CN103255222A - 利用线粒体scar标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用线粒体SCAR标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法。所述引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述方法步骤如下：（1）提取粉虱基因组DNA；（2）以粉虱基因组DNA为模板对其进行PCR扩增；（3）对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明为鉴别温室白粉虱和烟粉虱提供了简便稳定的分子标记，为今后粉虱的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

Description

利用线粒体SCAR标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法

技术领域

本发明涉及一种利用线粒体SCAR标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法，特别涉及一种基于线粒体基因mt COI技术鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum（Westwood）在农业上是一种重要的世界性害虫，原产于北美，现分布在世界各地。温室白粉虱繁殖力较强，世代重叠严重，短时间就可形成较大种群。以各虫态在我国北方温室中越冬并继续危害，一年可发生10余代。已报道的寄主植物超过900种，包括番茄、烟草、黄瓜、茄子等。危害方式主要有：1）成、若虫排泄蜜露污染叶片，影响光合作用；2）在寄主植物叶背面刺吸汁液，使叶片变黄、萎蔫至枯死；3）传播多种病毒病。自20世纪70年代中期在我国北方地区爆发危害以来，该虫一直是我国北方农区的主要害虫之一。近几十年来，温室和塑料大棚蔬菜为温室白粉虱提供了冬季繁衍的良好环境，使得原本在露地不能越冬的害虫有了大发生的可能。温室和露地蔬菜生产相连接，使该虫种群得以繁衍和周年发生，危害加重，成为我国北方蔬菜生产的重要影响因素之一。

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）具有暴发性强、寄主谱广、危害性大的特点，是世界性的入侵害虫之一。近年来，随着烟粉虱抗药性的产生和传播的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的扩散，烟粉虱的危害愈加严重，甚至导致我国局部地区部分农作物的绝产。

当前在我国广大地区由于温室白粉虱和烟粉虱危害习性、生活史相似，两者常常混合发生；又因体型微小、外形相似，所以对于非专业人士来说区分两种粉虱比较困难。另外，以前虽有学者利用形态特征对两种粉虱进行辨别，但区分用无水乙醇保存的温室白粉虱和烟粉虱或者是两者的死虫对于粉虱研究专业人士来说也比较困难，所以急需要一种快速简单的方法对两种粉虱进行准确辨别。

近年来随着分子生物学技术的迅速发展，利用分子标记技术可以快速准确地鉴定出昆虫种类。以前虽有学者利用核基因对温室白粉虱和烟粉虱进行过研究（王金娜等,2012.温室白粉虱SCAR分子鉴定技术的建立及应用.环境昆虫学报,34(3):295-301.），但线粒体基因与核基因相比具有很大优势：1）结构简单，常无内含子和基因间隔,从而基因组复制的时间缩短；2）属于母系遗传，物种鉴定时可排除复杂遗传背景的干扰；3）基因组结构组成比较保守，具有较好的可比较性。因此，利用线粒体基因mt COI对温室白粉虱的基因组DNA扩增重复性和稳定性更好，且具有操作更为简便、灵敏度更高、更易扩增的优点。

分子标记技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用线粒体基因mt COI鉴定温室白粉虱与烟粉虱的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用线粒体SCAR标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法。

一种鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

正义引物COI-F：5’-GCCTGGTTTTGGCATTA-3’；SEQ ID NO.1

反义引物COI-R：5’-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3’；SEQ ID NO.2

一种鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体mt COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有752bp的一条条带时，则该被检测样品为温室白粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无752bp的条带时，则该被检测样品是烟粉虱。

所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

上述步骤（1）中提取温室白粉虱和烟粉虱基因组DNA和步骤（3）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。

有益效果

1、本发明所述鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物能够扩增温室白粉虱基因组DNA中的线粒体基因mt COI，却不能扩增烟粉虱基因组DNA中的线粒体基因mt COI，为鉴定温室白粉虱和烟粉虱提供了简便稳定的分子标记，解决了区分温室白粉虱和烟粉虱的难题。

