CN105039582B - 一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒 - Google Patents
一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，该试剂盒由先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测芯片、多重PCR所需要的探针、多重PCR反应液及该试剂盒杂交液与洗脱液构成，检测探针具有如SEQ ID No：1‑42所示的序列，多重PCR引物具有如SEQ ID No：43‑58所示的序列。本发明提供的试剂盒，采用芯片技术进行突变位点检测，不仅可以同时对多个突变位点进行筛查和检测，引物和探针的设计和布局，极大地提高临近位点基因型判断的准确性，不仅能够对mtDNA上多个耳聋相关突变位点进行同时筛查检测，同时能够极大的提高特异性检测。
Description
技术领域
本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及先天性和易感性耳聋基因SNP检测固相芯片、探针及相关的检测试剂盒。
背景技术
耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，严重影响人们的身心健康和生活质量。2006年第二次残疾人抽样调查显示，我国现有听力言语残疾人口约2780万，其中7岁以下聋哑儿童达80万人，且每700-1000个新生儿中就有1例聋儿。耳聋可分为非综合征型耳聋和综合征型耳聋，其中约70％的患者为非综合征型耳聋，即仅表现为单一听力障碍的临床症状；而综合征型耳聋除听力障碍外，往往伴有其他异常临床症状。环境因素和遗传因素均可引起耳聋。其中，20-30％的耳聋患者有氨基糖甙类抗生素的用药史，如庆大霉素、链霉素、卡那霉素和新霉素等；超过50％的耳聋患者具有遗传基础或遗传易感体质，表现为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传和母系遗传。母系遗传是线粒体的一种遗传方式，即子代的线粒体基因组几乎全部来自母方。研究发现线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变是导致耳聋的重要分子基础之一。
1992年，vanden Ouweland JM等报道了第一个与综合征型耳聋(糖尿病伴耳聋)相关的线粒体MT-TL1A3243G突变。目前，在mtDNA上已明确20余种突变可导致听力障碍，突变形式主要有点突变和Indel，大多发生在rRNA和tRNA基因上。较常见的综合征型耳聋相关的mtDNA突变有MT-TL1A3243G、T3291C及MT-TK A8344G等。引起非综合征型耳聋的突变则主要位于MT-TS1基因上，包括A7445G、7472insC、T7511C及T7505C等突变。此外，位于MT-RNR1基因的A1555G和C1494T突变是导致氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合型耳聋的重要原因之一，约占我国耳聋人群的3％。携带这两个突变的个体对氨基糖甙类抗生素的耳毒性作用表现出高度敏感，导致临床上常见的“一针致聋”现象。通过对这些携带易感基因突变患者及其家属的早期检查，可以预见哪些个体有耳毒性的危险，有效降低耳毒性药物致聋风险，对其他未发病的母系成员具有预防意义。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于控制和预防线粒体相关耳聋的发生有着极其重要的作用。
近年来，国内相继报道了先天性耳聋基因或者易感性耳聋基因的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对耳聋相关基因突变进行广泛筛查的需要，如苏州州立医院于2011年申请了的中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法(公告号：CN 102618624 B)，该发明是一种针对一种这对中国人群耳聋基因常见的14个突变位点的筛查试剂盒，其主要针对每个突变位点设计扩增引物和延伸引物，对目的区段同时进行多重PCR和标记延伸，通过毛细管电泳分析获得突变位点基因型。该方法具有操作简单、通量高，成本低等特点。该试剂盒所采取的方法，虽然在一定程度上可以解决特定突变位点的筛查工作，但是针对临近位点基因型，突变位点判断不准确的特点限制了它无法满足临床实际应用的需要，特别是针对实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，限制了其广泛性应用。无锡中德美联生物技术有限公司于2013年申请了一种遗传性耳聋基因荧光检测试剂盒(公告号：CN103352080 B)，该发明是一种可以同时检测四个耳聋相关基因中的17个热点突变的检测试剂盒。其采用的主要方法是荧光标记引物和ARMS-PCR，采用多重PCR体系进行检测，该方法具有快速、简效的特征。但是该试剂盒除了上述提及的问题外，由于采用四色荧光标记，在仪器需求上增加了难度。2012年上海交通大学发明了非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法(公告号：CN 102719538 A)该方法采用基于链接酶检测反应与通用芯片技术相结合的分型方法，针对人群中遗传性耳聋的8个热点突变位点进行检测，虽然该方法检测特异性以及稳定性非常好，但是相对来说操作复杂，除了需要进行多重PCR反应外，还需要进行连接酶反应。上述涉及的专利仅包含个别耳聋相关mtDNA突变，而目前针对mtDNA突变相关耳聋的检测试剂盒，则主要关注A1555G和C1494T突变，如戴朴等人研发的《母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法及其试剂盒》(公开号：CN1490415)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因A1555G突变的探针及其用途》(公开号：CN1987462)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的Taqman MGB探针及其用途》(公开号：CN1987463)。这些检测方法虽然在一定程度上降低了成本，但操作步骤还不够简便，且无法满足对mtDNA实现多个变异位点的联合检测。
