CN108823315A - 检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用 - Google Patents

检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用，以及fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。本发明首次发现fen1基因与肝癌的发生发展相关：本发明通过干扰实验证明改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移；动物实验显示FEN1的表达可以促进肝癌的转移。

Description

检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵 袭转移的试剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。
背景技术
原发性肝癌，致死率位列全球高致死性肿瘤的第三位，但肝癌的早期发现较难、肝癌切除术后复发和转移率较高一直严重影响着肝癌病人的治疗效果与生存期。原发性肝癌的病因和发病机制尚未确定。目前认为与肝硬化、病毒性肝炎以及黄曲霉素等化学致癌物质和环境因素有关。临床表现主要包括以下几个方面：
1.肝区疼痛：半数以上病人肝区疼痛为首发症状，多为持续性钝痛、刺痛或胀痛。主要是由于肿瘤迅速生长，使肝包膜张力增加所致。位于肝右叶顶部的癌肿累及横膈，则疼痛可牵涉至右肩背部。当肝癌结节发生坏死、破裂，可引起腹腔内出血，出现腹膜刺激征等急腹症表现。
2.全身和消化道症状：主要表现为乏力、消瘦、食欲减退、腹胀等。部分病人可伴有恶心、呕吐、发热、腹泻等症状。晚期则出现贫血、黄疸、腹水、下肢水肿、皮下出血及恶病质等。
3.肝大：肝大呈进行性，质地坚硬，边缘不规则，表面凹凸不平呈大小结节或巨块。
4.肝癌转移症状：肝癌如发生肺、骨、脑等处转移，可产生相应症状。少数病人可有低血糖症、红细胞增多症、高血钙和高胆固醇血症等特殊表现。原发性肝癌的并发症主要有肝性昏迷、上消化道出血、癌肿破裂出血及继发感染。
随着原发性肝癌早期诊断、早期治疗和肝外科手术技术的进步，总体疗效有所提高。但肝癌即使获得根治性切除，5年内仍有60％～70％的病人出现转移复发，所以尽早发现肝癌的复发和转移十分必要。至今没有很好地生物标志物可以用于早期诊断及预测肿瘤的侵袭转移。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测FEN1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。本发明研究发现改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于早期诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。
作为优选，检测fen1基因表达水平的试剂为包括特异性识别fen1基因的探针的试剂，或包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂，或包括特异性结合FEN1蛋白的抗体的免疫组化试剂或Westernblot试剂。
作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂中，特异性扩增fen1基因的引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2 所示的下游引物组成。
SEQ ID NO：1所示的上游引物序列如下：
5′-CTGTGGACCTCATCCAGAAGCA-3′
SEQ ID NO：2所示的下游引物序列如下：
5′-CCAGCACCTCAGGTTCCAAGA-3′
作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂反应体系(25μL)为：
作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂扩增程序为：
本发明还提供了fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。
作为优选，fen1基因的抑制剂为fen1基因的shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸中的一种，或其构建物。
作为优选，shRNA的扩增引物序列组成如下：
由SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物组成的引物；
SEQ ID NO：3所示的上游引物序列如下：
CCGGGCCCGTGTATGTCTTTGATTTCAAGAGAATCAAAGACATACA CGGGCTTTTTTG
SEQ ID NO：4所示的下游引物序列如下：
AATTCAAAAAAGCCCGTGTATGTCTTTGATTCTCTTGAAATCAAAG ACATACACGGGC
或者由SEQ ID NO：5所示的上游引物和SEQ ID NO：6所示的下游引物组成的引物；
SEQ ID NO：5所示的上游引物序列如下：
CCGGCCTCATGGGCATCCCTTATTTCAAGAGAATAAGGGATGCCCA TGAGGTTTTTTG
SEQ ID NO：6所示的下游引物序列如下：
AATTCAAAAAACCTCATGGGCATCCCTTATTCTCTTGAAATAAGGG ATGCCCATGAGG
或者由SEQ ID NO：7所示的上游引物和SEQ ID NO：8所示的下游引物组成的引物；
SEQ ID NO：7所示的上游引物序列如下：
CCGGGCTCACTCTCTTCAGCTAATTCAAGAGATTAGCTGAAGAGAG TGAGCTTTTTTG
SEQ ID NO：8所示的下游引物序列如下：
AATTCAAAAAAGCTCACTCTCTTCAGCTAATCTCTTGAATTAGCTG AAGAGAGTGAGC
或者由SEQ ID NO：9所示的上游引物和SEQ ID NO：10所示的下游引物组成的引物。
SEQ ID NO：9所示的上游引物序列如下：
CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCG GAGAATTTTTTG
