CN1908188A - 一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因cyp1a2基因型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与药物代谢能力和肝癌高发区肝癌易感性相关联的基因CYP1A2基因型及其检测方法，以及检测CYP1A2与药物代谢表型或肝癌风险相关基因型的试剂盒及其使用。本发明为临床根据个体的CYP1A2基因型确定经由CYP1A2代谢药物的剂量提供了分子判据。此外，本发明为肝癌高发区高危个体的早期筛查和检出提供了新的遗传标记，为肝癌高发区肝癌的人群预防提供了新的遗传咨询内容。

Description

一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2基因型的方法

技术领域

本发明涉及药物代谢能力个体差异以及肝癌高发区肝癌易感性个体差异及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与药物代谢能力和肝癌易感性相关的基因CYP1A2的基因型检测方法；本发明进一步涉及上述与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用；本发明鉴定了导致CYP1A2低体内酶活性的CYP1A2基因型，从而涉及在临床个体化用药中的应用；本发明还确定了CYP1A2为肝癌高发区肝癌的一个新型易感基因，从而涉及对肝癌高危个体进行早期筛查和化学预防以及遗传咨询中的应用。

背景技术

CYP1A2是细胞色素P450家族的重要成员，参与多种药物和环境致癌物如黄曲霉毒素B1的代谢。大量的体内外研究结果表明，人群中CYP1A2的表达和活性存在很大的个体差异，如肝脏中个体间CYP1A2 mRNA的表达水平相差可达40倍之多。此外，CYP1A2的活性还存在显著的地域或种族差异。例如，高加索女性体内CYP1A2的活性显著高于中国女性和黑人女性。也有研究发现，在中国人群和非洲人群中，CYP1A2的体内活性存在二态甚至是三态分布的现象，即有一部分个体分别表现出极高或极低的CYP1A2活性。CYP1A2体内活性的差异可能是造成个体或种族间药物反应性和机体对某些疾病如黄曲霉毒素B1暴露相关的肝癌、结肠癌、膀胱癌和睾丸癌等遗传易感性差异的重要原因之一。

对双生子进行研究的结果表明，CYP1A2的体内活性主要由遗传因素决定，遗传度为0.75。目前，有多项研究对CYP1A2基因的功能性SNP进行了发掘和功能相关性研究。研究表明，CYP1A2 G-3860A(国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP1A2*1C)、C-163A(国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP1A2*1F)和C-729T位点多态性与CYP1A2的体内活性或诱导性相关。然而，这些多态性尚不能完全解释人群中CYP1A2活性的个体差异。因此，CYP1A2基因总的遗传变异模式及个体间CYP1A2活性个体差异的遗传机制还有待进一步的研究。

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是严重影响人类健康的重要的恶性肿瘤，在肿瘤引起的人类死亡中位居第五。据估计，世界上每年约有50～100万例新发病例。不同的国家和地区肝癌的病因和发病率差异显著。我国是世界范围内有名的肝癌高发区，约50％的肝癌病例来自中国。目前的流行病学研究资料表明，慢性乙型肝炎(HBV)感染和食物中黄曲霉毒素的污染是我国肝癌高发重要的风险因素。此外，在肝癌的发生发展过程中，HBV感染和黄曲霉毒素的暴露之间存在协同作用。

然而，在肝癌高发区，即使暴露于相同水平的风险因素，也只有一部分个体最后发展成肝癌。这表明遗传因素在肝癌的病因和发病过程中起重要的作用。黄曲霉毒素中致突变作用最强的是黄曲霉毒素B1(AFB1)，而AFB1致肝癌的作用首先需在肝脏经药物代谢酶细胞色素P450超家族成员代谢活化生成具有遗传毒性的活性代谢产物AFB1-8，9-环氧化物(AFB1-8，9-epoxide，AFBO)。有研究表明，人群中生成AFBO的能力和使AFBO解毒生成无毒代谢产物的能力存在较大的个体差异，而这种差异可能是导致HCC易感性个体差异的重要原因。事实上，在多个人群中进行的病例-对照研究业已证明，多种编码AFBO解毒酶的基因如EPHX1、EPHX2、GSTM1和GSTT1的遗传多态性与血浆AFB1-白蛋白加合物水平或肝癌的易感性相关。然而，目前尚没有有关AFB1代谢活化酶基因多态性与肝癌遗传易感性关联的研究报道。

