CN103451185B - 龟纹瓢虫特异性coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及龟纹瓢虫特异性COI引物以及含有该引物的检测试剂盒，根据龟纹瓢虫特有的mtDNA序列，设计了一对龟纹瓢虫特异性COI引物PjF1和PjR1（SEQ ID No.1和2），该对引物仅对龟纹瓢虫具有特异性扩增能力，扩增产物大小为256bp，质粒浓度检出限为1.205943134E+04，DNA浓度检出限为0.00585938ng/μL。本发明采用PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及龟纹瓢虫特异性COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
背景技术
龟纹瓢虫Propylea japonica（Thunberg）是鞘翅目瓢虫科的捕食性天敌昆虫，常见于农田杂草以及果园树丛，分布广泛。龟纹瓢虫能捕食瓢虫、叶蝉、飞虱等多种（类）害虫，捕食量大；而且龟纹瓢虫在田间的种群发生密度高，是我国农田生态系统中的优势捕食性瓢虫，在农作物害虫种群的自然控制中发挥着重要作用。
随着对瓢虫捕食行为的深入研究，发现瓢虫间普遍存在集团内捕食现象，且该现象对农田生态系统中不同物种的种群动态以及对害虫生物防治效果产生复杂而巨大的影响。由于瓢虫种类繁多，常规的肠道解剖、行为观察等传统研究方法无法准确评估瓢虫间集团内捕食作用。为了准确鉴定瓢虫种类及科学评估瓢虫的集团内捕食作用，需要建立一套快速而准确的分子检测方法，但目前还没有针对龟纹瓢虫的标准检测方法。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速等特点，可根据物种特异性引物清楚区分至种，在物种种类鉴定中占据重要地位。
发明内容
本发明的目的是提供龟纹瓢虫特异性COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
为了实现本发明目的，本发明根据龟纹瓢虫的线粒体DNA序列，设计一对龟纹瓢虫特异性COI引物，其包括：
正向引物PjF1：5'-AAATGACCAAATTTATAATGTT-3’
反向引物PjR1：5’-TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3’。
本发明还提供含有引物PjF1和PjR1的用于检测龟纹瓢虫的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述引物PjF1和PjR1，以及含有引物PjF1和PjR1的试剂盒在检测龟纹瓢虫中的应用。
本发明还提供一种龟纹瓢虫的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：
1）提取样品DNA；
2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物PjF1和PjR1进行PCR扩增反应；
3）分析PCR产物。
PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环，不用延伸。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为256bp的DNA扩增条带（SEQ ID No.3），则判定样品为龟纹瓢虫。
本发明根据GenBank中公布的龟纹瓢虫线粒体DNA序列（Accession No.KC510124），设计一对特异性COI引物，该引物特异性强，只对龟纹瓢虫具有扩增能力，而对其近源种、属瓢虫以及其他昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测龟纹瓢虫，准确性高，可扩增出256bp大小的片段。PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在4个小时内完成检测（视检测样本数而定），且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为1.205943134E+04，DNA浓度检出限为0.00585938ng/μL。本发明方法在龟纹瓢虫检测/监测方面具有很高的实用价值，适于基层推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中龟纹瓢虫特异性引物PjF1/PjR1的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。
图2为本发明实施例2中龟纹瓢虫特异性引物PjF1/PjR1的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-16为模板DNA浓度3ng/μL依次2倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
图3为本发明实施例2中龟纹瓢虫特异性引物PjF1/PjR1的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-7为模板质粒浓度1.205943134E+07依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1引物PjF1/PjR1对龟纹瓢虫的扩增效果
（1）龟纹瓢虫基因组的制备
将单头龟纹瓢虫放入1.5mL离心管中将其磨碎，用TIANampGenomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（天根生物有限公司，北京）提取单头瓢虫基因组。将DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。
（2）合成检测龟纹瓢虫的特异性COI引物
特异性COI引物序列如下：
PjF1:5'-AAATGACCAAATTTATAATGTT-3'（SEQ ID No.1）
PjR1:5'-TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3'（SEQ ID No.2）
（3）PCR扩增
反应体系为20μL，包括：10×EasyTaq缓冲液2.0μL、dNTP（2.5mM）0.4μL、EasyTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、正、反向引物（10μM）各0.4μL、模板DNA1.0μL、ddH2O15.6μL。
PCR扩增程序：94℃预变性4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环，不用延伸。
（4）PCR产物鉴定
取10μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
（5）结果
利用引物PjF1/PjR1，以龟纹瓢虫DNA为模板，以常见瓢虫以及其他昆虫种类（见表1）为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，7、8泳道对应的龟纹瓢虫扩增出了256bp的目的条带，说明本发明的引物特异性强。回收上述256bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID No.3所示。
表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
实施例2引物PjF1/PjR1对龟纹瓢虫最低检出量的测定
1）龟纹瓢虫模板DNA的制备
按实施例1提取单头龟纹瓢虫基因组DNA，然后原模板溶液（DNA溶液浓度为3ng/μL）以2倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。
利用引物PjF1/PjR1做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的龟纹瓢虫基因组DNA为模板进行PCR扩增，DNA浓度检出限为0.00585938ng/μL（图2）。
2）龟纹瓢虫质粒的制备
按实施案例1对龟纹瓢虫基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pEasy-T3载体上（按试剂盒说明操作），重组质粒转化Trans1-T1感受态细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。经蓝白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，第二天用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，然后提取的质粒以10倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。
利用引物PjF1/PjR1做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的龟纹瓢虫质粒浓度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限（拷贝数）为1.205943134E+04（图3）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.龟纹瓢虫特异性COI引物，其特征在于，其包括：
正向引物PjF1：5'-AAATGACCAAATTTATAATGTT-3’
反向引物PjR1：5’-TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测龟纹瓢虫的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测龟纹瓢虫中的应用。
6.龟纹瓢虫的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品DNA；
2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物PjF1和PjR1进行PCR扩增反应；
3）分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μL计为：
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环。
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