CN105506120B - 线粒体突变性耳聋的多重Taqman荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了线粒体突变性耳聋的多重Taqman荧光检测试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID NO:1～2所示的引物，SEQ ID NO:3～6所示的探针，还含有DNA聚合酶、阴性对照品等。目前来说耳聋的临床诊断主要是博奥公司生产晶芯九项耳聋基因检测芯片，每个位点检测费用为100元。芯片储存条件要求严格，设备高端，检测步骤繁琐耗时长。而本发明是一种简便有效，花费低，准确度高的方法；无需高端设备，所有试剂存放于4摄氏度冰箱即可；单孔同时检测两个位点，只需一步PCR就可以得出结果，两个位点检测费用成本40元左右。可见本发明试剂盒及检测方法使得检测快速，准确，花费低，有利于耳聋筛查的普及。
Description
技术领域
本发明涉及线粒体突变性耳聋的多重Taqman荧光检测试剂盒。
背景技术
耳聋又称感音神经型耳聋，是一种严重影响个人生活质量和社会人口素质的听力缺陷病。根据病因，耳聋可以分为遗传性耳聋和非遗传性耳聋。其中遗传性耳聋占50%。遗传性耳聋根据遗传方式又分为常染色体遗传，性染色体遗传，线粒体遗传。其中线粒体遗传又称母系遗传，女性携带者将突变遗传给其下一代的概率是100%。线粒体遗传性耳聋还有个特别临床表现 “一针致聋”。线粒体遗传性耳聋不仅和先天遗传有关，后天使用氨基糖甙类抗生素会大大增加其外显率。所以线粒体遗传性耳聋的诊断不仅可以用于产前诊断，也可作为表现型正常耳聋家族史成员的筛查，一旦确诊携带突变，应禁止使用氨基糖甙类抗生素，并对其家庭女性成员进行筛查，以指导临床用药，减少线粒体耳聋的发病率。我国线粒体遗传耳聋在遗传性耳聋平均检出率为3.28%[1-2]。目前国外最新的针对耳聋的基因诊断方法是用目标基因捕获法（targeted genomic enrichment TGE），大量并行序列测序技术（massively parallel sequencing MPS）[3]，这两种方法由于耗时较长，成本高，多用于商业和科研，并不适用于耳聋基因临床快速检测。目前国内可用于耳聋基因诊断方法主要有测序法,限制性酶切片段长度多态性（RFLP），PCR产物单链构象多态性（PCR-SSCP）,变性高效液相色谱法（DHPLC）、质谱法、博奥公司生产的晶芯九项遗传性耳聋基因检测芯片（各方法优劣比较见表1）。其中测序法是基因诊断的金标准，但是设备要求高，步骤繁琐，花费大，一般实验室不能做到，进行多基因分析时，则价格更是昂贵且耗费人力。RFLP原理为将待测的DNA片段用限制性内切酶酶切，以识别并切割特异的序列，将酶切后的产物进行电泳，根据DNA片段的大小来判断目的基因是否会有特异性序列，此方法不需要复杂设备、试剂，但标准化程度差。其他常用技术，如PCR-SSCP和DHPLC等，其特点也是操作繁琐、通量低，限制了耳聋基因诊断的普及。目前国内临床采用的遗传性耳聋的诊断方法主要是博奥公司生产基因芯片检测方法，设备要求高，芯片储存压力大，检测费用贵等而只能在一些大城市的三甲医院或者一些遗传咨询中心进行。这大大限制了遗传性耳聋诊断普及，导致中国大部分地区的散发遗传性耳聋不能得到及时有效的诊断，限制了遗传性耳聋的预防和疗治。
参考文献：
[1]袁永一，中国人重度-极重度耳聋分子流行病学及致病机制研究.D.中国人民解放军军医进修学院，167,2007.
[2]李琦，聋病基因诊断技术研究和应用与非综合征型耳聋的热点突变的分子流行病学研究.D.中国人民解放军军医进修学院，176，2008.
