CN101033489A - 一种与原发性肝癌相关的cdc6基因的单核苷酸多态位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与原发性肝细胞癌相关的位于CDC6基因的多态位点(rs4134994)及其应用。本发明还提供了一种检测该多态位点及其与原发性肝细胞癌易感性的方法。利用本发明提供的多态位点的核酸序列及其检测方法，可生产对原发性肝细胞癌进行遗传学诊断的试剂盒，有助于原发性肝细胞癌的预防、早期诊断和治疗。

Description

一种与原发性肝癌相关的CDC6基因的单核苷酸多态位点及其应用

技术领域

本发明涉及一种与原发性肝细胞癌相关的CDC6基因的单核苷酸多态位点，本发明还涉及一种检测该多态位点的方法，以及该多态在预防、辅助诊断与治疗原发性肝细胞癌方面的用途。该发明属于生物技术领域。

技术背景

原发性肝细胞癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的主要发生地，肝癌的发生率高达十万分之三十五。近年来肝癌发病率有明显上升的趋势，严重危害人类的健康与生命安全。

单核苷酸多态性(SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以出现在基因调控区和编码区，出现在编码区的SNP可能改变基因的编码，使蛋白中某个氨基酸发生改变而影响其功能；而出现在基因调控区的SNP则主要影响基因的表达。SNP作为一种稳定遗传的早期突变，与疾病有着密切的相关性。当一种SNP的频率在患者明显超过非患者时，即表明该SNP与疾病关联，通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知的致病基因定位。SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括：一是在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因转录水平上和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；二是SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。

CDC6是一种重要的细胞分裂周期蛋白，其氨基酸序列上存在多个功能域，如在N端有核定位信号、Cyclin A结合域、APC destruction motif等，在C端有核输出序列等重要功能域(Laurie M.Delmolino，Partha Saha，Anindya Dutta.Multiple Mechanisms RegulateSubcellular Localization of Human CDC6.J biol chem 2001；276(29)：26947-26954)。当细胞进入G1期时，CDC6入核并与结合在染色体上的起始位点识别复合物结合，然后募集其他复制起始因子如MCM2～7、Cdt1、Cdc45等形成复制前体(prereplication complex，pre-RC)。在G1末期，CDC6的54、74和106为的丝氨酸残基被Cyclin A-CDK2磷酸化，磷酸化的CDC6从复制前体中脱离，DNA复制开始。而被磷酸化的CDC6蛋白在其核输出序列和其他因子的共同“引导”下出核进入到胞浆，并在依赖泛素的途径被降解，以确保每个细胞周期中DNA只复制一次(Niels Mailand，John F.X.Diffley.CDKs Promote DNAReplication Origin Licensing in Human Cells by Protecting Cdc6 from APC/C-DependentProteolysis.Cell 2005；122(6)：915-926)。CDC6作为一种与DNA复制相关的蛋白质，在肿瘤的发生发展中也发挥着重要的作用。越来越多的研究发现CDC6在许多肿瘤如鳞状宫颈细胞上皮癌等中高表达，因此可以利用CDC6来作为肿瘤发生以及肿瘤分级的标记物(Murphy N，Ring M，Heffron CC，et al.p16INK4A，CDC6，and MCM5：predictivebiomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer.J Clin Pathol2005；58(5)：525-534)。

经对现有技术的国内外文献和专利检索，至今未见有任何CDC6基因多态性位点与原发性肝癌易感性相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于揭示CDC6基因启动子区的一个单核苷酸多态位点与原发性肝癌的易感性，以及该多态在筛选原发性肝细胞癌易感人群方面的用途。

本发明首先提供一种检测细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区多态的方法，包括以下步骤：

(a)确定细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区的SEQ ID NO：1所示序列的第266位SNP的核苷酸；

(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态，即在第266位存在A，在其DNA互补链上为T等位位点。