2、本发明从分子水平探索了温室白粉虱和烟粉虱线粒体基因mt COI的不同，探索建立了区分温室白粉虱和烟粉虱的鉴别技术，为今后温室白粉虱和烟粉虱的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中TV：温室白粉虱；BT：烟粉虱；NX：宁夏；SD：山东；M：DL2000DNA Marker。

图2是实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中TV：温室白粉虱；BT：烟粉虱；GS：甘肃；LN：辽宁；M：DL2000DNA Marker。

图3是实施例3中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中TV：温室白粉虱；BT：烟粉虱；YN：云南；JL：吉林；M：DL2000DNA Marker。

图4是实施例4中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中TV：温室白粉虱；BT：烟粉虱；BJ：北京；QH：青海；M：DL2000DNA Marker。

图5是实施例5中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中TV：温室白粉虱；BT：烟粉虱；HN：河南；HN1：湖南；M：DL2000DNA Marker。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1中所述粉虱于2012年分别采集于山东、宁夏；按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法对上述粉虱进行检测，采集于山东、宁夏的粉虱分别为温室白粉虱和烟粉虱。

实施例2中所述粉虱于2012年分别采集于甘肃、辽宁；按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法对上述粉虱进行检测，采集于甘肃、辽宁的粉虱分别为温室白粉虱和烟粉虱。

实施例3中所述粉虱于2012年分别采集于云南、吉林；按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法对上述粉虱进行检测，采集于云南、吉林的粉虱分别为温室白粉虱和烟粉虱。

实施例4中所述粉虱于2012年分别采集于北京、青海；按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法对上述粉虱进行检测，采集于北京、青海的粉虱分别为温室白粉虱和烟粉虱。

实施例5中所述粉虱于2012年分别采集于河南、湖南；按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法对上述粉虱进行检测，采集于河南、湖南的粉虱分别为温室白粉虱和烟粉虱。

实施例所述Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。

实施例1

（1）粉虱基因组DNA的提取

将单头待鉴定样品置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得基因组DNA溶液。

（2）粉虱线粒体基因mt COI的PCR扩增

以步骤（1）制得的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×Taq Buffer：5μl；10mM dNTP：1μl；ddH₂0补至50μl；

引物序列如下：

正义引物COI-F：5’-GCCTGGTTTTGGCATTA-3’；SEQ ID NO.1

反义引物COI-R：5’-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测。经多个待鉴定样品检测，只有温室白粉虱检测出一长度在752bp的条带（如图1所示），烟粉虱中均未检测出长度在752bp条带，经检测，序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2

一种鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，步骤如下：

（1）将分别采集于甘肃、辽宁的单头粉虱个体置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体基因mt COI序列进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物COI-F：5’-GCCTGGTTTTGGCATTA-3’；SEQ ID NO.1

反义引物COI-R：5’-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测。结果显示，成像胶片上有一条片段长度752bp的条带，该粉虱为温室白粉虱；其他粉虱在成像胶片上均无752bp的条带，结果如图2所示。与按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例3

如实施例2所述的鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，不同之处在于，所述粉虱于2012年分别采集于云南、吉林。

结果显示，成像胶片上有一条片段长度752bp的条带，该粉虱为温室白粉虱；其他粉虱在成像胶片上均无752bp的条带，结果如图3所示。与按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例4

如实施例2所述的鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，不同之处在于，所述粉虱于2012年分别采集于北京、青海。

结果显示，成像胶片上有一条片段长度752bp的条带，该粉虱为温室白粉虱；其他粉虱在成像胶片上均无752bp的条带，结果如图4所示。与按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例5

如实施例2所述的鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，不同之处在于，所述粉虱于2012年分别采集于河南、湖南。

结果显示，成像胶片上有一条片段长度752bp的条带，该粉虱为温室白粉虱；其他粉虱在成像胶片上均无752bp的条带，结果如图5所示。与按照（褚栋等,2008.一种快速鉴别烟粉虱与温室白粉虱成虫的方法—复眼镜检法,45(1):154-155.）中记载的方法进行检测的结果一致。

Claims (4)

1.一种利用线粒体基因mt COI标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.一种利用线粒体基因mt COI标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体基因mt COI进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有752bp的一条条带时，则该被检测样品为温室白粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无752bp的条带时，则该被检测样品为烟粉虱。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq缓冲液2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

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