SEQ ID NO：10所示的下游引物序列如下：
AATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAC ACGTTCGGAGAA
作为优选，构建物为克隆入shRNA的慢病毒干扰质粒载体。
作为优选，克隆入shRNA的慢病毒干扰质粒载体为 pLKD-CMV-EGFR-2A-Puro-U6-shRNA(FEN1)。
作为优选，肝癌侵袭转移的药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明提供了检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于早期诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用，以及fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。本发明具有的技术效果为：
本发明首次发现fen1基因与肝癌的发生发展相关。本发明通过干扰实验证明改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移。动物实验显示FEN1的表达可以促进肝癌的转移。具体验证试验及结果如下：
本发明通过qPCR检测fen1基因在肝癌细胞与正常肝细胞的表达情况，结果显示：与正常肝细胞系相比，FEN1基因在肝癌细胞中表达均上升，除 SK-HEP1其他都有统计学意义(p＜0.05)；
本发明利用qPCR检测fen1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，结果显示：与癌旁组织相比，fen1基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p ＜0.05)；
本发明利用免疫组化检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，结果显示：与癌旁组织相比，肝癌中FEN1的表达明显升高，差异具有统计学意义 (p＜0.05)；
本发明检测转染sh-RNA对肝癌细胞FEN1的表达情况，结果显示： sh1-FEN1、sh2-FEN1、sh3-FEN1组均能够显著降低FEN1的表达，差异具有统计学意义(p＜0.05)。其中尤以sh3-FEN1干扰效果最佳；
本发明通过Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，结果显示：转染了shRNA-FEN1的肝癌细胞侵袭和迁移能力明显下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)。说明FEN1能够促进肝癌细胞的迁徙和侵袭；
本发明通过动物模型检测FEN1的表达对肝癌肺转移的影响，结果显示：转染了sh3-FEN1组，即FEN1敲低组，肿瘤生长速度明显慢于对照组；肿瘤的重量也明显低于对照组。FEN1敲低组肺转移结节数量也明显低于对照组，且有统计学差异(p＜0.05)。体内实验显示FEN1的表达量差异能够改变肿瘤的生长和转移。
附图说明
图1示利用qPCR检测FEN1在肝癌细胞与正常肝细胞中的表达情况；
图2示利用qPCR检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况；其中图A 是用qPCR检测FEN1在16对肝癌患者癌和癌旁的表达情况，图B是统计结果；
图3示利用免疫组化检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况；其中图 A显示用免疫组化技术检测FEN1在16对肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，图B 显示统计结果；
图4示检测转染sh-RNA对肝癌细胞FEN1的表达情况图；其中图A是转染 sh-RNA对FEN1 mRNA表达的影响，图B是转染sh-RNA对FEN1蛋白表达的影响；
图5示Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响；其中图A是Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，图B是统计结果；
图6示动物模型检测FEN1的表达对肝癌肺转移的影响；其中图A是FEN1 敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的在体形态，图B是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的体积比较情况，图C是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的重量比较，图D是 FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移的大体形态和HE染色比较，图E是FEN1 敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移的肿瘤数量比较，图F是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移后小鼠的体重情况。
具体实施方式
本发明公开了检测FEN1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测FEN1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 qPCR检测FEN1基因在肝癌细胞与正常肝细胞的表达情况
1样本收集：
培养正常肝细胞HL7702和一系列的肝癌细胞SK-HEP-1,MHCC97-H, HepG2,SMMC-7721,HCCLM3,Huh7。以含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM 培养基在37％、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化。
2 RNA样本的制备：
利用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。
3逆转录：