人体内AFB1的生物转化是一个多途径的复杂过程。大量的证据表明，在与饮食暴露相关的低AFB1底物浓度时，CYP1A2是AFB1的一种高亲和力酶，参与95％以上AFB1的生物活化。除了参与AFBO的生成，CYP1A2同时也催化AFB1生成无遗传毒性的代谢产物AFM1。研究表明，尿液中AFM1的排出量与患HCC的风险存在剂量依赖关系。奥替普拉是一种具有肝癌化学预防潜在价值的治疗血吸虫的药物。研究表明，其化学预防肝癌的作用部分是通过抑制体内CYP1A2的活性而实现的。由于CYP1A2在AFB1的代谢活化和I相解毒中起重要的作用，因此，CYP1A2是影响与AFB1暴露有关的肝癌遗传易感性重要的候选基因。

广西壮族自治区扶绥县是全世界有名的肝癌高发区。流行病学研究资料表明，该县居民的食物中普遍存在高水平的AFB1污染，而90％左右的居民的尿液中可以检测到AFB1的代谢产物。抑癌基因p53 G249T颠换是AFB1暴露相关的肝癌癌组织中一种特异性的DNA突变，而扶绥及其周边县市约60％肝癌患者病理组织中可以检测到这种突变。所有的这些迹象均表明，AFB1是该县肝癌发生重要的风险因素。

本发明的目的是系统筛查CYP1A2基因的单核苷酸多态性(SNP)，并通过研究CYP1A2基因型与CYP1A2特异性的探针药物咖啡因代谢表型间的关系，研究中国人群中CYP1A2基因常见的多态与CYP1A2体内活性的关系，最后通过病例-对照研究，研究CYP1A2的遗传多态性与我国肝癌高发区广西壮族自治区扶绥县肝癌遗传易感性的关系。

发明内容

发明人系统筛查了CYP1A2基因的SNP，继而考察了CYP1A2基因的G-3113A、G-3113A和T5347C多态位点与CYP1A2体内活性的关系，以及CYP1A2多态位点G-3860A、G-3113A和T5347C与我国广西壮族自治区扶绥县肝癌遗传易感性的关系。通过基于探针药物的CYP1A2基因型与表型关系的研究，鉴定了CYP1A2-3113A等位基因与CYP1A2体内低酶活性相关，通过病例-对照研究，判明-3860位为GG基因型同时在-3113和5347位分别为GG和CC基因型(或基因型为CYP1A2-3860G/-3113G/5347C单倍型纯合子)的个体具有更高的肝癌易感性。因此本发明鉴定了与CYP1A2体内低酶活性或药物低代谢能力相关的CYP1A2SNP位点，以及肝癌高发区肝癌的一种新的易感基因和易感基因型。

本发明还提供了一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关的基因CYP1A2 SNP位点G-3860A、G-3113A和T5347C的基因分型方法，该方法为聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法。

本发明还提供了一种通过检测CYP1A2 G-3113A位点的基因型来判定个体对经由CYP1A2代谢的药物代谢能力是否降低的方法。

本发明还提供了同时对与肝癌易感性相关联的基因CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C三个多态位点进行检测，以判定个体是否对肝癌易感的检测方法。

本发明还提供了用于检测CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C三个SNP位点基因型的引物共6条。

本发明进一步提供了一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因的CYP1A2G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点基因分型的试剂盒，以及上述试剂盒在人群药物代谢能力检测、肝癌高危个体早期筛查和化学预防中的应用。

一、如上所述，本发明提供了一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C SNP位点基因型的方法，该方法为PCR-RFLP法。具体的说，包括了如下步骤：

1)对CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点所在基因组区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行PCR扩增；

2)对G-3860A位点、G-3113A位点和T5347C位点的PCR产物分别以限制性内切酶BseLI、HpyCHIV(或其同功酶Tai I)和Eco57 I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化后产物的带型，以此判明CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点的基因型。

二、本发明还提供了与药物代谢能力降低相关联的CYP1A2 SNP位点，即携带CYP1A2-3113A等位基因的个体CYP1A2的体内活性和药物代谢能力降低。并提供了一种通过检测CYP1A2基因G-3113A位点的基因型来判定个体对经由CYP1A2代谢的药物其药物代谢能力是否降低的方法。该方法包括：

1)对CYP1A2基因G-3113A位点所在基因组区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行PCR扩增；

2)对G-3113A位点PCR产物以限制性内切酶HpyCHIV或Tai I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明CYP1A2基因G-3113A位点的基因型。