本发明采用的具体方法如下：

(1)确定CDC6基因启动子区rs4134994的单核苷酸多态，即SEQ ID NO：1所示序列中第266位的核苷酸(标注为S)，分别为A或者G；

(2)采用聚合酶链式反应—单链构象多态性的分子生物学技术检测样品中上述位置是否存在单核苷酸多态及其类型。

本发明的第二方面是提供一种分离核酸，具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第266位为A。

SEQ ID NO：1

AIAATTCCCTCCCCATGATGTGTGGATTAATGGTAAGAAGATGCACAGAACATAATATTC     60

TTAGGTTGAACGAAATAAAAGTAAAGAGTTGGCTCTGTTTCTCACCTTTGAAGCACAAAT     120

CAAGAGATACTATGATGAAGCATAGTTTTTCTTTATATAGGTGTGTAGAACTTTACCATA     180

AAAATCACTAGTTCAGCCATCAGGAGATCTGGATCCTAGGCTCTTCACTGTCACCAAGAT     240

GCTGTGACCTCTAACCTTGTATAGASGTTTGCTTTGTACTTTGCGAGGTTGAGCATTAGA     300

GAGGTAAGGAAAGTGCCTAGCATCATACCTGGCGCACAGAACCCAAAACGGTAGGTATCA     360

TGTAGCAGTTCTGAAAATCTAGCCCATCAGGATGATGCAAATGGGTACTTTAGGCAGTGA     420

GAAGGGGAACCACATCTTGACACTTCCAGTCGAAGGAAGAGTGCGACTGCGCGGCAGCAA     480

AGACTACGCCTCCCAGCGTGCTTTGCGGCGGGCCGGCCCGCTTTACCCAGAGTCGCCCTG     540

CCGCAATCGCGCGTCTTTCCACCGAGGCCCCGGATGTAGATTCCCTCCCCCGTTCAGTGG     600

TCGTGGCCTCACAGCGACTCTAAGACTTGGGGCTCTCTCATTGGCTGTAACTCTTCCACT     660

GGATTGGTAGCAAAAAAAGAGGCGGTGCCCAAGGCGAAAGGCTCTGTGACTACAGCCAAT     720

CAGAATCGAGGCCGGGCTTTGGCGGGAGGTGGGAACGCTGTGGCCATTCGGATTTGGCGC     780

本发明的第三个方面提供了一种等位基因特异性的核酸引物，具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示序列，且特异性地扩增出含细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区的SEQ ID NO：1所示序列中第266位单核苷酸多态的扩增产物。

优选的核酸引物的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示，长度各为22bp，能特异性的扩增出SEQ ID NO：1所示的序列，该序列包含rs4134994单核苷酸多态。

本发明的第四个方面还提供了一种诊断原发性肝细胞癌的试剂盒，包括：

(a)具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列，且特异性扩增细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区DNA片段的引物对；

(b)检测扩增产物与正常的细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区相比是否存在变化所需的试剂，即所述的SEQ ID NO：1所示序列中第266位单核苷酸多态。

利用本发明所提供的与原发性肝细胞癌相关的其多态位点的核酸序列，可构建对原发性肝细胞癌易感人群进行遗传学筛选的试剂盒；将其作为药物设计的靶点，找出具有调节CDC6基因表达的活性分子，从而促进新的抗肿瘤药物的发现。

附图说明

图1为测序结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明。需要注意的是，以下实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：收集血液样本及提取基因组DNA

从广州中山大学附属肿瘤医院采集到散发性的原发性肝细胞癌患者标本514份，平均年龄48.6±11.8岁(标准差)，其中44例为女性。所有病例均为在该肿瘤医院就诊的患者，按照世界卫生组织标准确诊为原发性肝细胞癌。对照样本为来自广东省无血缘关系的健康个体509例，平均年龄46.2±14.0岁(标准差)，其中包括女性标本45例。