[3] A. Eliot Shearer, Richard J.H. Smith,Genetics: advances ingenetic testing for deafness[J]. Wolters Kluwer Health.2012,24(6):679-686。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
检测线粒体突变性耳聋的PCR引物，该引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
检测线粒体突变性耳聋的PCR检测探针，其序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示，或者为该些序列的核苷酸互补序列。
进一步的，所述探针还包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示的的探针，或者为该些序列的核苷酸互补序列。
进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、Texas Red、HEX、VIC、CY3、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，所述试剂盒还含有上述所述的探针。
进一步的，所述试剂盒还含有DNA聚合酶、阴性对照品。
本发明的有益效果是：
1）目前来说耳聋的临床诊断主要是博奥公司生产晶芯九项耳聋基因检测芯片，每个位点检测费用为100元。芯片储存条件要求严格，设备高端，检测步骤繁琐耗时长。而本发明是一种简便有效，花费低，准确度高的方法。无需高端设备，所有试剂存放于4摄氏度冰箱即可。单孔同时检测两个位点，只需一步PCR就可以得出结果。两个位点检测费用成本40元左右。
2）本发明试剂盒及检测方法使得检测快速，准确，花费低，有利于耳聋筛查的普及。
3）本发明试剂盒及方法检测收集的362份耳聋患者血样，线粒体两个位点的检出率4.69%。这也符合全国线粒体遗传性耳聋的分子流行病学调查数据，与全国平均水平无统计学差异。阳性检出标本经测序验证，与测序结果100%吻合。
附图说明
图1为线粒体遗传性耳聋Taqman多重荧光定量检测结果图，Allele1表示等位基因1，Allele2表示等位基因2，Heterozygote表示杂合体；
图2为线粒体遗传性耳聋Taqman多重荧光定量检测结果图，Allele1表示等位基因1。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1：检测线粒体突变性耳聋的PCR引物及探针
本发明前期通过引物设计原则并结合实际情况，设计出大量检测线粒体突变性耳聋相关DNA的PCR引物，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，最终选取检测线粒体突变性耳聋相关DNA效果最佳的PCR引物及探针，其核苷酸序列分别如下所示：
引物：
F：5’-GTGCTTAGTTGAACAG-3’（SEQ ID NO:1），
R：5’- CACTTTCCAGTACACTTA-3’（SEQ ID NO:2）。
探针：
P1：CY3-CCCGTCACCCTCCTCA-BHQ2（SEQ ID NO:3）；
P2：Texas Red-CCCGTCACTCTCCTCA-BHQ2（SEQ ID NO:4）；
P3：FAM-TTATATAGAGGAGACAAGTCGTA-BHQ（SEQ ID NO:5）；
P4：CY5-TTATATAGAGGAGGCAAGTCGTA-BHQ2（SEQ ID NO:6）；
实施例2：检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒
检测粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒包括以下成份：
1）含有实施例1中所述的引物；
2）含有实施例1中所述的检测探针：
3）PCR反应液：BIO-RAD IQTM Multiplex Powermix (catalog#172-5848)美国伯乐公司
4）还含有DNA聚合酶、阴性对照品（水）。
实施例3：检测线粒体突变性耳聋的检测方法
利用实施例2建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）DNA提取：
取待测全血样本（EDTA抗凝），使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，按照说明书中全血标本提取步骤操作，洗脱体积为70uL，分别提取获得各组样品中的DNA作为后续PCR模板；
2）PCR反应体系：
10μM 引物F 1 μL
10μM引物R 1 μL
IQ Multiplex Powermix 2× 10μL
DNA 模板 1μL
10 μM探针P1 0.28μL
10 μM探针P2 0.28μL
10 μM探针P3 0.28μL
10 μM探针P4 0.28μL