3)当在某一个体携带CYP1A2-3113A等位基因时，该个体体内CYP1A2的活性可能降低，而对经由CYP1A2代谢的药物的代谢能力可能下降。

三、另一方面，本发明还提供了与高发区肝癌遗传易感性相关联的一个易感基因型，即CYP1A2-3860G/-3113G/5347C单倍型纯合子基因型为肝癌高发区肝癌的易感基因型。并提供了一种通过检测CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C位点的基因型来判定人群或个体对肝癌是否易感的方法。该方法包括：

1)对CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点所在基因组区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行PCR扩增；

2)对G-3860A位点、G-3113A位点和T5347C位点PCR产物分别以限制性内切酶BseLI、HpyCHIV或Tai I和Eco57 I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点的基因型。

3)当在肝癌高发区某一个体CYP1A2的基因型表现为-3860G/-3113G/5347C单倍型纯合子基因型，或-3860位点为GG基因型同时在-3113和5347位点分别为GG和CC基因型时，该个体患肝癌的可能性更大。

四、检测CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的特异性引物对的序列分别为：

1)CYP1A2 G-3860A位点：正向引物见序列表中序列1；反向引物见序列表中序列2

2)CYP1A2 G-3113A位点：正向引物见序列表中序列3；反向引物见序列表中序列4

3)CYP1A2 T5347C位点：正向引物见序列表中序列5；反向引物见序列表中序列6

五、本发明进一步提供了一种用于检测与药物代谢能力和肝癌遗传易感性相关联的基因CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(共3对)，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶，例如，Ex Taq DNA聚合酶、HotStar Taq酶Klenow片段、Tth DNA聚合酶和VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。在PCR产物的RFLP分析中，该试剂盒可含有Bsel I、HpyCHIV(或Tai I)和Eco57 I内切酶及其缓冲液，显示G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的Bsel I、HpyCH IV(或Tai I)和Eco57I酶切图谱等。

使用方法说明如下：

1)PCR扩增

对样品基因组DNA(具体制备方法参见实施例1)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增：15μl反应体系，其中包括20～100ng基因组DNA，正向和反向引物各0.2μM，0.2mM dNTP，0.5U Ex Taq DNA聚合酶以及1×缓冲液(TaKaRa，含1.5mM MgCl₂)。95℃ 2min预变性后进行2个阶段的PCR扩增，两个阶段的变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 40s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62.0℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55.5℃，最后在72℃延伸7min。特异性PCR产物以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，G-3860A、G-3113A和T5347C位点PCR产物大小分别为590bp、488bp和438bp。

2)RFLP分析

对上述经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，在10μl反应体系中进行限制性内切酶切割消化。对于G-3860A位点，3μl PCR产物，1.5U Bsel I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，55℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：590bp的PCR产物以Bsel I限制性内切酶消化后，G/G基因型被切成生成长度分别为370bp和220bp的两个片段，而AA基因型因为不含Bsel I酶切位点，因此酶切后只出现590bp一个条带，A/G基因型590bp、370bp和220bp三个条带均出现(电泳图详见说明书附图1)。对于G-3113A位点，3μl PCR产物，1.5U HpyCHIV或Tai I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，37℃(Tai I为65℃)恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：488bp的PCR产物以HpyCH IV或Tai I限制性内切酶消化后，G/G基因型被切成生成长度分别为318bp和170bp的两个片段，而AA基因型因为不含HpyCH IV(或Tai I)酶切位点，因此酶切后只出现488bp一个条带，A/G基因型488bp、318bp和170bp三个条带均出现(电泳图详见说明书附图2)。对于T5347C位点，3μl PCR产物，1.5U Eco57 I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，37℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：438bp的PCR产物以Eco57 I限制性内切酶消化后，C/C基因型被切成生成长度分别为325bp和113bp的两个片段，而TT基因型因为不含Eco57 I酶切位点，因此酶切后只出现438bp一个片段，C/T基因型438bp、325bp和113bp三个片段均出现(电泳图详见说明书附图3)。

