CN103276082A - 一种检测药物性耳聋易感基因突变位点的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TaqMan MGB探针法检测药物性耳聋相关基因突变的试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括两对引物对，该两对引物对分别具有序列表中SEQ ID №：1、SEQ ID №：2、SEQ ID №：5和SEQ ID №：6所示的核苷酸序列。本发明所提供的试剂盒包括三条探针，该三条探针分别具有序列表中SEQ ID №：3、SEQ ID №：4和SEQ ID №：7所示的核苷酸序列。本发明试剂盒可在同一反应体系和反应条件下同时完成对两个突变位点的检测。相比现有检测技术，本发明试剂盒结果可读性要好，分析、检测过程简单易行，提高效率的同时降低了成本。

Description

一种检测药物性耳聋易感基因突变位点的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域TaqMan MGB探针法检测药物性耳聋相关基因突变的试剂盒。
背景技术
碱基突变是人类基因组突变中很重要的一种类型，很多碱基突变都与疾病的发生有密切的关系，因此检测某些位点突变信息，对疾病的临床诊断和指导临床治疗有着重要的意义。
氨基糖甙类抗生素包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素等，因其对革兰氏阴性细菌的感染特别有效，同时对于某些革兰氏阳性细菌也有协同抗菌作用，因此被广泛应用临床治疗。但是该类药物有严重的耳毒性副作用，使用时可能会造成听力不可逆转的损伤。人线粒体基因组12S rRNA基因是氨基糖甙类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。在这些突变位点中，位于12S rRNA基因高度保守的解码区的同质性的A1555G和C1494T突变与耳聋相关，这两个突变导致很多患者在使用氨基糖甙类抗生素之后出现中毒性耳聋。A1555G突变和C1494T突变会在12S rRNA基因的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12S rRNA在二级结构上与细菌的16S rRNA的相应区域的二级结构更加相似。因此，由于C1494T和A1555G突变在12S rRNA形成G-C和U-A配对使得氨基糖甙类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖甙类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。因此对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖甙类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。
现有的对上述药物性耳聋相关的两个点突变的检测技术多采用实时荧光定量PCR技术，根据荧光定量原理的不同可分为两类：
(1)荧光染料法，其原理是利用特异性PCR引物与野生及突变型模板结合能力及由此导致的PCR扩增效率的不同，对待检测位点的基因型进行区分。由于引物的特异性相对较低，且荧光染料与DNA的结合不具有特异性，故易出现非特异性熔解峰，影响对结果的判读。染料法需在反应后对熔解曲线进行二次分析，故耗时较长，整个过程约2.5h。
(2)TaqMan荧光探针法，目前仅有的少数几种专利技术只能对单个突变位点逐一进行检测，故需对每个检测位点单独设立检测体系，成本高，操作繁琐且检测效率较低。
目前公开的能同时检测耳聋相关的两个突变位点的PCR检测方法多为染料法，少数探针法专利技术也只能对耳聋相关的单个突变位点进行检测，因此，急需开发一种简单高效的能同时检测药物性耳聋相关的两个突变位点的方法。
发明内容
本发明为解决目前TaqMan荧光探针法只能对耳聋相关的单个突变位点进行检测，检测成本高，操作繁琐且检测效率较低的问题，提供了一种简单高效的能同时检测药物性耳聋相关的两个突变位点的技术方案。
本发明的一个目的是提供一种同时检测2个以上基因突变的引物对，包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物根据最靠近基因5′端的突变位点的上游核苷酸序列设计合成，所述下游引物根据最靠近基因3′端的突变位点的下游核苷酸序列设计合成。
其中，所述基因突变为耳聋相关基因突变；具体为药物性耳聋。
再具体的，所述基因突变具体为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
具体的，所述上游引物具有序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID №：2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测基因突变的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒包括上述引物对。
