CN102676680B

CN102676680B - 一种鉴别q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法

Info

Publication number: CN102676680B
Application number: CN 201210169228
Authority: CN
Inventors: 褚栋; 国栋; 陶云荔; 杜兰英
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2012-05-28
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2032-05-28
Also published as: CN102676680A

Abstract

本发明涉及一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法，步骤如下：（1）提取Q型烟粉虱基因组DNA；（2）以Q型烟粉虱基因组DNA为模板对其线粒体COI基因进行PCR扩增；（3）对步骤（2）制得的PCR产物用限制性内切酶Hin1II(N1aIII)酶切，得酶切产物；（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选两种单倍型的Q型烟粉虱提供了简便稳定的酶切标记，同时探索建立了两种单倍型的Q型烟粉虱的鉴别技术，为今后的两种单倍型的Q型烟粉虱的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

Description

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种基于PCR-RFLP技术鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种世界性农业害虫。由于它寄主谱广、暴发性强、危害性大，被世界自然保护联盟（IUCN）列为世界最具有危害性的100个入侵种之一。同时，也是国际科技界有史以来唯一冠以“超级害虫”称谓的昆虫。近年来，随着烟粉虱传播的双生病毒-番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的扩散，烟粉虱的危害愈加严重，甚至导致江苏、河南、山东等局部地区番茄绝产。烟粉虱含有多种生物型，其中B型与Q型是入侵性最强、分布最广的2种生物型。近年来，许多学者认为B型烟粉虱与Q型烟粉虱分别是中东-亚细亚1（MEAM1）、地中海（MED）隐蔽种。B型烟粉虱起源于中东-亚细亚地区，自上世纪80年代在美国等地区暴发以来，至少传入51个国家。Q型烟粉虱起源于地中海地区，2003年首次在我国云南省发现其入侵，随后相继在10多个非地中海国家被发现；目前，许多国家多年来持续开展了Q型烟粉虱的监测与控制研究。近来研究表明，Q型烟粉虱在2008年后已在全国广大地区取代了B型烟粉虱而成为了作物上烟粉虱的优势种。

当前在我国广大地区危害的Q型烟粉虱，其原产地种群具有多个支系。基于mt COI序列划分的Q1与Q2支系其原产地分布区不同，Q1支系主要分布在地中海西部地区，而Q2支系则主要分布于地中海东部地区。尽管在10多个非地中海国家发现了Q型烟粉虱的危害，但是入侵支系并非完全相同。例如，在我国目前为止仅有Q1支系的烟粉虱入侵危害；而传入美国的Q型烟粉虱则有Q1与Q2两个支系。最新研究表明，基于mt COI序列中国的Q1支系烟粉虱主要分为单倍型1（Hap1）和单倍型2（Hap2），且Hap1为主要单倍型。传统的鉴定Q型烟粉虱单倍型的方法是采用测序的方法，该方法不仅费时，而且费用较高，不利于Q型烟粉虱的快速鉴定。不同单倍型的烟粉虱对寄主植物的危害程度不同，精确区分单倍型是有效防控Q型烟粉虱的前提和基础，其对于Q型烟粉虱的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。

PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）技术，又称为CAPS技术（CleavedAmplilfed Polymorphism Sequences），其基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的PCR引物（19～27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大。

PCR-RFLP技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用PCR-RFLP技术构建区分Q型烟粉虱单倍型的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及方法。

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

正义引物Hap-F：5’-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-

TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’；SEQ ID NO.2

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的方法，步骤如下：

（1）提取Q型烟粉虱基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶Hin1II酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有小于100bp的一条条带时，则该被检测样品为Q型烟粉虱单倍型1（Hap1）；当PCR产物电泳图谱显示被测样品有大于100bp的一条条带时，则为Q型烟粉虱单倍型2（Hap2）。

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH₂0补至25μl；

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，52℃退火40秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

优选的，所述步骤（3）中限制内切酶Hin1II酶切反应条件如下：37℃酶切1-16小时。

上述步骤（1）中提取Q型烟粉虱基因组DNA和步骤（4）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。

有益效果

1、本发明所述鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物能够扩增Q型烟粉虱基因组DNA中的线粒体COI基因，为鉴定Q型烟粉虱鉴别单倍型1（Hap1）和单倍型2（Hap2）提供了简便稳定的分子标记，解决了区分单倍型Q型烟粉虱的难题。

2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选两种类型Q型烟粉虱提供了简便稳定的酶切标记。

3、本发明从分子水平探索了单倍型Q型烟粉虱线粒体COI基因的不同，探索建立了单倍型Q型烟粉虱的鉴别技术，为今后单倍型Q型烟粉虱的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

附图说明

图1是实施例2中PCR产物经Hin1II(N1aIII)酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中Hap1、Hap2分别上样未酶切与酶切的样品，M：100bp DNA Marker。

图2是实施例3中PCR产物经Hin1II(N1aIII)酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中Hap1、Hap2分别上样未酶切与酶切的样品，M：100bp DNA Marker。