用常规方法从上述收集到的血液标本中分离出白细胞，并用酚氯仿法提取白细胞基因组DNA后，将样品DNA统一稀释为10ng/ul，作为DNA模板。

实施例2：设计核苷酸引物序列，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增

PCR反应在MJ PTC-200PCR仪器上进行。

PCR反应体系及程序如下：

每个样品进行一个总体积为20ul体系的扩增反应，体系中包含制备的基因组DNA稀释液20ng，10×Taq Buffer 2ul，5mM dNTP 0.8ul，25mM MgCl₂ 1.6ul，0.25个单位的Taq DNA聚合酶和扩增引物(稀释至10uM)各0.5ul，最后加入ddH₂O将总体积配为20ul。反应在94℃预变性2分钟后，进行35个94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒的扩增循环，最后进行72℃6分钟的补平。

扩增引物如下：

正向引物：5′-CTAGGCTCTTCACTGTCACCAA-3′(SEQ ID NO：2)

反向引物：5′-GACTGGAAGTGTCAAGATGTGG-3′(SEQ ID NO：3)

扩增后得到了CDC6基因启动子区236bp包含单核苷酸多态rs4134994的DNA序列。

实施例3：对扩增得到的DNA序列进行单核苷酸多态分型

对实施例2中所得到的产物，采取单链构象多态性(SSCP)进行基因多态分型。具体方法为：1μl PCR产物加4μl上样缓冲液(98％去离子化甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.1％二甲苯青，0.1％溴酚蓝)，95℃变性10分钟，置冰上2分钟，迅速点样4μl于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Arc∶Bis＝37.5∶1)中，置4℃冰箱中电泳。1.5W恒功率电泳10小时，银染显色。对SSCP的结果进行测序验证，共发现GG、AG、AA三种基因型，部分测序结果见图1。

实施例4：CDC6基因启动子区单核苷酸多态位点rs4134994与原发性肝细胞癌的相关性分析

统计方法：利用GDA( http://hydrodictyon.eeb.uconn.edu/people/plewis/software.php)进行模拟次数为10000次的卡方分析，计算健康人群对照组标本的Hardy-Weinberg平衡。运用SPSS13.0专业统计学软件的卡方分析，对肝癌组和对照组标本中多态位点的基因型分布频率进行统计学分析，置信区间设定位95％(即95％CI)，统计学的显著性差异水平设定为p＜0.05，同时计算Odds Ratio(OR)值。统计结果如下：

健康对照组标本和原发性肝细胞癌病人组的rs4134994多态位点基因型及等位位点分布频率如下表所示：

分组	标本总数	基因型个数(频率％)			等位位点个数(频率％)
							病人对照	514509	AA251(48.8)201(39.5)	AG211(41.1)241(47.3)	GG52(10.1)67(13.2)	A713(69.3)643(63.2)	G315(30.7)375(36.8)
P-valueOR(95％CI)	0.009				0.0031.10(1.03＜OR＜1.17)

根据上表分布频率，对照组标本的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。从上表可见，位于CDC6基因启动子区的单核苷酸多态性位rs4134994的A等位位点，在原发性肝细胞癌患者群体中的分布频率显著性大于其在健康对照组群体中的分布频率(P＝0.003)，因此是原发性肝细胞癌易感的一个标志性位点。该位点的基因型为A/A时，受试者对原发性肝细胞癌易感；而该位点的基因型为A/G或G/G时，受试者对原发性肝细胞癌较为不易感。这一多态性位点位于CDC6基因的启动子部位，该多态的改变可能会影响转录因子与启动子的结合，从而影响CDC6基因的转录水平，进而影响细胞的增殖。

实施例5：检测试剂盒

制备检测原发性肝细胞癌易感性的试剂盒，其中含有下列寡聚核苷酸引物对，用于从检测对象的基因组样本中特异性扩增包含有CDC6基因启动子区单核苷酸多态位点rs4134994的基因组片断。