所述试剂盒还可包括探针；具体的，所述探针是根据突变后基因的核苷酸序列设计合成的，并且探针数量与突变位点的个数相同，每个探针的序列与相应的突变后基因的核苷酸序列完全匹配。
具体的，所述探针包括如下(1)和(2)所示的探针：
(1)具有序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列，
(2)具有序列表中SEQ ID №：4所示的核苷酸序列。
具体的，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记非荧光淬灭基团及小沟结合物(MGB，minor groove binder)；序列不同的探针其5′端标记的荧光报告基团是不同的，具体的，所述荧光报告基团选自FAM、VIC或NED，所述非荧光淬灭基团是NFQ。
所述试剂盒还可包括质控引物对和质控探针；具体的，所述质控引物对具有序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6所示的核苷酸序列，所述质控探针具有序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列；具体的，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记非荧光淬灭基团及小沟结合物。
上述试剂盒中所述的基因突变为耳聋相关基因突变；具体为药物性耳聋相关基因突变。
再具体的，所述基因突变为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
本发明的还一个目的是提供一种用于检测基因突变的PCR试剂。
本发明所提供的PCR试剂包括SEQ ID №：1所示引物、SEQ ID №：2所示引物、SEQ ID №：5所示引物、SEQ ID №：6所示引物、SEQ ID №：3所示探针、SEQ ID №：4所示探针、SEQ ID №：7所示探针；
其中，SEQ ID №：3所示探针、SEQ ID №：4所示探针和SEQ ID №：7所示探针的5‘端均标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团及小沟结合物。
具体的，所述PCR试剂中还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶；
具体的，所述基因突变为耳聋相关基因突变；具体为药物性耳聋；再具体的，所述基因突变为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
上述任一所述引物对或上述任一所述试剂盒在制备检测基因突变试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
其中，所述基因突变为耳聋相关基因突变；具体为药物性耳聋。
再具体的，所述基因突变为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
本发明利用TaqMan MGB探针的序列特异性取代引物的序列特异性，从而使检测特异性明显增高。相比荧光染料法，由于不用进行熔解曲线二次分析，故结果可读性要好，分析过程简便，整个检测和结果判读过程在1.5h内即可完成。同时本发明以同一PCR过程诱导两条突变型探针的切割水解，故可在同一反应体系和反应条件下同时完成对两个位点的检测，相比现有的TaqMan荧光探针法，检测过程简单易行，提高效率的同时降低了成本。
与现有检测技术相比，本发明的TaqMan MGB探针法检测技术具有以下优势：
(1)本发明利用探针法对耳聋相关的两个突变位点进行检测，其反应原理为突变型探针与模板突变型碱基完全配对，探针进而被引物切割水解，释放出相应的荧光基团，从而对突变型及野生型模板进行区分。由于该方法所用探针需与模板完全匹配才能与之互补结合，因此检测特异性强，不容易出现非特异性扩增。
(2)本发明探针法PCR反应过程约1.5h，与染料法同类技术相比节省1h，耗时较短，检测过程方便快捷。
(3)本发明可一管同时检测两个药物性耳聋相关的突变位点，并且只利用突变型探针即可对C1494T、A1555G两种突变型基因进行区分，降低了需另外设计合成野生型探针的费用，成本较低且检测效率高。
(4)本发明利用TaqMan MGB探针技术，通过实时荧光定量PCR荧光扩增信号类型及其相应Ct值来实现两突变位点的检测，仪器要求低，反应过程短，操作简单，无需酶切或电泳，无需测序。同时整个过程除加入模板外无需进行开盖操作，有效避免污染的产生，能够简单、快速、准确地实现两个突变位点的同时检测。
附图说明
图1为三种基因型模板测序结果图，其中序列中下划线及图中方框所标记的碱基为相应的目标检测位点。
图2为携带线粒体12S rRNA基因1494C→T突变的人基因组DNA为模板的PCR检测，其中，标记为a的曲线代表1494突变型探针FAM荧光扩增曲线，标记为b的曲线代表1555突变型探针VIC荧光扩增曲线，标记为c的曲线代表质控探针NED荧光扩增曲线。
图3为携带线粒体12S rRNA基因1555A→G突变的人基因组DNA为模板的PCR检测，其中，标记为a的曲线代表1494突变型探针FAM荧光扩增曲线，标记为b的曲线代表1555突变型探针VIC荧光扩增曲线，标记为c的曲线代表质控探针NED荧光扩增曲线。
