALOC105376270的上下游引物，所述扩增lncRNALOC105376270的上下游引物的序列，其中上游引物为GAACATCATCCCTGCCTCTACT(SEQ ID No.1)，下游引物为CCTGCTTCACCACCTTCTTG(SEQ ID No.2)。
本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，包括上述引物。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。所述试剂盒优选的还包括阴性对照，所述阴性对照为健康人的血清。
本发明还提供了一种lncRNA LOC105376270抑制剂在制备治疗原发性肝癌药物中的应用。
在本发明中，所述lncRNA LOC105376270抑制剂优选的包括降低lncRNALOC105376270表达的调节剂和/或降解lncRNALOC105376270产物的蛋白酶。所述降低lncRNA LOC105376270表达的调节剂优选的包括敲除或沉默lncRNA LOC105376270的试剂。所述敲除或沉默lncRNALOC105376270的试剂优选的包括siRNA、shRNA或miRNA。在本发明中，所述siRNA是指短双链RNA，其能够通过切割某些mRNA来诱导RNA干扰，siRNA包括具有与靶基因的mRNA同源的序列的正义RNA链和具有与其互补的序列的反义RNA链，siRNA可以抑制靶基因的表达，可用于基因敲减、基因治疗。在本发明中，所述shRNA(短发夹RNA)是单链RNA，其包括通过氢键形成双链部分的茎部分和环部分，它被诸如Dicer的蛋白加工转化成siRNA，并执行与siRNA相同的功能。在本发明中，miRNA是指21至23个非编码RNA，其在转录后通过促进靶RNA的降解或通过抑制其翻译来调节基因表达。在本发明中，所述shRNA质粒中用于敲低的功能序列为如SEQ ID No.3～5所示任意一种，其中，具体的核苷酸序列为TTCCGCCCCGTAGGACGGAAC(SEQ ID No.3)，GACCGGGGAGTTCA AGGTCGA(SEQ ID No.4)，TCCTGTAACCCAGGAGTGAGG(SEQ ID No.5)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，统计学分析采用Graphpad Prism6.0软件进行数据统计和分析，数据以Mean±SD表示；两组独立样本采用t检验，两组以上采用one-way ANOVA检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1
1.实验材料
1.1细胞系
人高转移性肝癌细胞系(HCCLM3)，中国科学院上海细胞库提供；肝组织正常细胞系(LO2)、肝癌细胞株MHCC97H。
1.2质粒
本实验所用到的质粒上海吉凯基因公司购入。
1.3实验试剂
Figure BDA0004024575130000041
/>
Figure BDA0004024575130000051
Figure BDA0004024575130000061
/>
1.3主要溶液配制
1.3.1细胞培养相关试剂：
1)细胞培养液的配置：将FBS加入到DMEM培养基中使其FBS含量在百分之十，将其均匀混合，置于4℃冰箱中保存。
2)冻存液配置：FBS的比重为百分之五十，DMEM的比重为百分之四十DMSO的比重为百分之四十，将三者均匀混合在一起。
1.3.2细菌培养相关试剂：
LB培养基配置：液体培养基，胰蛋白胨(tryptone)10g、氯化钠(NaCl)10g、酵母提取物(yeast extract)5g，三者混合，此为液体培养基的配方。固体培养基需另加琼脂糖粉15～20g，加入ddH2O 1000mL,混匀定容，高压121℃灭菌，30min，保存至4℃冰箱。
1.3.3FISH实验相关试剂配置：
1)RNase-free 4％多聚甲醛配置：4g多聚甲醛粉末与50mL RNase-free 0.1M PBS溶液，两者混合，加入RNase-free 50mL离心管中。用水浴锅恒温加热(55℃)直至溶解，避光条件下放入4℃冰箱保存备用。
2)RNase-free 1×PBS缓冲液：取20×PBS缓冲液(碧云天生物公司购入)50mL，加ddH2O至1000mL，装入带盖玻璃瓶中。通风橱中取1mL DEPC原液加入配置好的PBS缓冲液中，溶解过夜，高压蒸汽灭菌后置于4℃冰箱中保存。
3)通透液配置：含0.5％TritonX-100的PBS，混匀，置于4℃冰箱中保存。
1.3.4Western Blot实验相关试剂配置：
1)10％SDS-PAGE分离胶溶液配制，具体组成见表1：
表1
Figure BDA0004024575130000062
2)5％SDS-PAGE浓缩胶溶液配制，具体组成见表2：
Figure BDA0004024575130000063
Figure BDA0004024575130000071
4)转膜缓冲液(现配现用)，具体组成见表3：
表3
Figure BDA0004024575130000072
5)TBST缓冲液配置，具体组成见表4：
表4
Figure BDA0004024575130000073
2.实验方法
2.1细胞的培养
1)细胞密度达到约80％～90％之后，需要将细胞进行胰酶消化液消化传代。