发明内容
针对以上耳聋试剂盒及检测技术存在的问题，本发明的目的是提供一种具有快速、高通量特点，更好的有利于耳聋的早期诊断、治疗与预防的一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，以及易感性耳聋基因SNP检测固相芯片。
本发明提供的检测试剂盒，由先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测固相芯片、多重PCR所需要的探针、多重PCR反应液及该试剂盒杂交液与洗脱液构成。其中，先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测的固相芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的检测探针(21个碱基)，检测探针具有如SEQ ID No：1-42所示的序列(表3)，固相载体可以硅片或玻片等材质(但不限定于上述材质)，表面修饰为氨基或者醛基修饰。多重PCR所需要的组分包括多重PCR引物(表1)，具有如SEQ ID No：43-58所示的序列；多重PCR反应液，包括Phusion等高保证酶2U/μl、Phusion反应buffer、dATP 100mM、dTTP 100mM、dGTP 100mM、dCTP 100mM、Cy3-dCTP 10mM、Primer Mix 10μM、PCR纯化磁珠和无水乙醇。该试剂盒杂交液与洗脱液成分包括杂交液(pH 6.6to 6.8)：6×SSPE、25％甲酰胺；洗脱液(pH 6.6to 6.8)：3×SSPE、12.5％甲酰胺、10％SDS；封闭液(pH 6.6to 6.8)：6×SSPE、25％甲酰胺、BSA(0.1mg/ml)。
本发明所提供该试剂盒的阳性对照为人的GADPH基因和β-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针如下：GADPH前向引物5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(ID:SEQ59)，GADPH反向引物5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’(ID:SEQ60)，GADPH探针序列5’-GCCATCAATGACCCCTTCATT-3’(ID:SEQ61)，5’-GCCATCAATCACCCCTTCATT-3’(ID:SEQ62)；β-globin前向引物5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’(ID:SEQ63)，β-globin反向引物5’-CCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGA-3’(ID:SEQ64)，β-globin探针序列5’-CTGGACAACCTCAAGGGCACC-3’(ID:SEQ65)，5’-CTGGACAAGCTCAAGGGCACC-3’(ID:SEQ66)。
本发明的另一个目的是提供先天性和易感性耳聋基因SNP检测固相芯片，该芯片包括针对12个线粒体基因的22个SNP位点的SEQ ID No：1-42所示的序列，可以弥补检测位点较少，所带来的漏诊现象，更好的有利于耳聋基因筛查，具有快速高通量的特点。先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测的固相芯片，所述的遗传性病变基因具有多个突变SNP位点，每个突变SNP位点根据其SNP突变位点以及相邻突变的碱基位点情况设计一条或若干条的检测探针序列，通过一组或者多组检测信号判断SNP位点。本研究采用的探针长度为21碱基，探针的TM值均一性与杂交特异性通过探针合成过程中的特殊碱基修饰，如LNA修饰，但是不限制于此修饰方式。通过碱基修饰是的探针与对应的PCR标记产物的杂交温度趋于一致，有利于不同位点的杂交效率趋于一致，大大提高了检测准确度。
本发明提供的先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测芯片，包括针对12个线粒体基因的22个SNP位点，其SNP位点(对应hg19_nucleus-NC_012920_mitochondrion坐标)信息如表2所示。
本发明的再一个目的是提供一种利用上述试剂盒及基因芯片进行先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因的SNP位点的检测方法，通过以下步骤实现：
(1)标记样本扩增：将临床耳聋样本中提取的DNA进行多重PCR扩增，在扩增当中引入Cy3-dCTP或者Cy5-dCTP，获得如表2所述的12个基因的目的片段；
(2)杂交：将上述扩增得到的DNA序列与基因芯片上分布的经过特殊碱基修饰的DNA探针进行杂交反应；
(3)扫描：采用芯片扫描仪对杂交信号进行扫描；
(4)结果判读：采用合适软件如ArrayPro将芯片的扫描后的原始图像信息转变为数字信息，根据数字信号判读耳聋病变基因的SNP位点信息。
本发明提供的试剂盒为了能够更好的区分基因的临近SNP位点检测，采用的探针长度为21碱基，探针的TM值均一性与杂交特异性通过探针合成过程中的特殊碱基修饰，如LNA修饰，但是不限制于此修饰方式。其主要原则如下：
(1)如果这一条探针长度当中只有一个SNP(单碱基寡核苷酸多态性)发生，则SNP位点设计在探针的中心(第3-16位碱基)位置。
(2)如果在一条探针中发生了两个SNP(单碱基寡核苷酸多态性)发生，则采用排列组合方式设计探针，即通过检测最高信号值来判断所检测的样本碱基类型。
在本发明中，针对12个线粒体基因，22个SNP位点，所对应的42条探针序列，为了保证芯片的准确度，对于探针设计共计进行10组重复，此外还放入了一系列的control探针(含完全匹配探针和单碱基错配探针)以样本一起杂交，以确保每个批次芯片的检测性能。探针布局如图2所示。