用采用25μL反应体系，每个样本取1ug总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5X逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT， 30uM Oligo dT，200U/μL M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃ 10min，短暂离心。
4 qPCR扩增检验：
根据FEN1基因和管家基因的GAPDH的序列设计引物，引物序列由上海生工合成。其中FEN1基因的引物序列如下所示。
表1 FEN1基因的引物序列
配制25μL反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μL，正反引物 (5uM)各1μL，模板cDNA 2.0μL，无酶水8.5μL。各项操作均于冰上进行。
扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，58℃15s，72℃45s)×36个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Bio-Rad荧光实时定量PCR仪上进行 PCR反应，通过溶解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT进行相对定量。
5结果：
结果如图1所示，与正常肝细胞系相比，FEN1基因在肝癌细胞中表达均上升，除SK-HEP1其他都有统计学意义(p＜0.05)。
实施例2 利用qPCR检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况
1各收集16对肝癌患者的癌组织以及相应的癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
2 RNA样本的制备：
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。
3逆转录：
具体步骤同实施例1。
4结果：
结果如图2所示，其中图A是用qPCR检测FEN1在16对肝癌患者癌和癌旁的表达情况，图B是统计结果。与癌旁组织相比，FEN1基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
实施例3 利用免疫组化检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况
1组织块固定、脱水、包埋
取16对肝癌和癌旁组织放入4％多聚甲醛里面固定3-4h，取适当大小组织放入包埋盒中，进行脱水。依次进入：75％酒精1.5h、95％酒精1.5h、95％酒精1h、无水乙醇1.5h、无水乙醇1h、二甲苯一号0.5h、二甲苯二号0.5h。打开包埋机，用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中，然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡，然后石蜡饭盒二号，进行三次浸蜡。然后在模具中滴入液体石蜡，从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒，打开用镊子取出组织放入模具中。用包埋盒的另一半盖住模具，再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。切片后组化染色。
2组织化学染色
⑴室温脱蜡、水化：二甲苯一号10min、二甲苯二号8min、二甲苯三号8min、无水乙醇5min、90％乙醇3min、80％乙醇3min、70％乙醇3min。蒸馏水3min*3 次，PBS3min*3次。
⑵热抗原修复，换新的切片架，放入水化后的切片。配置抗原修复液。温度控制在98度。然后将切片放入热锅中15min，最后自然冷却室温。PBS五min*2 次，蒸馏水3min*2次。
⑶免疫组化笔画圈：取出组织，甩干水分。用组化笔画圈围住组织，圆圈完整。
⑷灭活内源酶活性：将切片放入湿盒中，室温孵育10min。PBS三min*3 次，蒸馏水水洗三min。
⑸封闭非特异性位点：甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封闭液，放入湿盒内，室温10min。
⑹甩掉封闭液，滴加FEN1一抗盖住组织，然后放入湿盒内4摄氏度过夜。
⑺第二天，4度冰箱取出湿盒，室温复温30min，PBS三min*三次，蒸馏水洗涤三min。
⑻甩干水分，滴加二抗一滴或者，室温孵育10min。PBS三min*三次，蒸馏水水洗三min。
⑼每张片子滴加一滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10min， PBS三min*三次，蒸馏水水洗三min。
⑽每张片子滴加两滴DAB溶液，显微镜下观察3-10min。染色合适即可终止染色，PBS冲洗。
⑾苏木素复染，1-2min，细胞核变蓝色即可终止，PBS冲洗反蓝，12.1％盐酸酒精分化3s，PBS冲洗三min。
⑿脱水：70％酒精1min、80％酒精1min、95％酒精2min、无水乙醇4min、二甲苯一号3min、二甲苯二号3min。
⒀凉干片子后滴加适量中性树胶封片，盖上盖玻片，小心气泡。晾干半天即可。
⒁显微镜下拍照，Image-Pro Plus软件分析。
3结果
结果如图3所示，其中图A显示用免疫组化技术检测FEN1在16对肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，图B显示统计结果。与癌旁组织相比，肝癌中FEN1 的表达明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
实施例4 检测转染sh-RNA对肝癌细胞FEN1的表达情况图
1慢病毒干扰质粒载体的构建：针对目的基因设计特异性引物，合成 sh-RNA(sh1-FEN1,sh2-FEN1,sh3-FEN1,sh-control)。引物如下：
表2 sh-RNA序列
FEN1的干扰载体病毒包装编码基因(由和元生物技术公司负责包装构建)：
表3 FEN1的干扰载体病毒包装编码基因信息
2慢病毒感染肝癌细胞Huh7