2)紫外照射细胞房约半小时，同时将需要物品如口罩，帽子，手套等放入传递窗中进行紫外照射，照射之后，所有物品都经由传递窗传递。
3)弃去培养基，沿培养皿壁缓慢加入PBS缓冲液2mL，摇晃均匀后吸弃。此过程重复两次。
4)10cm培养皿加入2mL胰酶细胞消化液，轻摇培养皿，使胰酶均匀覆盖。消化时间依细胞种类，细胞状态而定。时间到后将胰酶弃掉。
5)迅速加入已配置好的细胞培养液2mL，使用移液枪吹打沿培养皿一侧，从培养皿底部吹打细胞，反复吹打使细胞呈单个分布，均匀分散在细胞悬液中。
6)根据个人需求，将细胞悬液，留取一定量到新的培养皿中。加入预先配置好的细胞培养基，用十字法将细胞混匀。根据培养皿大小，6cm培养皿加入3～4mL，10cm培养皿加入6～8mL，6孔板一孔加入2～3mL，12孔板加入1mL，24孔板加入0.5～1mL，96孔板加入100μL。
7)轻摇细胞，使细胞均匀分散于皿底。置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。时刻关注它的生长状态，及时更换新的完全培养基。
2.2RNA染色
高转移性肝癌细胞HCCLM3进行传代铺板，根据需求将定量的细胞悬液滴在已经备好的24孔板中。24孔板里要铺好细胞爬片。细胞在无菌的细胞爬片上培养过夜，观察细胞密度到40％～60％左右，开始进行处理。
1)配置4％的去酶多聚甲醛溶液，在室温条件下，然后用其对HCCLM3肝癌细胞做固定处理30min。
2)使用去酶的1X PBS清洗3次HCCLM3细胞，每次大约清洗5min，放于摇床上方。
3)用100μL PBS溶解稀释3μL RNase加入到对照组组载玻片上，实验组加100PBS，室温处理30min。
4)用去酶的1X PBS三次，每次5min清洗细胞。
5)Triton X-100用去酶PBS稀释，配制成0.5％TritonX-100通透溶液，通透处理HCCLM3约10min。
6)去酶的1X PBS三次清洗HCCLM3，5min每次。
7)EtBr溶液用去酶1X PBS溶液溶解，最终终浓度至1μM，并用其来对两组细胞进行染色处理20min。
8)使用去酶1X PBS清洗HCCLM3细胞三次，5min每次。
9)在室温条件下DAPI染细胞核，HCCLM3的细胞核大约需染色5min。
10)去酶1X PBS清洗肝癌细胞三次，清洗5min每次。
11)用封片剂或者可用指甲油代替，封片处理，等待其风干后上机观察。
12)用倒置荧光显微镜观察染色结果，含有样本的载玻片可以在4℃避光条件下保存。
2.3RNA的提取
1)分离细胞体中的RNA时，平放Boyden培养皿，用移液枪吸去Boyden培养皿里的培养基，然后用浸有Trizol的细胞刮铲来搜刮皿内侧的细胞体。
2)将搜刮的Boyden培养皿外侧细胞突出和内侧细胞体的含有mRNA的Trizol，分别转移入去酶EP管，加入氯仿(Trizol：氯仿＝5：1)，迅速剧烈摇匀15s至其呈白色乳状，然后室温静置2～3min。
3)提前将离心机预冷，将EP管放入离心机，12000g，4℃离心15min。
4)EP管中液体分层，吸水相上层液于新1.5mL无RNase EP管，加入异丙醇(V：V＝1：1)，混匀，-20℃放置1～2小时使得RNA充分沉淀。
5)在提前预冷的离心机中，12000g，4℃离心10min，弃去上清液，加入750μL75％乙醇洗涤。
6)8000g，4℃离心10min。
7)弃去上清液，瞬间离心，将EP管倒置于滤纸，静置1～2min。
8)加入15～20μL DEPC水来溶解提取的RNA。
9)在Nanodrop 2000多功能检测仪上测浓度检测所提RNA质量，并于-80℃冰箱中进行保存。
(注意：RNA提取过程中要注意使用RNA专用枪头(无RNase)，穿干净实验服，佩戴口罩和手套。)
2.4逆转录
1)测RNA浓度，调RNA浓度于2000ng/μL以下，测三次取平均值去除基因组DNA；
2)提取的RNA中可能含有基因组DNA，这会影响后续实验结果，因此需去除基因组DNA。以下为反应体系，见表5：
表5
Figure BDA0004024575130000091
/>
42℃2min，4℃保存。
3)逆转录反应体系
Figure BDA0004024575130000092
37℃30min，85℃10s，4℃保存。
4)PCR扩增
反应体系(25μL)，见表6。
表6
Figure BDA0004024575130000093
其中表6中的引物为lncRNA LOC105376270引物序列，上游引物序列为AAGCACTCCCTCGTTCACGT(SEQ ID No.1)；下游引物序列为CAAACTTCGCATCTCCCTCT(SEQ IDNo.2)。
反应条件，见表7。
表7
Figure BDA0004024575130000101
2.5荧光定量PCR
反应体系，见表8。
表8
Figure BDA0004024575130000102
其中表8中的引物为lncRNA LOC105376270引物序列，上游引物序列为AAGCACTCCCTCGTTCACGT(SEQ ID No.1)；下游引物序列为CAAACTTCGCATCTCCCTCT(SEQ IDNo.2)。
反应条件，见表9。
表9
Figure BDA0004024575130000103
RNA-seq结果见图1，Q-PCR结果见图2。
由图1结果表明，肝癌HCCLM3细胞中lncRNALOC105376270高表达。