本发明提供的先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测固相芯片、探针以及相关的检测试剂盒，可以更全面的实现在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查。目前，国内外常见mtDNA突变相关的基因诊断方法，主要有直接测序法荧光定量PCR检测方法、酶切方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本发明提供先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测的固相芯片的方法基于多重PCR技术标记目标检测区域序列，采用芯片技术进行突变位点检测，不仅可以同时对多个突变位点进行筛查和检测；另外，本发明所用的引物和探针均经过仔细设计和布局，引入特殊碱基修饰，极大地提高了临近位点基因型判断的准确性。
本发明主要提供了：(1)提供先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测芯片，该芯片包括针对12个线粒体基因的22个SNP(或者Indel)位点的42条特异性探针；(2)提供检测SNP(或者Indel)位点的探针的制备引物；(3)提供一种用于先天性和易感性耳聋基因SNP(或者Indel)检测的试剂盒；(4)提供了更全面检测先天性和易感性耳聋基因的SNP位点的方法。本发明中所采取的技术是基于多重PCR技术标记目标检测区域序列，采用芯片技术进行突变位点检测，通过杂交信号值的判读检测突变位点。通过该技术不仅能够对mtDNA上多个耳聋相关突变位点进行同时筛查检测，同时能够极大的提高特异性检测。
附图说明
图1是本发明的耳聋相关mtDNA突变检测示意图。
图2是本发明提供的探针布局示意图。
图3是被检测的耳聋家系图；其中：□为正常男性个体；○为正常女性个体；■为发病男性个体；●为发病女性个体；星号表示有氨基糖苷类抗生素用药史；箭头为先证者；/为已死亡的个体；Ⅰ为该家系的第一代成员；Ⅱ为该家系的第二代成员；Ⅲ为该家系的第三代成员；Ⅳ为该家系的第四代成员。
图4是检测的5个遗传性耳聋家系所在突变基因的芯片杂交扫描结果图。
图5是被检测的5个遗传性耳聋家系所在突变基因的测序验证峰图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，由先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测固相芯片、多重PCR所需要的探针、多重PCR反应液及该试剂盒杂交液与洗脱液构成。其中，先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测的固相芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的检测探针(21个碱基)，检测探针具有如SEQ ID No：1-42所示的序列(表3)，固相载体可以硅片或玻片等材质(但不限定于上述材质)，表面修饰为氨基或者醛基修饰。多重PCR所需要的组分包括多重PCR引物(表1)，具有如SEQ ID No：43-58所示的序列；多重PCR反应液，包括Phusion等高保证酶2U/μl、Phusion反应buffer、dATP 100mM、dTTP100mM、dGTP 100mM、dCTP 100mM、Cy3-dCTP 10mM、Primer Mix 10μM、PCR纯化磁珠和无水乙醇。该试剂盒杂交液与洗脱液成分包括杂交液(pH 6.6to 6.8)：6×SSPE、25％甲酰胺；洗脱液(pH6.6to 6.8)：3×SSPE、12.5％甲酰胺、10％SDS；封闭液(pH 6.6to 6.8)：6×SSPE、25％甲酰胺、BSA(0.1mg/ml)。
本发明所提供该试剂盒的阳性对照为人的GADPH基因和β-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针如下：GADPH前向引物5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(ID:SEQ59)，GADPH反向引物5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’(ID:SEQ60)，GADPH探针序列5’-GCCATCAATGACCCCTTCATT-3’(ID:SEQ61)，5’-GCCATCAATCACCCCTTCATT-3’(ID:SEQ62)；β-globin前向引物5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’(ID:SEQ63)，β-globin反向引物5’-CCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGA-3’(ID:SEQ64)，β-globin探针序列5’-CTGGACAACCTCAAGGGCACC-3’(ID:SEQ65)，5’-CTGGACAAGCTCAAGGGCACC-3’(ID:SEQ66)。
本发明提供的先天性和易感性耳聋基因SNP检测固相芯片，包括针对12个线粒体基因的22个SNP位点的SEQ ID No：1-42所示的序列，可以弥补检测位点较少，所带来的漏诊现象，更好的有利于耳聋基因筛查，具有快速高通量的特点。先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测的固相芯片，所述的遗传性病变基因具有多个突变SNP位点，每个突变SNP位点根据其SNP突变位点以及相邻突变的碱基位点情况设计一条或若干条的检测探针序列，通过一组或者多组检测信号判断SNP位点。本研究采用的探针长度为21碱基，探针的TM值均一性与杂交特异性通过探针合成过程中的特殊碱基修饰，如LNA修饰，但是不限制于此修饰方式。通过碱基修饰是的探针与对应的PCR标记产物的杂交温度趋于一致，有利于不同位点的杂交效率趋于一致，大大提高了检测准确度。
本发明提供的先天性耳聋基因以及易感性耳聋基因SNP检测芯片，包括针对12个线粒体基因的22个SNP位点，其SNP位点(对应hg19_nucleus-NC_012920_mitochondrion坐标)信息如表2所示。
表1本试剂盒多重PCR引物信息