将细胞接种到6孔板中，以含10％胎牛血清的DMEM培养基在37％、 5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养24h。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。第二天，用含有5μg/mL polybrene的2mL新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育培养24h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基继续培养。转染48h后可见明显荧光表达，72h后更加明显。96h 后用1μg/mL嘌呤霉素筛选，筛选持续4周。
3测shRNA-FEN1干扰效率
⑴提取细胞RNA，RT-PCR操作步骤同上。
⑵提取细胞总蛋白：
提取细胞总蛋白：PBS洗细胞3次，加入裂解缓冲液RIRA(1.5x106个细胞大约加入100μL裂解液)加入1:100蛋白酶抑制剂，加入1:1000磷酸化酶抑制剂，冰上放置20min，收集裂解液，离心12000rpm，15min。吸取上清，釆用美国Thermo公司的BCA Protein Assay Kit测蛋白浓度,操作步骤按说明书，加SDS-loading缓冲液，煮沸5min，使蛋白变性。
⑶WesternBlot检测细胞蛋白表达：
①上样与电泳：
a.将预制胶按要求放入电泳槽内，将适量1xRunning Buffer倒入外槽中。
b.再于内槽内注满1xRunning Buffer。按顺序将蛋白样品上样到分离胶加样孔内，同时上样预染蛋白Marker，记录好上样顺序。
c.恒压跑胶，电压设为120V，大约100min。
②转膜：
a.准备转膜装置，甲醇及转膜缓冲液(1x Transfer Buffer)
b.1xTransfer Buffer：50mL 20xNapage Transger Buffer加入850mL蒸馏水再加入100mL甲醇。
c.用甲醇激活PVDF膜，浸泡10s，用蒸馏水震荡水洗3次，每次1min。然后浸泡于1xTransfer Buffer里。
d.转膜夹及棉块和滤纸浸泡于1x Transfer Buffer里。
e.从电泳仪内取出凝胶，然后浸泡在1xTransfer Buffer里。
f.将转膜板黑色的一面(阴性面)朝下放置，按“海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵”的顺序从下往上放置。
g.将转膜三明治装入电泳仪内，倒入预冷的1xTransfer Buffer，恒压转膜 4℃100V1h。
③封闭、孵育及显影：
a.完成转膜以后，用镊子取出PVDF膜，室温下5％的脱脂奶粉封闭1h。
b.孵育一抗：按1:500比例稀释FEN1抗体，抗体稀释液为1％BSA溶于 TBST溶液中配置，4℃振摇过夜。
c.孵育结束后，用TBST洗膜，缓慢摇动洗涤，洗3次，每次5min。
d.二抗孵育：选用与一抗相匹配的二抗，按1:1000比例稀释抗体，在摇床上缓慢摇动室温孵育1h。
e.孵育结束后，用TBST洗膜，缓慢摇动洗涤，洗3次，每次5min。
f.显影：一般用Western Blot Luminol Reagent显影液进行显影。
⑷结果：
如图4中PCR和Western Blot所示，其中图A是转染sh-RNA对FEN1 mRNA 表达的影响，图B是转染sh-RNA对FEN1蛋白表达的影响。相比对照组， sh1-FEN1、sh2-FEN1、sh3-FEN1组均能够显著降低FEN1的表达，差异具有统计学意义(p＜0.05)。其中尤以sh3-FEN1干扰效果最佳，故后期实验选用 sh3-FEN1。
实施例5 Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响
⑴Transwell检测细胞侵袭和转移：
①首先将基质胶从-20℃冰箱中取出，放入冰水混合物中，同时提前将实验中使用的枪头和EP管放入4℃冰箱中降温。
②将小室transwell放入细胞培养孔中，将基质胶和基础培养基DMEM按照1:3进行充分混合，在transwell小室底部加入50μL基质胶和基础培养基 DMEM的混合液。后将含有transwell小室的培养板放入CO2培养箱中培养30min。
③采用胰酶消化法消化贴壁细胞，将目标细胞制成单细胞悬液，对单细胞悬液在显微镜下进行计数，之后使用含有1％BSA的DMEM培养基调整细胞浓度为1x105/mL。
④在24孔板中设置已铺基质胶和未铺基质胶的transwell小室，后向其中加入10％血清的培养基。取细胞悬液200μL加入到transwell小室中，在二氧化碳培养箱中培养24h。
⑤取出Transwell小室，小室中的细胞采用湿棉签擦掉，立即放入甲醛中固定，固定时间为15min。之后将小室取出晾干，采用结晶紫进行染色，染色时间为20min，染色结束后使用水冲干净后晾干。
⑥穿膜细胞数采用显微镜镜下观察，同时计数10个高倍视野，取10个视野的平均值。
⑵结果：
结果如图5所示，其中图A是Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，图B是统计结果。图5所示的结果显示：与对照组相比，转染了shRNA-FEN1的肝癌细胞侵袭和迁移能力明显下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)。说明FEN1能够促进肝癌细胞的迁徙和侵袭。
实施例6 动物模型检测FEN1的表达对肝癌肺转移的影响
⑴皮下成瘤实验
收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基，取处于对数生长期1×106细胞，选择腋下接种，接种前用75％的酒精对进针部位擦拭消毒。排去一次性针头内空气，从进针部位向前穿刺大约1cm，进行皮下注射，注射时，每次注射量大约为0.2mL，每日观察，隔3天记录肿瘤的体积。
⑵尾静脉注射后观察肿瘤肺转移情况
收集FEN1敲低的Huh7细胞与对照组肝癌细胞经尾静脉注射入小鼠体内，隔3天检测小鼠的体重，4周后处死小鼠，统计肺转移灶的数量，将转移肿瘤组织用4％多聚甲醛固定，连续切片后HE染色，显微镜下观察。
⑶结果：