图4为携带线粒体12S rRNA基因的人野生型基因组DNA为模板的PCR检测，其中，标记为a的曲线代表1494突变型探针FAM荧光扩增曲线，标记为b的曲线代表1555突变型探针VIC荧光扩增曲线，标记为c的曲线代表质控探针NED荧光扩增曲线。
图5为以ddH2O为模板的PCR检测，其中，标记为a的曲线代表1494突变型探针FAM荧光扩增曲线，标记为b的曲线代表1555突变型探针VIC荧光扩增曲线，标记为c的曲线代表质控探针NED荧光扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、人线粒体基因组12S rRNA基因两突变位点的检测
1、引物及探针设计
引物序列如下：
1494位点上游引物：5′CCCTGAAGCGCGTACACA3′(见序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列)
1555位点下游引物：5′GCTACACTCTGGTTCGTCCAAGT3′(见序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列)
探针序列如下：
1494突变型探针：5′CCGTCACTCTCCTCAA3′(见序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列)，5′端标记FAM荧光基团，3′端标记非荧光淬灭基团NFQ和MGB。此探针检测的是1494位点是否为T。
1555突变型探针：5′ACGACTTGCCTCCT3′(见序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列)，5′端标记VIC荧光基团，3′端标记非荧光淬灭基团NFQ和MGB。此探针检测的是1555位点是否为G。
针对线粒体上一段保守的核酸区段，设计质控探针及引物。
引物序列如下：
质控引物F：5′AGCCATTTACCGTACATAGCACATT3′(见序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列)
质控引物R：5′GGGATATTGATTTCACGGAGGAT3′(见序列表中SEQ ID №：6的核苷酸序列)
探针序列如下：
质控探针：5′CCATGGATGACCC3′(见序列表中SEQ ID №：7的核苷酸序列)
质控探针5′端标记NED荧光基团，3′端标记非荧光淬灭基团NFQ和MGB。
2、PCR反应
PCR扩增所用模板为携带线粒体12S rRNA基因1494C→T或1555A→G突变的人基因组DNA或携带线粒体12S rRNA基因的人野生型基因组DNA。
携带线粒体基因组12S rRNA1494C→T或1555A→G突变的人基因组DNA是从合作医院提供的临床血样或血斑中提取得到的，样品的取得均经过患者的知情同意。携带线粒体12S rRNA基因的基因组DNA通过常规商用核酸提取试剂盒完成提取。所获基因组DNA均经核酸测序，测序结果见图1，图1测序结果证实，用作模板的人野生型基因组DNA中，人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494和1555位核苷酸分别为C和A；用作模板的1494突变型(T)基因组DNA中，人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位点上的核苷酸为T，其它所有核苷酸均与野生型的一致；用作模板的1555突变型(G)基因组DNA中，人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位点上的核苷酸为G，其它所有核苷酸均与野生型的一致。
反应体系如下：PCR Buffer4.64μl，Rox(50×)0.5μl，Taq酶0.4μl，UNG酶0.03μl，1494位点上游引物(10μM)1μl，1555位点下游引物(10μM)1.75μl，质控引物F(10μM)2.5μl，质控引物R(10μM)2.5μl，1494突变型探针(10μM)0.75μl，1555突变型探针(10μM)0.75μl，质控探针(10μM)2.5μl，模板5μl，ddH2O2.68μl。
其中，设置4个PCR反应，各PCR反应所使用的模板及模板浓度如下：
第一个PCR反应中，模板为携带线粒体12S rRNA基因1494C→T突变的人基因组DNA，模板浓度为2ng/μl；
第二个PCR反应中，模板为携带线粒体12S rRNA基因1555A→G突变的人基因组DNA，模板浓度为2ng/μl；
第三个PCR反应中，模板为携带线粒体12S rRNA基因的人野生型基因组DNA，模板浓度为2ng/μl；
第四个PCR反应中，模板为双蒸水。
上述4个PCR反应均在ABI7500荧光定量PCR仪上一步进行。
反应程序如下：
首先进行扩增过程，扩增过程如下：37℃5min；95℃3min；然后95℃15sec，62℃1min，40个循环。其中62℃1min为荧光采集步骤。
3、检测结果分析