由图2结果表明，与正常细胞株Lo2相比，肝癌HCCLM3细胞和MHCC97H细胞中lncRNALOC105376270高表达。
2.6细胞转染
1)铺板：将细胞吹打混匀后，计数细胞密度，按照1×105个细胞/孔将细胞接种到24孔板中，用完全培养基补齐到500μL，将24孔板侧面轻轻拍打，以保证细胞尽量铺匀，然后放入恒温培养箱中培养24h。
2)观察细胞状态和密度是否合适，大约密度为70％～80％，此时转染效果最佳。准备质粒、转染试剂lipofectamine3000、若干无菌EP管、无血清培养基及其他养细胞常规试剂耗材。
3)以转染1孔为例。取2支EP管，一支标记为lipofectamine3000管，加入50μLopti-MEM培养基，再加入1μL的lipofectamine3000(用量可根据实际情况进行调节)，混匀。另外1支EP管每管加入50μL的opti-MEM培养基，加入mimics
1.25μL(用量可调)，混匀。瞬时转染无P3000。
4)将分别稀释后的液体均匀混合后，室温静置10～15min。
5)24孔板中的细胞换液：弃去培养基，用PBS轻轻洗涤细胞2次，加入无血清培养基洗涤1次，再加入200μL完全培养基。
6)孵育时间到了之后，每孔中加入对应的100μL转染混合液，记住加入时要旋转缓慢加入，并标记好组别。轻轻摇晃培养板，混匀转染液。
7)将转染后的细胞放入37°细胞培养箱孵育，1～2天内RNA表达，2-3天内蛋白质表达。
2.7细胞总蛋白的提取
1)配置细胞蛋白裂解液，即含1％的蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液。2)
将细胞从培养箱中拿出，弃上清，用PBS缓冲液清洗细胞2次。
3)6孔板的培养皿中每孔需要加入100μL的蛋白裂解液，摇晃培养皿，使裂解液接触所有细胞，冰上放置5min。
4)用细胞刮刮下所有细胞碎片，收集裂解产物，转移至EP管中。
5)4℃，13800rpm，离心30min。
6)收集上清液体到新的EP管中，即为蛋白样品。-80℃保存。
2.7.1BCA法测定蛋白浓度
1)根据所需用量，将BCA试剂盒中A液与B液按照50：1的比例混合，即为BCA工作液，待用。
2)配制梯度标准品：使用浓度为0.5mg/mL的蛋白标准品按0，0.5，1，2，4，6，8，10μL加入到96孔板的标准品孔中，再加入标准品稀释液补齐到10μL。
3)96孔板中加入待测样品2μL，记录位置信息。
4)每个样品孔和标准孔中加入100μL的BCA工作液，37℃中孵育30min。
5)使用酶标仪检测562nm处的吸收峰，用系列标准品的浓度和吸光度制作标准曲线，根据曲线计算出样品浓度。
2.7.2蛋白样品处理
1)根据蛋白浓度，将所有样品都用RIPA稀释到相同的浓度，通常稀释到2mg/mL。
2)将样品分别与5×loading buffer以4：1的体积比混合，在加热器上加热100℃5min。冷却后放入-20℃保存，准备电泳分离。
2.8蛋白电泳和免疫印迹
2.8.1聚丙烯酰胺凝胶的配制：
1)清洗1.5mm厚的配胶板，晾干，固定在配胶架上。
2)一块1.5mm厚的胶需要配制大约8mL的分离胶和3mL的浓缩胶。分离胶配好后加入胶板中，缓缓加入1mL超纯水进行液封。
3)待胶与水出现明显的分界线时，倒去上层的水，并用滤纸吸干水分。
4)配制浓缩胶，加满剩下的空间，插入样品梳，注意不要出现气泡。
5)待浓缩胶凝固后连同胶板一起取下，4℃冰箱中短期储存。
2.8.2SDS-PAGE电泳
1)将胶连同胶板固定在电泳夹上，放入电泳槽中，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液，拔下样品梳。
2)将准备好的蛋白样品和蛋白marker按照顺序上样，尽量使用中间的孔，多余的孔用1×loading buffer补齐。保证所有孔中的体积相同。
3)接通电源，设置程序：70V，30min；120V，70min电泳。到溴酚蓝距离板底大约1cm左右停止电泳，拆下胶板。
2.8.3转膜
1)准备工作：①根据胶的大小准备6张中速滤纸，1张PVDF膜。②现配转膜液1L，PVDF膜预先在甲醇中活化1～2min，与滤纸一起浸泡在转膜液中待用。③准备托盘，加入转膜液，海绵垫，转膜夹。转膜夹黑色面朝下，铺好浸泡在转膜液中。
2)铺胶：①打开转膜夹，铺上海绵垫，再铺上1层滤纸。②将胶板拆开，剥下分离胶并置于滤纸上，调整位置对其滤纸，避免气泡。③将PVDF膜铺在胶上覆盖整块胶，记录方向和正反，再盖上1层滤纸，海绵垫，注意操作过程一定避免气泡产生，合拢转膜夹。
3)将转膜夹装在转膜槽上，注意核对红黑两面，转膜槽中加满转膜液，加入冰袋。
4)将转膜槽置于冰内，接通电源，110V转移90min，转膜时间根据蛋白分子量大小决定。
5)转膜结束后将膜浸入丽春红染色液中染色5min，再放入TBST中清洗干净，可看到蛋白条带，准备切割条带。
2.8.4蛋白封闭
1)切割转膜后的蛋白条带，将目的蛋白和内参进行标记，放在TBST内待用。
2)配制5％的脱脂牛奶：用40mL的TBST加2g的脱脂奶粉配制。
3)将条带放入脱脂牛奶中，慢慢摇晃，室温2h或者4℃摇晃过夜。
2.6.5抗体孵育
1)一抗配制：根据说明书推荐的稀释比例，用一抗稀释液配制抗体稀释液，4℃保存。一抗的抗体稀释后可以存储数月或用至失效。