| ID | Forward Primer(5'to 3') | SEQ ID | Reversed Primer(5'to 3') | SEQ ID |
| 1 | CTACCCCAGAAAACTACGATAGCC | SEQ43 | CTGTTCTTAGGTAGCTCGTCTGGTT | SEQ44 |
| 2 | TCCATATCAACAATAGGGTTTACGA | SEQ45 | CCTGATCAGAGGATTGAGTAAACG | SEQ46 |
| 3 | TTCCGCTACGACCAACTCATACA | SEQ47 | TGGCAGCTTCTGTGGAACGAG | SEQ48 |
| 4 | TTCTTCCCACAACACTTTCTCGG | SEQ49 | GGAAAATGATTATGAGGGCGTGAT | SEQ50 |
| 5 | TCCTTGACGTTGACAATCGAGTAG | SEQ51 | AGGGAGGTAGGTGGTAGTTTGTG | SEQ52 |
| 6 | CCTTCACCATTTCCGACGG | SEQ53 | GGATTTTTCTATGTAGCCGTTGAG | SEQ54 |
| 7 | CTAGTAACCACGTTCTCCTGATCAA | SEQ55 | TTTGGGTTGTGGCTCAGTGTC | SEQ56 |
| 8 | AGCATACATCATTATTCTCGCACG | SEQ57 | GAGGATAATGCCGATGTTTCAG | SEQ58 |
表2所述的基因和SNP位点信息
表3先天性及易感性耳聋基因及相关SNP位点和探针序列
实施例2携带mtDNA突变的遗传性耳聋家系的检测
1.多重PCR引物设计(见表1)：覆盖12个基因的目的片段。
2.探针设计和布局。
针对12个线粒体基因，22个SNP位点，设计了42条探针序列，探针长度为21碱基，探针的TM值均一性与杂交特异性通过探针合成过程中的特殊碱基修饰，如LNA修饰其主要原则如下：1)如果这一条探针长度当中只有一个SNP(单碱基寡核苷酸多态性)发生，则SNP位点设计在探针的中心(第3-16位碱基)位置；2)如果在一条探针中发生了两个SNP(单碱基寡核苷酸多态性)发生，则采用排列组合方式设计探针，即通过检测最高信号值来判断所检测的样本碱基类型。
为了保证芯片的准确度，对于探针设计共计进行10组重复，此外还放入了一系列的control探针(含完全匹配探针和单碱基错配探针)以样本一起杂交，以确保每个批次芯片的检测性能。
3.检测样本：
选择5个典型的耳聋家系(DF1、DF2、DF3、DF4和DF5)。具体家系图参见图3，这些家系呈现典型的母系遗传。其中，DF1、DF2、DF3和DF4家系的发病者均以听力下降为唯一的临床症状，但家系中每个发病成员的听力损伤程度不等；DF5家系的发病者除了听力下降还伴有糖尿病。
4.芯片制作和分析
4.1标记样本扩增纯化：将临床样中提取的DNA进行多重PCR扩增(多重PCR引物如表1所示)，在扩增当中引入Cy3-dCTP或者Cy5-dCTP，获得如表2所述的13个基因的目的片段。
4.1.1样本标记(多重PCR反应)
4.1.2 PCR条件
4.1.3 Beads纯化PCR产物
1)室温避光平衡Ampure beads 30min，将25uLPCR产物转移至1.5ml离心管中，加入25μl Ampure beads吹打10次混匀，室温放置5min
2)将上述离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，
3)取上清转移至另一1.5ml离心管中。
4)在上清中加入Size slector beads 5μl吹打10次混匀。室温放置5min。
5)将上述离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，弃上清。
6)将离心管留在磁力架上加入200μl新鲜配置80％乙醇，30s后弃上清(注意不要扰动磁珠)。
7)再次加入200μl新鲜配置80％乙醇，30s后弃上清。将离心管留在磁力架上，室温干燥5-10min。
8)加入16μl 10mM Tris，吹打10次混匀，室温放置2min。将离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，吸取15μl上清进行Nanodrop定量，95℃变性10分钟，冰上放置，待用。
4.2杂交：
1)清洗系统：连接通路，换上废旧芯片，用以下溶液进行清洗系统；1ml于95℃预热的1％SDS，在最高速下循环清洗20min；排除1％SDS于废液管后，用3ml DEPC水进行清洗；1ml于95℃预热的DEPC水，在最高速下循环清洗5-6min；排除DEPC水于废液管后，用3mlDEPC水进行清洗。
2)芯片清洗：更换新的芯片，用1ml解吸缓冲液于结合速度下循环清洗20min；扫描仪对清洗后的芯片进行扫描。备注：以上系统清洗和芯片清洗过程中芯片台座温度均为40℃。
3)样本杂交：1ml杂交缓冲液于结合速度下循环清洗10min；1ml封闭缓冲液于结合速度下循环清洗5-6min；将制备的样本加入到封闭缓冲液中，混匀后于于结合速度下循环运行8～12hrs进行杂交。备注：样本杂交过程芯片台座温度为30℃。
4)杂交后清洗：1ml杂交缓冲液于清洗速度下循环清洗20min(芯片台座温度32℃)；1ml清洗缓冲液于清洗速度下，在40℃、45℃和50℃下分别循环清洗20min。
5)芯片杂交相关试剂：
SDS(上海朝瑞生物有限公司)；
DEPC水(上海泽衡生物有限公司)；
6×SSPE(1000ml)：Nacl 52.59g，NaH2PO4 8.28g，EDTA 2.82g加入800ml DEPC水，用NaOH将pH调到7.4后，最后用DEPC水定容到1L后高压灭菌备用。10％SDS(50ml)：称取13.619g SDS粉末，用DEPC水定容至50ml；
杂交缓冲液:取100ml 6×SSPE缓冲液，称取1.125g的甲酰胺加入其中，并将pH调节到6.8；
清洗缓冲液:杂交缓冲液50ml，10％SDS 2ml，DEPC水50ml；
封闭缓冲液：首先用DEPC水将BSA配制成0.25％，然后65℃金属浴加热10min，最后按以下量配制封闭缓冲液：杂交缓冲液500μl，25×heat-treated BSA 20μl。
4.3芯片扫描：