如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中人线粒体基因组12S rRNA基因的1494位存在点突变，突变类型为C→T；如出现VIC扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中人线粒体基因组12S rRNA基因的1555位存在点突变，突变类型为A→G。
结果如下：第一个PCR反应模板为1494T突变型基因组，PCR结果出现FAM和NED荧光扩增信号(图2)；第二个PCR反应模板为1555G突变型基因组，PCR结果出现VIC和NED荧光扩增信号(图3)；第三个PCR反应模板为野生型基因组，PCR结果只出现NED荧光扩增信号(图4)；第四个PCR反应模板为双蒸水，PCR结果未出现任何荧光扩增信号(图5)。
实验结果表明，本发明试剂盒可在同一反应体系和反应条件下同时完成对两个突变位点的检测，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。
Figure IDA00003273141800011
Figure IDA00003273141800021
Figure IDA00003273141800031

Claims (10)

1.一种同时检测2个以上基因突变的引物对，包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物根据最靠近基因5′端的突变位点的上游核苷酸序列设计合成，所述下游引物根据最靠近基因3′端的突变位点的下游核苷酸序列设计合成；具体的，所述基因突变为耳聋相关基因突变；再具体为药物性耳聋；再具体的，所述基因突变具体为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述上游引物具有序列表中SEQID №：1所示的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID №：2所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测基因突变的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括探针；具体的，所述探针是根据突变后基因的核苷酸序列设计合成的，并且探针数量与突变位点的个数相同，每个探针的序列与相应的突变后基因的核苷酸序列完全匹配。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述探针包括如下(1)和(2)所示的探针：
(1)具有序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列，
(2)具有序列表中SEQ ID №：4所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求3-5任一所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记非荧光淬灭基团及小沟结合物；具体的，序列不同的探针其5′端标记的荧光报告基团是不同的，具体的，所述荧光报告基团选自FAM、VIC或NED，所述非荧光淬灭基团是NFQ。
7.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其特征在于：还包括质控引物对和质控探针；具体的，所述质控引物对具有序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6所示的核苷酸序列，所述质控探针具有序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列；具体的，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记非荧光淬灭基团及小沟结合物。
8.根据权利要求3-7任一所述的试剂盒，其特征在于：所述基因突变为耳聋相关基因突变；具体为药物性耳聋相关基因突变；再具体的，所述基因突变为如下1)和/或2)：1)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1494位核苷酸由C突变为T；2)人线粒体基因组12S rRNA基因中的第1555位核苷酸由A突变为G。
9.一种用于检测基因突变的PCR试剂，包括SEQ ID №：1所示引物、SEQ ID №：2所示引物、SEQ ID №：5所示引物、SEQ ID №：6所示引物、SEQ ID №：3所示探针、SEQ ID №：4所示探针、SEQ ID №：7所示探针；
其中，SEQ ID №：3所示探针、SEQ ID №：4所示探针和SEQ ID №：7所示探针的5‘端均标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团及小沟结合物。
10.权利要求1或2所述的引物对、权利要求3-8任一所述的试剂盒或权利要求9所述的PCR试剂在制备检测基因突变试剂盒中的应用。
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