2)孵育一抗：将相应的条带放入一抗的抗体稀释液中，4℃中缓慢摇晃过夜。
3)二抗配制：根据说明书推荐的稀释比例，用TBST配制与一抗对应的二抗。二抗只可短期使用，4℃保存可用1周左右。
4)孵育二抗：将条带放入TBST中摇晃5min×3次。用滤纸吸干后放入对应的二抗稀释液中，室温摇晃`1h。
5)洗涤条带：孵育完二抗的条带放入TBST中摇晃15min×4次。准备曝光显色。
2.8.5显色
1)准备一张保鲜膜，滤纸，暗盒和ECL曝光液。
2)根据条带数量，配制一定量的显影液，将ECL曝光液的A液和B液按照1：1的比例混合与EP管内，全程避光操作。
3)将条带摆放到保鲜膜上，用滤纸吸干水分。用ECL曝光混合液滴加到条带上，覆盖所有条带，孵育1min。
4)用滤纸吸干所有水分，保鲜膜盖上条带，夹到暗盒内，到凝胶成像仪上曝光。
5)选择化学发光模式，曝光时间由1秒到300秒累积曝光，每3秒拍摄一张照片。将所有照片保存，后期处理分析。
由图3结果表明，与正常细胞Lo2相比，肝癌HCCLM3细胞和肝癌MHCC97H细胞中lncRNALOC105376270高表达。
2.9RNA荧光原位杂交实验
2.9.1试剂准备
荧光探针由广州锐博生物有限公司合成，并购买配套试剂盒。所有相关试剂和EP管、枪头等耗材需去RNA酶处理，自备4％多聚甲醛(Rnase Free)，通透液(含0.5％Triton-100的PBS，Rnase Free)，1×PBS(Rnase Free)，4×SSC(Rnase Free)，洗液I(4×SSC，0.1％Tween-20)，洗液II(2×SSC)，洗液III(1×SSC)，抗荧光猝灭封片液。
2.9.2实验过程(以24孔板为例)
1)细胞培养：将无菌细胞爬片放置于24孔板孔底，按需求培养适量细胞(约5～6×104/孔)。实验前使细胞密度达到40％～60％。注：爬片与底板间不要产生气泡。
2)细胞固定与通透
a)清洗细胞，1×PBS 5min。
b)固定细胞，4％多聚甲醛，室温条件下，10min～15min。
c)清洗细胞，1×PBS 5min，共3次。
d)通透液放入冰内预冷，每孔加入预冷的通透液1mL，置于冰上静置10min。
e)吸掉通透液后，清洗细胞，加入1×PBS，5min，3次。
3)探针杂交
a)200μL预杂交液，每孔加入，37℃封闭30min(预杂交液需要提前取出适量在37℃恒温水浴锅中)。
b)预杂交同时，将杂交液在37℃恒温水浴锅中预热。
c)在避光条件下，把2.5μL 20uM STAT3 FISH Probe MiX储存液或内参FISHProbe Mix储存液加入到杂交液中。
d)弃去预杂交液，再加入100μL含有探针的杂交液,要覆盖整个细胞爬片，全程避光操作，37℃，过夜杂交。
4)清洗
a)在避光条件下，42℃，每孔细胞，洗液I清洗3次，5min每次，以降低背景信号。
b)在避光条件下，42℃，每孔细胞，洗液II清洗1次。
c)在避光条件下，42℃，每孔细胞，洗液III清洗1次。
d)在避光条件下，每孔细胞，1×PBS清洗，室温置于摇床上5min。
e)在避光条件下，用去酶DAPI染色液染色细胞核，室温10min。
f)在避光条件下，每孔细胞，1×PBS清洗3次，5min每次。
5)封片
避光条件下，从24孔中小心取出细胞爬片，滴加抗荧光猝灭剂。用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上，进行荧光检测。
注：小心取出细胞爬片，轻轻取出，避免破碎，避免碰到细胞造成的损失。
2.9.3免疫荧光染色
1)对肝癌细胞进行Tubulin免疫荧光染色前，先按上述细胞培养方法在载玻片上培养细胞至汇合度为40～60％。
2)吸去细胞培养基，加入细胞固定A液，并放在37rpm转速摇床上处理30～40min。
3)用1×PBS轻柔地清洗细胞3次，每次5min。
4)用0.3％PBST溶解BSA制得5％BSA溶液，然后用其在室温条件下对载玻片上的细胞进行固定处理1～2小时。
5)用0.3％PBST溶液稀释一抗后将一抗溶液加入到含有载玻片的培养皿中，4℃过夜处理。
6)用1×PBS轻柔地洗涤载玻片上的细胞3次，每次5min。
7)用0.3％PBST溶液稀释二抗后将二抗溶液加入到含有载玻片的培养皿中，室温静置处理2～3小时。
8)用1×TBS溶液轻柔地洗涤细胞3次，每次5min，避光处理。
9)去除培养皿中1×TBS溶液，从培养皿中取出表面长有细胞的载玻片并反向覆盖于滴有2～3滴SlowFade-DAPI-Fluoromount-G的显微镜用载玻片，并用指甲油作封片处理，静置20min。全过程避光处理。
由图4结果表明，与正常肝细胞Lo2相比，肝癌HCCLM3细胞和MHCC97H细胞中lncRNALOC105376270高表达。
综上可知，本发明将lncRNA LOC105376270用于诊断原发性肝癌的诊断靶点。
实施例2
2.1病例来源
所有实验组对象均来自2017年1月至2019年5月在温州医科大学第二附属医院就诊的确诊原发性肝细胞型肝癌患者，共计43例，其中三级原发性肝细胞型肝癌17例，四级原发性肝细胞型肝癌26例；健康对照组来自温州医科大学第二附属医院健康查体中心，共计23例。
2.2血清样本处理
将采集的到的全血标本采用EDTA抗凝法处理后，在4℃下4000rpm离心10分钟全血标本得到血清。用500μL去RNA酶处理EP管对血清样本进行分装，分装后置于-80℃冰箱保存。