根据GenePix 4000B的说明设定相关的光电倍增管(PMT)、聚焦距离(focalposition)和扫描波长等对芯片进行扫描。
4.4芯片数据处理和结果判读：
用扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)扫描芯片，获得杂交图谱，并通过Array-Pro分析软件(Media Cybernetics)获取每个检测杂交点的Cy3和Cy5荧光信号强度和标准误。数据经过背景噪音减除后(整体背景减除法)，获得其真实杂交信号值。根据杂交信号数值强弱判断SNP位点。
5.检测结果分析
根据图4被检测的5个遗传性耳聋家系所在突变基因的芯片杂交扫描结果图可知，非综合征型耳聋家系：DF1家系携带了A1555G突变、DF2家系携带了C1494T突变、DF3家系携带了T7511C突变、DF4家系携带了T12201C突变、DF5家系携带了A3243G突变。通过对于这些样本的芯片检测，判读结果均符合预期。
6.可靠性的检验
用本发明的基因芯片方法检测的结果，同时进一步将这些标本的PCR扩增产物进行测序分析，如图5所示的被检测的5个遗传性耳聋家系所在突变基因的测序验证峰图所示，测序结果与基因芯片结果相吻合，说明使用本发明方法检测mtDNA突变的可靠性和稳定性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
<110> 浙江大学
<120> 一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒
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CGCCCGTCACCCTCCTCAAGT
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<400> 1
GACCTTTTCAAAAAGGTATTA
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GACCCTTTCAAAAAGGTATTA
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TAACTTTGTCAAAGTTAAATT
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TAACTTTGTCTAAGTTAAATT
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<212> DNA
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GATTAAGAGAACCAACACCTC
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
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GATTAAGAGAGCCAACACCTC
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TCTTTACAGTGAAATGCCCCA
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
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TCTTTACAGTAAAATGCCCCA
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
ACTCTTTTAGTATAAATAGTA
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
ACTCTTTTAGCATAAATAGTA
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TACGACCCCTTATTTACCGAG
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TACGACCCCTCATTTACCGAG
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TGTCTAACAACATGGCTTTCT
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TGTCTAACAACATGGATTTCT
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TTTCTCAACTTTTAAAGGATA
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TTTCTTAACTTTTAAAGGATA
<210> 39
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<212> DNA
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<400> 1
CAAAAATTTTGGTGCAACTCC
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CAAAAATTTTAGTGCAACTCC
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CACGGACTACAACCACGACCA
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CACGGACTACGACCACGACCA
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CTACCCCAGAAAACTACGATAGCC
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CTGTTCTTAGGTAGCTCGTCTGGTT
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TCCATATCAACAATAGGGTTTACGA