其中图6A是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的在体形态，图6B是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的体积比较情况，图6C是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤的重量比较，图6D是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移的大体形态和 HE染色比较，图6E是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移的肿瘤数量比较，图6F是FEN1敲减小鼠和对照小鼠肿瘤肺转移后小鼠的体重情况。
结果显示，转染了sh3-FEN1组，即FEN1敲低组，肿瘤生长速度明显慢于对照组(图6A,B)；肿瘤的重量也明显低于对照组(图6C)。FEN1敲低组肺转移结节数量也明显低于对照组(图6D,E)，且有统计学差异(p＜0.05)。体内实验显示FEN1的表达量差异能够改变肿瘤的生长和转移。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 重庆医科大学附属第二医院
<120> 检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用
<130> MP1814950
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ctgtggacct catccagaag ca 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccagcacctc aggttccaag a 21
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccgggcccgt gtatgtcttt gatttcaaga gaatcaaaga catacacggg cttttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
aattcaaaaa agcccgtgta tgtctttgat tctcttgaaa tcaaagacat acacgggc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccggcctcat gggcatccct tatttcaaga gaataaggga tgcccatgag gttttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aattcaaaaa acctcatggg catcccttat tctcttgaaa taagggatgc ccatgagg 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccgggctcac tctcttcagc taattcaaga gattagctga agagagtgag cttttttg 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
aattcaaaaa agctcactct cttcagctaa tctcttgaat tagctgaaga gagtgagc 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ccggttctcc gaacgtgtca cgtttcaaga gaacgtgaca cgttcggaga attttttg 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
aattcaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt tctcttgaaa cgtgacacgt tcggagaa 58

Claims (10)

1.检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测fen1基因表达水平的试剂为包括特异性识别fen1基因的探针的试剂，或包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂，或包括特异性结合FEN1蛋白的抗体的免疫组化试剂或Westernblot试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂中，特异性扩增fen1基因的引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ IDNO：2所示的下游引物组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂反应体系为：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂扩增程序为：
6.fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述fen1基因的抑制剂为fen1基因的shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸中的一种，或其构建物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述shRNA的扩增引物序列组成如下：
由SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物组成的引物；
或者由SEQ ID NO：5所示的上游引物和SEQ ID NO：6所示的下游引物组成的引物；
或者由SEQ ID NO：7所示的上游引物和SEQ ID NO：8所示的下游引物组成的引物；
或者由SEQ ID NO：9所示的上游引物和SEQ ID NO：10所示的下游引物组成的引物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述构建物为克隆入shRNA的慢病毒干扰质粒载体。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述肝癌侵袭转移的药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
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