采用实施例1所述的方式将健康对照组和原发性肝细胞型肝癌患者血清中的lncRNALOC105376270进行Q-PCR。同时还将三级原发性肝细胞型肝癌、四级原发性肝细胞型肝癌以及健康对照组患者血清中的lncRNA LOC105376270进行Q-PCR。以健康人为对照，用ΔCt法分析，采用Graphpad Prism6.0软件进行数据统计和分析，数据以Mean±SD表示；两组独立样本采用t检验，两组以上采用one-wayANOVA检验，以P<0.05差异判断结果阳性，即患有原发性肝细胞型肝癌。
由图5可知，与健康人血清相比，肝癌病人血清中lncRNALOC105376270高表达，而且lncRNALOC105376270表达水平与肝癌分期成正相关性，同时结果表明，43例原发性肝癌细胞患者血清中的lncRNALOC105376270均高表达，而23例健康对照组的血清中的lncRNALOC105376270均未高表达。因此，将lncRNA LOC105376270用于诊断是否患有原发性肝癌的准确性高。
实施例3
3.1细胞系基因敲低稳定株构建
3.1.1.构建RNAi慢病毒表达载体
可特异性识别lncRNALOC105376270的shRNA慢病毒表达载体是由上海吉凯基因生物公司设计合成，所使用的慢病毒载体GV493带有GFP绿色荧光蛋白标签和嘌呤霉素筛选的标志。我们使用慢病毒包装系统将起其导入HCCLM3和MHCC97H细胞系中，其中慢病包装辅助质粒为psPAX2、pMD2G。
所用shRNA序列及慢病毒载体信息如下：
shRNA-1TTCCGCCCCGTAGGACGGAAC(SEQ ID No.3)
shRNA-2GACCGGGGAGTTCAAGGTCGA(SEQ ID No.4)
shRNA-3TCCTGTAACCCAGGAGTGAGG(SEQ ID No.5)
shNC TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID No.6)
3.1.2.摇菌以扩大培养
1)将购买的shRNA慢病毒表达载体质粒菌液接种至5mL LB培养基中，每管接种15～20μL菌液，注意全程无菌操作；
2)将接种菌液的试管置于250rpm，37℃摇菌12～16小时；
3.1.3.提取去内毒素质粒(按照OMEGA质粒提取说明书进行操作)
1)扩大培养细菌后，将菌液转移到15mL的离心管中，室温，4500rpm离心5min；
2)倒掉上清，向离心管中加250μL SolutionⅠ轻轻吹打菌液，使其充分混匀，将菌液转移到1.5mL Ep管；
3)向Ep管中加250μL SolutionⅡ后轻轻颠倒Ep管数次，室温静置2～3min；
4)向Ep管中加125μL的BufferN3(BufferN3要放置冰上预冷)立即颠倒混匀Ep管；
5)室温14000g离心10min，将上清液转移至新的Ep管中；
6)向Ep管中加1/10下层菌液沉淀体积的ETR Solution，颠倒混匀数10次；
7)将Ep管放在冰上静置10min，期间颠倒Ep管几次；
8)42℃孵育Ep管中的混合溶液5min，室温12000g离心2min；
9)将上清转移到一个新的Ep管，加入1/2下层沉淀体积的无水乙醇，颠倒Ep管6～7次，室温放置1～2min；
10)将离心柱放置Ep管中，吸取700μL混合液至离心柱中，室温14000g离心1min，弃掉液体，重复上述步骤一次；
11)将500μL HBC Buffer加至离心柱，室温14000g离心1min；
12)将700μL DNAwash Buffer加至离心柱，室温14000g离心1min，将液体弃掉，重复上述步骤一次；
13)室温14000g空转2min Ep管，打开Ep管盖，使液体挥发2min，将离心柱移至新的Ep管中；
14)取30μL ddH2O至离心柱中(ddH2O要60℃提前预热)，离心柱静置1min，室温14000g离心1min，重复上述操作步骤一次；
15)将提取的质粒放置-80℃冰箱，可长期保存。
2.9.4.包装病毒颗粒及细胞转染
1)以6cm培养皿为例，将约1×106个HEK-293T细胞铺至皿内，再加入4mL细胞培基，“十字交叉法”轻摇混匀细胞；
2)将HEK-293T细胞置于37℃培养箱培养；
3)24小时后转染HEK-293T细胞，在350μL opti-MEM中加入15μL lipo3000配成A溶液，再在350μL opti-MEM中加入15μLP3000、6μg shRNA慢病毒重组质粒、5μg psPAX2和2.5μg pMD2G配成B溶液，然后把AB溶液混匀，孵育5min，细胞换液后，加入转染混合液；
4)轻摇混匀培养皿内转染试剂，在皿盖上做相应的标记，置于37℃恒温培养箱培养；
5)24小时后观察293T细胞状态，若细胞状态不佳，且约有20％～30％的细胞开始死亡，可收集病毒液上清于15mL无菌离心管中，暂存于4℃冰箱，然后向培养皿中加3mL新鲜细胞培养基；
6)48小时后再收集一次病毒液上清。将两次收集的病毒液上清吸至一15mL无菌离心管中，室温，1500rpm，离心5min后将上清液转移至新的离心管中。最后用过滤器滤除残存的HEK-293T细胞；
5)第一天，以六孔板为例进行细胞铺板，每孔铺2×105个细胞(HCCLM3和MHCC97H)，每孔加3mL培养基后置于37℃恒温培养箱继续培养；