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CCTGATCAGAGGATTGAGTAAACG
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TTCCGCTACGACCAACTCATACA
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TGGCAGCTTCTGTGGAACGAG
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TTCTTCCCACAACACTTTCTCGG
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GGAAAATGATTATGAGGGCGTGAT
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TCCTTGACGTTGACAATCGAGTAG
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
AGGGAGGTAGGTGGTAGTTTGTG
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CCTTCACCATTTCCGACGG
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GGATTTTTCTATGTAGCCGTTGAG
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CTAGTAACCACGTTCTCCTGATCAA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TTTGGGTTGTGGCTCAGTGTC
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
AGCATACATCATTATTCTCGCACG
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GAGGATAATGCCGATGTTTCAG
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CCTGGAAGATGGTGATGGGAT
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GCCATCAATGACCCCTTCATT
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GCCATCAATCACCCCTTCATT
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
GTGGATGAAGTTGGTGGTGAGG
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CTGGACAACCTCAAGGGCACC
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
CTGGACAAGCTCAAGGGCACC
Claims (5)
1.一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，主要包括先天性耳聋基因和易感性耳聋病变基因SNP检测探针、多重PCR引物、多重PCR反应液及杂交液与洗脱液，其中检测探针有SEQ ID No：1-42所示的序列，多重PCR引物有SEQ ID No：43-58所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所示试剂盒的阳性对照为人的GADPH基因和ß-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针序列如下：
GADPH前向引物5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，
GADPH反向引物5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’，
GADPH探针序列：
5’-GCCATCAATGACCCCTTCATT-3’，
5’-GCCATCAATCACCCCTTCATT-3’；
ß-globin前向引物5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAGG-3’，
ß-globin反向引物5’-CCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGA-3’，
ß-globin探针序列：
5’-CTGGACAACCTCAAGGGCACC-3’，
5’-CTGGACAAGCTCAAGGGCACC-3’。
3.根据权利要求1所述的一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，多重PCR反应液包括Phusion高保真酶 2 U/µl、Phusion反应buffer、dATP 100 mM、dTTP 100mM、dGTP 100 mM、dCTP 100 mM、Cy3-dCTP 10 mM、Primer Mix 10 µM、PCR纯化磁珠和无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种先天性和易感性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所述杂交液的pH 6.6 - 6.8，包括：6×SSPE、25％甲酰胺；所述洗脱液的pH 6.6 - 6.8，包括3×SSPE、12.5%甲酰胺、10% SDS。
5.一种用于检测先天性和易感性耳聋基因SNP病变的基因芯片，其特征在于，SEQ IDNo：1-42所示的序列为检测针对12个线粒体基因的22个SNP位点的探针序列。
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