MilliH20（去离子水） 5.88μL
总体积 20μL。
3）PCR反应程序：
第一步：95℃ 5分钟；第二步：95 ℃ 30秒，58 ℃ 1分钟，40个循环（同时采荧光信号）；第三步：4 ℃ 保存。
4）结果分析：
反应结束后自动保存结果，对样品的扩增曲线分别进行分析：利用软件对扩增曲线进行等位基因析（Allelic Discrimination），
I若样品中只能检测到探针P1和P3所带荧光分子发出的荧光值，说明不存在线粒体突变性耳聋；
II若样品中能够检测到探针P2和/或P4所带荧光分子发出的荧光值，说明存在线粒体突变性耳聋；
其中，a. 若样品中能够检测到探针P2和/或P4所带荧光分子发出的荧光值，同时不能检测到P1和/或P3所带荧光分子发出的荧光值，说明存在纯合性线粒体突变性耳聋；
b. 若样品中能够检测到探针P2和/或P4所带荧光分子发出的荧光值，同时也能检测到P1和/或P3所带荧光分子发出的荧光值，说明存在纯合性线粒体突变性耳聋。
实施例4：特异性实验
本实施例对75例线粒体耳聋阴性的标本或健康人进行检测，阴性标本包括GJB2:235delC，299-300delAT；SLC26A4:2168A>G，919-2A>G；OTOF:5098G>C；WFS1:2158A>G六类遗传性耳聋进行检测，结果显示为阴性以上结果证明本方法有很好的特异性。
实施例5：临床样本检测
使用本发明检测试剂盒及检测方法对收集的362份的耳聋患者血样进行检测（具体操作步骤见实施例3），检测结果如图1～2所示。
图1为90份样品的探针P3（带FAM荧光分子）和P4（带CY5荧光分子）的检测结果，其中蓝色横线和橙色竖线分别是CY5和FAM的最小阈值，从图中可以看出，有两份样品未检测到明显的FAM荧光和CY5荧光（图1中的实心棱形），该两份样品为增设的阴性对照品；有两份样品只检测到CY5荧光（图1中的实心方块），该两份样品即为纯合性线粒体突变性耳聋；有两份样品同时检测到FAM荧光和CY5荧光（图1中的实心三角形），该两份样品即为杂合性线粒体突变性耳聋（杂合突变导致耳聋的严重程度可能会低于纯合突变）；剩下86份样品只检测到FAM荧光（图1中的实心圆），说明该位点的碱基均为正常，未发生突变。
图2为与图1相同的90份样品的探针P1（带CY3荧光分子）和P2（带Texas Red 荧光分子）的检测结果，增设1份为阴性对照品（图2中的实心棱形）；该90份样品均只检测到CY3荧光，说明该90份样品在探针P1检测的基因位点未发生碱基突变。
综合图1和图2的结果，可以得出所检测的90份样品中，有两份样品为杂合性线粒体突变性耳聋；还有两份样品为纯合性线粒体突变性耳聋，均具有线粒体遗传性耳聋病症。
按照上述同样的方法，对剩下的272份耳聋患者血样进行检测，所有362份样品的检测结果为：2份样品为杂合性线粒体突变性耳聋；15份样品为纯合性线粒体突变性耳聋，具有线粒体遗传性耳聋病症，检出率为4.69%，该结果与现有传统检测方法检测的结果完全一致。检出率4.69%也符合全国线粒体遗传性耳聋的分子流行病学调查数据，与全国平均水平无统计学差异。阳性检出标本经测序验证，与测序结果100%吻合。
实施例7：本发明检测方法与常规检测方法的比较
将本发明检测方法与常规线粒体突变性耳聋检测方法进行比较，各方法的优劣见表1
表1 各种可用于耳聋检测方法优劣对比
注：DHPLC表示变性高效液相色谱法；
RFLP表示限制性酶切片段长度多态性法；
SNPstream流式单碱基检测技术。
从表1中可以看出，相对现有传统的线粒体突变性耳聋检测方法，本发明方法具有检测时间快，特异性好，仪器设备要求低，成本低，通量好等优点，有利于耳聋筛查的普及。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.检测线粒体突变性耳聋的PCR引物和检测探针，该引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；所述检测探针序列为Texas Red-CCCGTCACTCTCCTCA-BHQ2和CY5-TTATATAGAGGAGGCAAGTCGTA-BHQ2，或者为TexasRed-CCCGTCACTCTCCTCA-BHQ2和CY5-TTATATAGAGGAGGCAAGTCGTA-BHQ2的核苷酸互补序列；所述探针还包括CY3-CCCGTCACCCTCCTCA-BHQ2和FAM-TTATATAGAGGAGACAAGTCGTA-BHQ，或者为CY3-CCCGTCACCCTCCTCA-BHQ2和FAM-TTATATAGAGGAGACAAGTCGTA-BHQ的核苷酸互补序列。
2.一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1中所述的引物和检测探针。
3.根据权利要求2所述的一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有DNA聚合酶、阴性对照品。
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