五、本发明还提供了与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点的检测方法及其在药物代谢和肝癌高发区人群肝癌高危个体早期筛查和化学预防中的应用。例如，由于本发明证实了CYP1A2基因G-3113位点多态与CYP1A2体内低酶活性和药物代谢能力相关联，而单倍型-3860G/-3113G/5347C纯合子基因型与高发区肝癌患病风险的增高有关。因此，在临床应用经由CYP1A2代谢的药物进行治疗时，需根据G-3113A位点的基因型调整用药剂量，从而达到减少毒副作用发生、提高药物疗效的目的；而在肝癌高发区肝癌的预防和控制中，就需对所咨询对象CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C三个SNP位点的基因型同时进行分析，以判断该对象是否携带与肝癌易感性增高相关的基因型-3860G/-3113G/5347C单倍型纯合子基因型。对基因型为CYP1A2-3860G/-3113G/5347C单倍型纯合子(表现为对肝癌具有更高的易感性)的个体，则可对之进行科学的干预，包括早期和定期进行肝癌筛查、并采取化学预防等措施，这样可以针对性地降低肝癌高发区这些易感人群的肝癌风险。

附图说明

图1.限制性内切酶Bsel I(购自NEB公司)消化G-3860A位点590bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道1、3、4、6和8(自左向右)：G/G基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为370bp和220bp的两个条带；泳道2：A/G基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为590bp、370bp和220bp的三个条带；泳道5和7：A/A基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为590bp的一个条带，泳道9为标准分子量参照物DL2000(购自TaKaRa公司)。

图2.限制性内切酶HpyCHIV(购自NEB公司)消化G-3113A位点488bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道1和4-8(自左向右)：G/G基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为318bp和170bp的两个条带；泳道3：A/G基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为488bp、318bp和170bp的三个条带；泳道2：A/A基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为488bp的一个条带，泳道9为标准分子量参照物DL2000。

图3.限制性内切酶Eco57 I(购自NEB公司)消化T5347C位点438bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道1、2、5和7(自左向右)：C/C基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为325bp和113bp的两个条带；泳道2：C/T基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为438bp、325bp和113bp三个条带；泳道5和7：T/T基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为438bp的一个条带，泳道9为标准分子量参照物DL2000。

实施例

实施例1

该实施例设计并合成了一套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C三个SNP位点基因型的方法。

1、基因组DNA的提取

采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。

1)取柠檬酸钠或EDTA-Na₂抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；

2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4℃ 2000rpm离心20分钟；

3)缓慢倾倒上清，沉淀加入冰预冷的0.1％ Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；

4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10％ SDS至终浓度为0.5％，混匀；

5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml，混匀，55℃ 3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳)；

6)加入6M NaCl 1.2ml，剧烈振荡20秒，2,200rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；

7)加入2倍体积冰预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，挑出DNA沉淀至另一Eppendorf管；

8)以冰预冷的75％的乙醇洗涤DNA沉淀2次；

9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测定260/280nm OD比值和DNA的浓度。

2、PCR扩增

用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增：15μl反应体系为：20～100ng基因组DNA，正向引物和反向引物各0.2μM，0.2mM dNTP，0.5U Ex Taq DNA聚合酶以及1×缓冲液(TaKaRa，含1.5mM MgCl₂)。95℃ 2min预变性后进行2个阶段的扩增，两个阶段的变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62.0℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55.5℃。最后在72℃延伸7min。特异性PCR产物以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，G-3860A、G-3113A和T5347C位点PCR产物大小分别为590bp、488bp和438bp。

3、RFLP分析

对上述经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，在10μl反应体系中分别用如下条件进行限制性内切酶切割消化：对于G-3860A位点，3μl PCR产物，1.5U Bsel I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，55℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：590bp的PCR产物以Bsel I限制性内切酶消化后，G/G基因型被切成生成长度分别为370bp和220bp的两个片段，而AA基因型因为不含Bsel I酶切位点，因此酶切后只出现590bp一个条带，A/G基因型590bp、370bp和220bp三个条带均出现(电泳图详见说明书附图1)。对于G-3113A位点，3μl PCR产物，1.5U HpyCHIV(或Tai I)，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，37℃(TaiI内切酶为65℃)恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：488bp的PCR产物以HpyCH IV(或Tai I)限制性内切酶消化后，G/G基因型被切成生成长度分别为318bp和170bp的两个片段，而AA基因型因为不含HpyCHIV(或Tai I)酶切位点，因此酶切后只出现488bp一个条带，A/G基因型488bp、318bp和170bp三个条带均出现(电泳图详见说明书附图2)。对于T5347C位点，3μl PCR产物，1.5U Eco57 I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，37℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，从而进行基因型读取和判定。基因型区分的依据是：438bp的PCR产物以Eco57 I限制性内切酶消化后，C/C基因型被切成生成长度分别为325bp和113bp的两个片段，而TT基因型因为不含Eco57 I酶切位点，因此酶切后只出现438bp一个片段，C/T基因型438bp、325bp和113bp三个片段均出现。