6)第二天，待细胞融合度达40％～50％时，弃去旧培养基，每孔加1mL PBS轻轻洗涤细胞2次，再加入3mL新的培养基和1mL病毒液，然后加入8～10μg/mL聚戊二烯，放置37℃培养箱培养；
7)第三天，细胞被病毒感染24h后可将培养板置于荧光显微镜下观察，若细胞内出现绿色荧光则表明质粒已转入细胞并成功表达，若荧光较暗则可以转染48小时后再更换含有嘌呤霉素的细胞培养液进行筛选，在前期筛选出嘌呤霉素的最佳浓度为14μg/mL，每隔一天更换一次培养基，用浓度为14μg/mL的嘌呤霉素连续筛选细胞7天，从而筛选出具有嘌呤霉素抗性的细胞，将筛选出的部分细胞进行冻存保种，剩下的细胞继续传代培养，最后用Real time PCR和Western Blot分别在mRNA水平和蛋白水平验证lncRNALOC105376270的敲低效率。
结果如图6所示，与对照组sh-NC相比，sh-1、sh-2和sh-3的lncRNA LOC105376270表达水平显著下降，本发明成功获得了敲低lncRNA LOC105376270稳转细胞株。
3.2质粒的提取
1)提取质粒的方法严格按照OMEGA质粒提取说明书进行提取。
2)质粒浓度的测定：打开仪器电源后选择双链DNA软件，用ddH2O清洗加样孔和顶盖3次后用ddH2O调零作为空白对照，再进行质粒DNA测定。测定结果应满足260与280的比值大于1.8，如果太小说明质粒的质量不好。260代表核酸，280代表蛋白质，因此此比值太小说明有很多的蛋白质包含其中，这可能会影响后续的酶切或连接实验。如果提取的质粒浓度太低也会影响后续实验的成功率。
3)质粒可以保存在-20℃或更低的温度中，在-20℃保存过久会导致后续的酶切连接实验。
3.3细胞功能实验3.3.1RTCA实验技术测量细胞增殖曲线
1)细胞悬液准备：
a无菌条件，在紫外照射后的超净工作台内，弃掉细胞培养皿内原有的细胞培养液。
b清洗肝癌细胞，1×PBS，1～2次，1mL含EDTA的胰蛋白酶溶液消化分离细胞，在显微镜下观察细胞形态，发现细胞变圆皱缩之后，立即将胰酶细胞消化液吸掉，用百分之十胎牛血清终止消化。
c用移液枪反复轻轻吹打贴壁的细胞，将细胞吹散，使它们形成细胞悬液。将细胞悬液转移到15mL离心管中，离心5min，1000rpm，去除上清，加入新鲜细胞培养基，将细胞吹打混匀。用计数板计数细胞悬液中的细胞浓度之后，配制成实验需要的细胞浓度，大约每个孔需要8000个HCCLM3细胞。
2)E-Plate 96准备：
a在E-Plate 96的孔中加入50μL培养基。
b将E-Plate 96放到RTCA Station上。
cRTCA系统会自动进行扫描(“Scan Plate”)->检查是否接触良好(在“Message”页面显示Connection OK)。
d开始检测基线(Background)→确定所选择的孔接触正常，所有孔的Cell Index低于0.063。
e取出E-Plate 96，在孔中加入100μL以吹打均匀的HCCLM3细胞悬液，使每孔中细胞数目为8000cells/100μL。注：细胞加入E-Plate 96后无需再将细胞和孔中原有的培养基混匀。
f将E-Plate 96置于超净台中室温放置30min，使细胞在孔中贴壁。
g将E-Plate 96放到培养箱中的RTCA Station上。
h在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始Step2(过夜检测细胞增殖曲线)。
3.3.2RTCA实验技术测量细胞迁移曲线
1)CIM板装配及基线测量
a.CIM板装配：在超净台内将CIM上室和下室从包装袋中取出，将CIM上室放在超净台上，使蓝色标志点位于上室的左上方，将上室和下室加在一起，注意力量适中。
b.在上下室合并在一起之前，现在下室每孔加入165μL新鲜配置的百分之十的胎牛血清培养基(A-G孔为含血清培养基，H孔为无血清培养基)，注意最后一个孔设置为NTC，注意加液时不要产生气泡，使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面。
c.注意使上室和下室的孔对齐。放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应，放置时要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后，立即用手向下按压，听到卡住的声音之后，说明上下是已经合并。
d.在上室中加入30μL无血清培养基，轻轻拍板四周，使无血清培养基分布均匀。将该装置置于37℃，CO2浓度为5％的CO2细胞培养箱中培养平衡1h。
e.基线测量：将平衡1h的CIM板置于RTCADPAnalyzer上，开始step 1进行基线检测。
2)细胞悬液准备：
a.实验使用的细胞为HCCLM3细胞株，37℃，5％CO2浓度CO2细胞培养箱培养。
b.在进行细胞实验前一天进行细胞传代，要确保细胞状态良好，使细胞密度在70～80％之间在细胞实验时。从细胞培养箱中取出细胞，进行消化，离心后，细胞计数之后，细胞稀释配制成实验需要的细胞浓度8×104cells/mL。
3)将细胞加入CIM板
a.将测好基线的CIM板从DP上取出，在上室孔中加入100μL混合均匀的无血清细胞悬液，使每孔中细胞数目位八万个，注意加样时不要气泡，也不要吹打，垂直加入。
b.将16CIM板置于超净台中室温放置30min。
c.将16CIM板放到培养箱中的RTCA Station上。