图3是实施例4中PCR产物经Hin1II(N1aIII)酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中Hap1、Hap2分别上样酶切的样品，M：100bp DNAMarker；A：样品采自山东省聊城市、B：样品采自山东省德州市、C：样品采自山东省枣庄市、D：样品采自山东省临沂市、E：样品采自北京市、F：样品采自上海市、G：样品采自江苏南京市、H：样品采自江西南昌市。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、2中所述Q型烟粉虱于2011年采集于山东省济南市；按照（De Barro P,AhmedMZ，2011.Genetic Networking of the Bemisia tabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern ofBiological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法对上述Q型烟粉虱进行检测，采集于山东省济南市的Q型烟粉虱分为单倍型1和单倍型2。

实施例3中所述Q型烟粉虱于2011年采集于山东省寿光市；按照（De Barro P,AhmedMZ，2011.Genetic Networking of the Bemisia tabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern ofBiological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法对上述Q型烟粉虱进行检测，采集于山东省寿光市的Q型烟粉虱分为单倍型1和单倍型2。

实施例4中所述Q型烟粉虱于2011年采集于中国多个地区：A：山东省聊城市、B：山东省德州市、C：山东省枣庄市、D：山东省临沂市、E：北京市、F：上海市、G：江苏南京市、H：江西南昌市；按照（De Barro P,Ahmed MZ，2011.Genetic Networking of the Bemisiatabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern of Biological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法对上述Q型烟粉虱进行检测，采集于以上各市的Q型烟粉虱均分为单倍型1和单倍型2。

实施例所述Hin1II内切酶购自Fermentas公司，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。

实施例1

（1）Q型烟粉虱基因组DNA的提取

将单头Q型烟粉虱置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得Q型烟粉虱基因组DNA溶液。

（2）Q型烟粉虱COI基因的PCR扩增

分别以Q型烟粉虱基因组DNA溶液和Q型烟粉虱单倍型2基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

Q型烟粉虱基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×TaqBuffer：5μl；10mM dNTP：1μl；ddH₂0补至50μl；

引物序列如下：

正义引物Hap-F：5’-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-

TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，52℃退火40秒，72℃延伸50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测，均检测出一长度在150bp左右条带（如图1所示），对该条带进行双向测序，Q型烟粉虱单倍型1得到的条带序列如SEQ ID NO.4所示，Q型烟粉虱单倍型2得到的条带序列如SEQ ID NO.3所示。

（4）利用限制性内切酶酶切位点分析软件WatCut (该分析软件可登陆如下网址使用http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=restriction_new)，分析可得在片段88bp处两种单倍型Q型烟粉虱有碱基差异，且Q型烟粉虱单倍型1得到的条带在该处可被限制性内切酶Hin1II酶切（酶切位点CATG）。

实施例2

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的方法，步骤如下：

（1）将采集于山东省济南市的单头Q型烟粉虱个体置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer 2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物Hap-F：5’-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-

TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’；SEQ ID NO.2

酶切体系如下：10×NEB缓冲液2μl；PCR扩增产物5μl；Hin1II内切酶0.5μl；灭菌双蒸水至15μl。

反应条件如下：37℃水浴2小时。

（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上有一条片段长度低于100bp的条带，该Q型烟粉虱为单倍型1；成像胶片上有一条片段长度150bp左右的条带时，Q型烟粉虱为单倍型2，结果如图1所示，与按照（De Barro P,Ahmed MZ，2011.Genetic Networking of theBemisia tabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern of Biological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例3

如实施例2所述的鉴别Q型烟粉虱单倍型的方法，不同之处在于，所述Q型烟粉虱于2011年采集于山东省寿光市。

结果显示，成像胶片上有一条片段长度低于100bp的条带，该Q型烟粉虱为单倍型1；成像胶片上有一条片段长度150bp左右的条带时，Q型烟粉虱为单倍型2，结果如图2所示，与按照（De Barro P,Ahmed MZ，2011.Genetic Networking of the Bemisia tabaci Cryptic SpeciesComplex Reveals Pattern of Biological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例4

如实施例2所述的鉴别Q型烟粉虱单倍型的方法，不同之处在于，所述Q型烟粉虱于2011年采集于8个地区，分别为A：山东省聊城市、B：山东省德州市、C：山东省枣庄市、D：山东省临沂市、E：北京市、F：上海市、G：江苏南京市、H：江西南昌市。

结果显示，与按照（De Barro P,Ahmed MZ，2011.Genetic Networking of the Bemisia tabaciCryptic Species Complex Reveals Pattern of Biological Invasions.PLoS ONE，6(10):e25579.doi:10.1371/journal.pone.0025579.）中记载的方法进行检测的结果一致，A、B、C、D、E、F、G、H中，Q型烟粉虱为单倍型1在成像胶片上为一条片段长度低于100bp的条带；Q型烟粉虱为单倍型2在成像胶片上有一条片段长度150bp左右的条带，结果如图3所示。

Claims

1.一种区分Q型烟粉虱单倍型1和单倍型2的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取Q型烟粉虱基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用区分Q型烟粉虱单倍型的引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

上述区分Q型烟粉虱单倍型的引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（3）用限制性内切酶Hin1II酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有小于100bp的一条条带时，则该被检测样品为Q型烟粉虱单倍型1；当PCR产物电泳图谱显示被测样品有大于100bp的一条条带时，则为Q型烟粉虱单倍型2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液 2.5μl，20μM引物 0.5μl，5U/μl Taq酶 0.25μl，10×Taq 缓冲液 2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH₂O补至25μl。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中限制内切酶Hin1II酶切反应条件如下：37℃酶切1-16小时。