实施例2

该实施例利应用实施例1建立起来的方法，在419名健康的中国人群中对CYP1A2G-3860A、G-3113A和T5347C位点进行了基因分型，并观察了三个位点的基因型与血浆咖啡因代谢比值或CYP1A2体内活性之间的关系。

1.试验对象：

419名(男性237名，女性182)年龄为18～33岁(平均年龄20±2岁)的健康受试者参与了本试验。所有的受试者均为中南大学的在校学生。所有受试者均为非吸烟个体，在进行咖啡因代谢率检测前1周之内未曾摄入咖啡、茶、可口可乐、巧克力以及其它含咖啡因的饮料。同时，所有的受试者试验前1周之内未曾服用任何药物，包括避孕药。整个实验过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了所有受试者的知情同意。

2.受试者CYP1A2体内活性的测定

以咖啡因为探针药物，对所有受试者CYP1A2的体内活性进行测定。受试者晨起(7:00～8:00Am)空腹口服咖啡因胶囊100mg。分别在服药前(0小时)和服药后5小时抽取静脉血5ml，用EDTA抗凝。离心分离血浆和血细胞，并保存于-20℃，分别用于进行咖啡因代谢表型的测定和DNA的提取。应用高效液相色谱-紫外检测法对血浆中咖啡因(137X)及其代谢产物1，7-二甲基黄嘌呤(17X)的浓度进行测定。具体方法为，0.5ml待测血浆中加入80μM的β-羟乙基茶碱(作为内标)100μl和300mg硫酸胺，然后加入5ml氯仿：异内醇(体积∶体积，9∶1)，振荡2分钟后于2000g离心5分钟，取下层有机相于37℃在氮气下挥干，50μl流动相重新溶解，取20μl上色谱柱。高效液相色谱系统包括Agilent 1100系列、C18色谱柱(250mm×4mm，颗粒直径为5μm)。流动相的组成包括甲醇(A)、0.05％的醋酸(B)和乙腈(C)。采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗出条件为：0-8分钟A∶B∶C的体积比为10∶82∶8，流速为0.75ml/min；8-12分钟A∶B∶C的体积比为10∶78∶12，流速为1ml/min，柱温恒定在45℃。紫外检测的波长为282nm。以口服咖啡因100mg后第5h血浆17X与137X浓度比值的对数值作为反应CYP1A2体内活性的指标。

3.CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的确定及三个SNP位点的基因型与CYP1A2体内活性的关系

419个健康中国人群中CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型的分布情况如表1所示。应用方差分析的统计学分析结果表明，CYP1A2 G-3113A位点不同基因型间血浆中咖啡因的代谢比值或CYP1A2的体内活性存在显著的差异，主要表现为该位点携带-3113A等位基因的个体CYP1A2的体内活性显著降低。因此，本发明的方法鉴定了CYP1A2基因的G-3113A位点与CYP1A2低体内酶活性相关。

表1.中国人群CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型与CYP1A2体内活性的关系

多态位点	基因型	例数(％)a	Lg(17X/137X)	P值
					G-3860AG-3113AC5347T	G/GA/GA/AG/GA/GA/AC/CC/TT/T	256(61.5)140(33.7)20(4.8)332(80.2)79(19.1)3(0.7)302(72.9)104(25.1)8(1.9)	-0.29±0.16b-0.29±0.15c-0.36±0.16-0.29±0.16d-0.32±0.16e-0.45±0.05-0.30±0.16-0.28±0.15-0.19±0.15f	0.1760.0380.068

^a由于PCR失败，每个位点总人数少于419；与相应的GG基因型相比较，^bp＝0.064，^cp＝0.078；与相应的AA基因型相比较，^dp＝0.036，^ep＝0.096；与相应的CC基因型相比较，^fp＝0.052。

实施例3

该实施例应用实施例1建立起来的方法，对来自广西壮族自治区扶绥县及其周边县市的431例肝癌患者和550例对照DNA标本CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型和单倍型组合基因型进行了分析。