d.在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始Step2，间隔15min测量一次，共检测120h。
3.3.3Tanswell迁移实验
细胞生长会趋向于有利条件，在Tanswell上室种植肿瘤细胞，下室加入FBS或者其他的趋化因子，细胞就会从营养贫乏的上室向营养成分高的下室移动，进入下室细胞数越多，即表明该种细胞迁移能力越强。
1)细胞铺板：取对数生长期细胞消化后，加入15mL离心管中，1000rpm，5min离心，弃上清。细胞沉淀用DMEM培养基离心洗涤2次，1000rpm，5min/次。弃上清后用DMEM基础培养基重悬，混匀后细胞计数。
2)上室内加入用DMEM培养基稀释的3×105个细胞悬液200μL，下室内加入600μL含15％FBS的完全培养基，注意小室和培养基之间不能有空隙。37℃、5％CO2培养箱内培养。
3)48h后，取出小室，上室内液体吸净后将小室放入4％多聚甲醛中固定20min，吸出小室内甲醛，将小室倒放在滤纸上晾干，然后放入结晶紫中染色20min。
4)显微镜下随机取5～8个视野拍照，并计数。
5)统计学统计有无意义。
3.3.4Tanswell基质胶侵袭实验
1)预先将Transwell小室，与无菌中枪头放入-20℃预冷。基质胶和DMEM培养基放于碎冰中。用DMEM稀释将基质胶40倍稀释，在各个Transwell的上室内分别垂直加入100μL稀释后的基质胶，避免晃动，37℃条件下放置2小时以凝固基质胶。
2)待细胞培养至汇合度达到80％左右，胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，收集细胞。
3)用4mL DMEM培养基重悬细胞，1000rpm离心5min弃上清。
4)重复上一步。
5)加1mL DMEM重悬细胞并使用血细胞计数板进行计数。
6)于下室加入600μL含有18～20％FBS的DMEM培养基，于上室加入200μL的细胞悬液，使细胞均匀分布在Transwell的上室，37℃细胞培养箱内，静置培养48h。
7)10％多聚甲醛固定小室30min，再用去离子水进行浸洗。
8)用1％浓度的结晶紫溶液对Transwell染色10～15min，用去离子水洗涤两次。用棉签轻轻擦掉小室上侧滤膜表面细胞，接着再用去离子水对小室清洗两次。
9)把Transwell小室放在24孔板中，风干，显微镜下进行细胞计数，在×10倍物镜条件下对5个高倍视野中穿过滤膜的细胞数进行计数，重复3次实验计算平均数并做统计学分析。
由图7结果表明，与对照组shNC相比，敲低lncRNALOC105376270组即sh1、sh2和sh3均显著抑制HCCLM3细胞的活性和迁移能力，从而达到治疗原发性肝癌的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.lncRNALOC105376270在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
2.一种用于诊断原发性肝癌的引物，其特征在于，所述引物包括扩增lncRNALOC105376270的上下游引物，所述扩增lncRNALOC105376270的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
3.一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为健康人的血清。
6.一种lncRNALOC105376270抑制剂在制备治疗原发性肝癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述lncRNA LOC105376270抑制剂包括降低lncRNALOC105376270表达的调节剂和/或降解lncRNALOC105376270产物的蛋白酶。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述降低lncRNA LOC105376270表达的调节剂包括敲除或沉默lncRNALOC105376270的试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述敲除或沉默lncRNA LOC105376270的试剂包括siRNA、shRNA或miRNA。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101033489A (zh) * 2007-02-01 2007-09-12 中山大学 一种与原发性肝癌相关的cdc6基因的单核苷酸多态位点及其应用
US20130178428A1 (en) * 2011-11-30 2013-07-11 Dave S.B. HOON Long noncoding rna (lncrna) as a biomarker and therapeutic marker in cancer
CN106893784A (zh) * 2017-05-02 2017-06-27 北京泱深生物信息技术有限公司 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物