正向引物：5′CTAGGCTCTTCACTGTCACCAA 3′(SEQ ID NO：2)

反向引物：5′GACTGGAAGTGTCAAGATGTGG 3′(SEQ ID NO：3)

本发明具有实用性的例证：

(1)本发明所建立的方法可以快速简便地检测位于17q21区域CDC6基因启动子区单核苷酸多态性位点rs4134994的基因型，通过检测A等位基因的有无判断个体是否具有原发性肝细胞癌易感性，从而有利于原发性肝细胞癌的预防和治疗；

(2)利用rs4134994的A等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节CDC6基因表达水平的活性分子，促进新的抗肿瘤药物的发现；

(3)利用本发明提供的引物序列可以特异、高效的检测出SEQ ID NO：1所示的序列中第266位的多态性位点。

(4)利用本发明提供的肿瘤相关基因单核苷酸多态性的序列，构建对原发性肝细胞癌进行遗传学诊断的试剂盒；

(5)由于CDC6基因参与了与恶性增殖、凋亡等细胞活动失调相关的病理过程，因此本发明对今后深入研究CDC6与其他疾病的关系提供了经验和应用基础。

                         序列表

<110>中山大学

<120>一种与原发性肝癌相关的CDC6基因的单核苷酸多态位点及其应用

<160>3

<210>1

<211>780

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>(266)

<223>n＝a或g

<400>1

ataattccct ccccatgatg tgtggattaa tggtaagaag atgcacagaa cataatattc    60

ttaggttgaa cgaaataaaa gtaaagagtt ggctctgttt ctcacctttg aagcacaaat    120

caagagatac tatgatgaag catagttttt ctttatatag gtgtgtagaa ctttaccata    180

aaaatcacta gttcagccat caggagatct ggatcctagg ctcttcactg tcaccaagat    240

gctgtgacct ctaaccttgt atagangttt gctttgtact ttgcgaggtt gagcattaga    300

gaggtaagga aagtgcctag catcatacct ggcgcacaga acccaaaacg gtaggtatca    360

tgtagcagtt ctgaaaatct agcccatcag gatgatgcaa atgggtactt taggcagtga    420

gaaggggaac cacatcttga cacttccagt cgaaggaaga gtgcgactgc gcggcagcaa    480

agactacgcc tcccagcgtg ctttgcggcg ggccggcccg ctttacccag agtcgccctg    540

ccgcaatcgc gcgtctttcc accgaggccc cggatgtaga ttccctcccc cgttcagtgg    600

tcgtggcctc acagcgactc taagacttgg ggctctctca ttggctgtaa ctcttccact    660

ggattggtag caaaaaaaga ggcggtgccc aaggcgaaag gctctgtgac tacagccaat    720

cagaatcgag gccgggcttt ggcgggaggt gggaacgctg tggccattcg gatttggcgc    780

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：正向引物

<400>2

ctaggctctt cactgtcacc aa                                             22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：反向引物

<400>3

gactggaagt gtcaagatgt gg                                             22

Claims (6)

1、种检测细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区多态的方法，包括以下步骤：

(c)确定细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区的SEQ ID NO：1所示序列的第266位SNP的核苷酸；

(d)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态，即在第266位存在A，在其DNA互补链上为T等位位点。

2.一种分离核酸，具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第266位为A。

3.一种等位基因特异性的核酸引物，具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示序列，且特异性地扩增出含细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区的SEQ IDNO：1所示序列中第266位单核苷酸多态的扩增产物。

4.按权利要求3所述的一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于：所述的核酸引物的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

5.一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒，包括：

(a)具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列，且特异性扩增细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区的引物对；

(b)检测扩增产物与正常的细胞分裂周期蛋白CDC6基因启动子区相比是否存在变化所需的试剂，即所述的SEQ ID NO：1所示序列中第266位单核苷酸多态。

6.按权利要求5所述的原发性肝细胞癌诊断试剂盒，其特征在于：所述的引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。