1、试验对象：

自2003年6月至2004年12月，我们在扶绥县肝癌研究所和广西壮族自治区肿瘤医院(距扶绥县城约40公里)收集了肝癌病例标本共计431例。广西壮族自治区肿瘤医院的大部分病例来自扶绥县及周边县市。肝癌病例的诊断依据包括：89例(20.6％)经组织病理确诊，247例(57.3％)为影象学诊断(B超检查和/或CT扫描)阳性同时伴有血清甲胎蛋白升高，95例(22.0％)为影象学诊断(B超检查和CT扫描同时阳性)并结合临床症状。同时，在该县及邻县多个村庄中收集到无血缘关系的志愿者外周血标本550例，性别比例为1∶4(女∶男)。考虑到HBV感染是该地区肝癌高发重要的风险因素之一，为使病例组和对照组在HBV暴露方面尽量匹配，在对照标本的收集过程中，我们从另一肝癌早期筛查的项目中已确定为血清HBsAg阳性的志愿者中随机选取了部分个体作为对照。对照组受试者的入选标准包括：(a)经B超检查和血清甲胎蛋白检查排除了肝癌；(b)没有任何组织类型肿瘤病史。同时，我们对所有的病例和对照标本血清中HBV感染标志物(包括HBsAg、HBsAb、HbeAg、HbeAb和HBcAb)、丙肝抗体(anti-HCV)、谷丙转氨酶(Alanine transaminase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate Transaminase，AST)进行了测定。通过调查问卷，对所有受试者的性别、入选或肝癌诊断时的年龄、吸烟、饮酒史和一级亲属肝癌家族史等进行了登记。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了所有被募集对象的知情同意。

2.CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C三个位点构成的单倍型组合基因型的确定

对431例肝癌病例和550例对照人群CYP1A2基因G-3860A、G-3113A和T5347C三个SNP位点的基因型数据，用软件Phase 2.0进行单倍型的构建，确定每个个体的单倍型组合基因型。431例肝癌病例和550例对照人群CYP1A2基因由G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点基因型构成的单倍型组合基因型的频率分布如表2所示。在所有的病例和对照标本中，病例组单倍型-3860G/-3113G/5347C纯合子基因型的频率显著高于对照组(病例组和对照组中该基因型的频率分别为19.7％和14.8％，OR值为1.65，P＝0.014)；在血清HBsAg阴性人群中，病例组和对照组中单倍型-3860G/-3113G/5347C纯合子基因型的频率存在显著的差异(病例组和对照组中该基因型的频率分别为25.6％和13.5％，OR值为2.69，P＝0.002)；在吸烟人群中，病例组和对照组中单倍型-3860G/-3113G/5347C纯合子基因型的频率存在显著的差异(病例组和对照组中该基因型的频率分别为20.6％和14.4％，OR值为2.00，P＝0.017)。因此，用本发明的方法解析了CYP1A2基因由G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点构成的单倍型组合基因型与肝癌高发区肝癌的易感性的相关性，尤其是在血清HBsAg阴性人群和吸烟人群中与肝癌的易感性的相关性。

表2.肝癌病例组和对照组中CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C位点基因型构成的单倍型组合基因型的分布

单倍型组合基因型	病例组	对照组	OR值(95％CI)	P值
					所有个体(n＝966)其它单倍型组合-3860G/-3113G/5347C纯合子血清HBsAg阴性个体(n＝441)其它单倍型组合	338(80.3％)83(19.7％)64(74.4％)	462(85.2％)80(14.8％)307(86.5％)	1.00(Ref)1.65(1.11-2.46)1.00(Reference)	0.014

-3860G/-3113G/5347C纯合子血清HBsAg阳性个体(n＝522)其它单倍型组合-3860G/-3113G/5347C纯合子吸烟个体(n＝440)其它单倍型组合-3860G/-3113G/5347C纯合子不吸烟个体(n＝527)其它单倍型组合-3860G/-3113G/5347C纯合子

22(25.6％)274(81.2％)61(18.2％)135(79.4％)35(20.6％)207(81.2％)48(18.9％)

48(13.5％)155(82.9％)32(17.1％)231(85.6％)39(14.4％)231(84.9％)41(15.1％)

2.69(1.43-5.06)1.00(Reference)1.25(0.75-2.09)1.00(Reference)2.00(1.13-3.53)1.00(Reference)1.40(0.86-2.29)

0.0020.3980.0170.177

CI：可信限。通过执行非条件logistic回归分析检测关联，并对性别、年龄、吸烟史的有或无(吸烟分层分析除外)、喝酒史的有或无、HBV感染史的有或无(血清HBsAg携带状态分层分析除外)、HCV感染史的有或无以及一级亲属肝癌家族史的有或无进行了校正。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。

参考文献

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7.Gallagher EP，Kunze KL，Stapleton PL，Eaton DL.The kinetics of aflatoxin B1 oxidation byhuman cDNA-expressed and human liver microsomal cytochromes P450 1A2 and 3A4.ToxicolAppl Pharmacol 1996；141：595-606.