CN106967820A (zh) * 2017-05-05 2017-07-21 南京盖斯夫医药科技有限公司 用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物和试剂盒
CN107130021A (zh) * 2017-05-04 2017-09-05 南京盖斯夫医药科技有限公司 Ccat1长链非编码rna及其小分子抑制剂在肝细胞癌治疗方面的应用
CN107267625A (zh) * 2017-07-06 2017-10-20 王冬国 lncRNA作为生物标志物在肝癌诊疗中的用途
CN107663541A (zh) * 2017-10-31 2018-02-06 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物及其筛选方法与应用
CN107937519A (zh) * 2017-10-31 2018-04-20 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用
CN109609649A (zh) * 2019-01-31 2019-04-12 泰山医学院 一种用于直肠腺癌诊疗的lncRNA
CN110396545A (zh) * 2019-09-04 2019-11-01 上海容音医疗科技咨询中心 一种外周循环血lncRNA用于诊断早期原发性肝癌、制备原发性肝癌筛查试剂盒的用途
WO2020124350A1 (en) * 2018-12-18 2020-06-25 Kaohsiung Medical University Prediction of hcv-related hcc recurrence by exosomal lnc-dancr levels
CN113278695A (zh) * 2021-04-12 2021-08-20 山东大学第二医院 Linc00969在肝癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101033489A (zh) * 2007-02-01 2007-09-12 中山大学 一种与原发性肝癌相关的cdc6基因的单核苷酸多态位点及其应用
US20130178428A1 (en) * 2011-11-30 2013-07-11 Dave S.B. HOON Long noncoding rna (lncrna) as a biomarker and therapeutic marker in cancer
CN106893784A (zh) * 2017-05-02 2017-06-27 北京泱深生物信息技术有限公司 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物
CN107130021A (zh) * 2017-05-04 2017-09-05 南京盖斯夫医药科技有限公司 Ccat1长链非编码rna及其小分子抑制剂在肝细胞癌治疗方面的应用
CN106967820A (zh) * 2017-05-05 2017-07-21 南京盖斯夫医药科技有限公司 用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物和试剂盒
CN107267625A (zh) * 2017-07-06 2017-10-20 王冬国 lncRNA作为生物标志物在肝癌诊疗中的用途
CN107663541A (zh) * 2017-10-31 2018-02-06 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物及其筛选方法与应用
CN107937519A (zh) * 2017-10-31 2018-04-20 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用
WO2020124350A1 (en) * 2018-12-18 2020-06-25 Kaohsiung Medical University Prediction of hcv-related hcc recurrence by exosomal lnc-dancr levels
CN109609649A (zh) * 2019-01-31 2019-04-12 泰山医学院 一种用于直肠腺癌诊疗的lncRNA
CN110396545A (zh) * 2019-09-04 2019-11-01 上海容音医疗科技咨询中心 一种外周循环血lncRNA用于诊断早期原发性肝癌、制备原发性肝癌筛查试剂盒的用途
CN113278695A (zh) * 2021-04-12 2021-08-20 山东大学第二医院 Linc00969在肝癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
佚名: "XR_930343.2", NCBI, 26 March 2018 (2018-03-26), pages 1 - 2 *
陈恩利;楼俊晓;王镇;黄瑛;郝敬铎;: "lncRNA GIHCG通过调节miR-429在原发性肝癌发生发展中的作用", 中华全科医学, no. 05, 31 May 2019 (2019-05-31), pages 779 - 783 *

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