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9.Guillouzo A.Inhibition of CYP1A2 and CYP3A4 by oltipraz results in reduction of aflatoxinB1 metabolism in human hepatocytes in primary culture.Cancer Res 1995；55：5574-5579.

                             序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

     中南大学药学院              广西壮族自治区肿瘤防治研究所

<120>一种检测与药物代谢能力和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2基因型的方法

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GAACACAACG GGACTTCTTG                                20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GGATTACGCT CCTTCTCCTT                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TCCCACCAAC AAACCATAAC                               20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GGATCAACCT GTGAAGATGC                              20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

AGGTCCCATC TCCTCTGTTC                        20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

GCACTTGGCT AAAGCTGCTA                        20

Claims (8)

1.一种检测与药物反应性和肝癌易感性相关的基因CYP1A2基因型的方法，该方法为PCR-RFLP，即聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析，其特征包括以下2个方面：

1)对CYP1A2 G-3860A(国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP1A2*1C)、G-3113A和T5347C(国际细胞色素P450命名委员会命名为CYP1A2*1B)多态位点所在的基因组序列，分别设计基因特异性的分型引物，

G-3860A位点的引物序列为：正向引物见序列表中序列1，反向引物见序列表中序列2；

G-3113A位点的引物序列为：正向引物见序列表中序列3，反向引物见序列表中序列4；

T5347C位点的引物序列为：正向引物见序列表中序列5，反向引物见序列表中序列6；

2)对人类CYP1A2基因包含G-3860A、G-3113A和T5347C多态位点的5′端转录调控区和第7外显子，以所设计的3对引物，通过聚合酶链反应，以基因的特异性引物进行基因组DNA的扩增。

2.如权利1中所述的检测与中国人群药物反应性和肝癌易感性相关联的基因CYP1A2基因型的分型方法，其特征在于检测G-3860A、G-3113A和T5347C三个多态位点基因型的引物对，其中检测G-3860A位点基因型的引物序列为：正向引物为序列表中的序列1，反向引物为序列表中的序列2；检测G-3113A位点基因型的引物序列为：正向引物为序列表中的序列3，反向引物为序列表中的序列4；检测T5347C位点基因型的引物序列为：正向引物为序列表中的序列5，反向引物为序列表中的序列6。

3.一种通过检测药物代谢酶基因CYP1A2基因多态性判定个体对经由CYP1A2代谢的药物代谢能力的方法，其特征在于当所述基因表现为CYP1A2-3113A时，则表明该个体对经由CYP1A2代谢的药物的代谢能力下降，因而需要减少用药剂量。

4.一种通过检测编码参与黄曲霉毒素B1代谢活化酶基因CYP1A2基因型判定个体对肝癌易患性的方法，其特征在于所述基因-3860位为GG基因型，同时在-3113位和5347位分别为GG基因型和CC基因型时，或该基因的基因型表现为-3860G/-3113G/5347T单倍型纯合子时，则表明该个体肝癌的易患性增加。

5.一种与药物代谢能力和肝癌患病风险相关联的基因CYP1A2基因型的检测试剂盒，其中包括对CYP1A2 G-3860A、G-3113A和T5347C三个多态位点进行基因分型的引物6条；dNTP；用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种；用于CYP1A2 G-3860A多态位点限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶BseL I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱；用于CYP1A2 G-3113A多态位点限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶HpyCHIV或Tai I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱；用于CYP1A2 T5347C多态位点限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶Eco57 I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱。

6.如权利要求1-3和权利要求5中任一项所述的方法或试剂盒在临床上确定个体用药剂量中的应用。

7.如权利要求1-2和权利要求4-5任一项所述的方法或试剂盒在肝癌高发区进行肝癌高危个体的早期筛查和遗传咨询中的应用。

8.如权利要求1-2和权利要求4-5任一项所述的方法或试剂盒在肝癌高发区肝癌化学预防措施采取中的应用。

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