CN105132549A - 绿豆特异性pcr引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供绿豆特异性PCR引物对，其是根据GenBank中公布的绿豆rbcL序列(AP014692.1)设计的一对特异性引物，该引物对特异性强，仅对绿豆具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。本发明还提供利用该引物对检测植食性昆虫体内微量绿豆的方法。采用本发明提供的方法和引物检测绿豆，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4.49E+03。通过对取食过绿豆的绿盲蝽DNA进行扩增，检测率达到100％，证明了该方法的可行性。

Description

绿豆特异性PCR引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及绿豆特异性PCR引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法。
背景技术
绿豆(Vignaradiata(L.)Wilczek)，属于豆科。别名青小豆、菉豆、植豆等，在中国已有两千余年的栽培史。其种子和茎被广泛食用。绿豆汤是家庭常备夏季清暑饮料，清暑开胃，老少皆宜。
绿豆也是许多昆虫所偏好的寄主植物，如绿盲蝽、三点盲蝽、绿豆象等。昆虫与植物间的关系一直是研究的热点。昆虫对植物的取食以及昆虫在植物间的转移扩散方面的研究，传统方法是通过昆虫种群数量的变化动态来间接反映，或通过解剖观察法，标记法等。但是这些方法都存在费时，费力，花费较高，不易成功等缺陷。
PCR检测技术是通过特异序列扩增靶区域DNA，利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为昆虫对植物的取食的定性与定量以及昆虫在植物间的转移扩散分析提供了有效的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供绿豆特异性PCR引物对。
本发明的另一目的是提供检测植食性昆虫体内微量绿豆的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的绿豆特异性PCR引物对是根据GenBank中公布的绿豆rbcL序列(AP014692.1)设计的，所述引物对包括：
正向引物LraF1：5'-TCACATCGAACCTGTTCCTGGG-3’(SeqIDNo.1)
反向引物LraR1：5'-CCACCACGAAGACATTCATAAA-3’(SeqIDNo.2)
本发明还提供含有所述引物对的用于PCR检测绿豆的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括2×PCRMasterMix。2×PCRMasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司(Tiangen公司)，货号CW2347。
更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述引物对或所述试剂盒在检测绿豆中的应用。
所述应用包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用引物LraF1和LraR1进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
本发明进一步提供检测植食性昆虫体内微量绿豆的方法，包括以下步骤：1)用CTAB法提取待测昆虫总DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用引物LraF1和LraR1进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
其中，PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；72℃5分钟。
步骤3)中采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，绿豆的扩增产物大小为323bp。
本发明根据GenBank中公布的绿豆rbcL序列(AP014692.1)设计一对特异性引物，该引物特异性强，仅对绿豆具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测绿豆，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4.49E+03。通过对取食过绿豆的绿盲蝽DNA进行扩增，检测率达到100％，证明了该方法的可行性。
附图说明
图1为本发明实施例1中绿豆特异性引物LraF1/LraR1的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bpladder；1-94为表1，表2中序号所对应物种的扩增结果，-为阴性对照。
图2为本发明实施例2中绿豆特异性引物LraF1/LraR1的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bpladder；1-10为模板质粒浓度4.49E+10依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
图3为发明实施例3中绿豆特异性引物LraF1/LraR1对取食了绿豆的绿盲蝽DNA的检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bpladder；1-10为绿盲蝽的扩增结果；+为绿豆DNA的检测结果，-为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1特异性引物LraF1/LraR1对绿豆的扩增效果
1、绿豆基因组DNA的制备
将绿豆叶片放入研钵中将其磨碎，用DNAquickPlantSystem快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型)(Tiangen公司)提取绿豆基因组。将DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。
2、合成检测绿豆的特异性引物
根据GenBank中公布的绿豆rbcL序列(AP014692.1)设计如下特异性PCR引物对：
LraF1：5'-TCACATCGAACCTGTTCCTGGG-3’(SeqIDNo.1)
LraR1：5'-CCACCACGAAGACATTCATAAA-3’(SeqIDNo.2)
3、PCR扩增
反应体系20μL：
PCR扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟。
4、PCR产物鉴定
取6μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
5、结果
利用引物LraF1/LraR1，以绿豆DNA为模板，以绿豆同域的46种其他物种(见表1、表2)为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，3、4泳道对应的绿豆扩增出了323bp的目的条带，说明根据绿豆的rbcL序列设计的PCR扩增引物特异性强。回收上述323bp的目的条带，进行测序，结果如SeqIDNo.3所示。
表1引物特异性检测中所涉及的植物种类
表2引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
实施例2引物LraF1/LraR1对绿豆最低检出量的测定
1、绿豆模板基因组的制备，参照实施例1中步骤1操作。
2)绿豆质粒的制备
按照实施例1中步骤3的方法对绿豆基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pEasy-T3载体上(按试剂盒说明操作)，重组质粒转化Trans1-T1感受态细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。经蓝白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，次日用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，所得质粒按10倍浓度进行梯度稀释，直至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中步骤3的描述。
利用引物LraF1/LraR1进行最低检出量的测定，以不同稀释倍数的绿豆质粒浓度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限(拷贝数)为4.49E+03(图2)。
实施例3利用引物LraF1/LraR1对昆虫体内微量的绿豆进行检测
1、将10头绿盲蝽饥饿处理24小时，用绿豆叶子饲喂3小时后，立即用液氮冷冻处死。
/2、将单头绿盲蝽放在1.5ml的离心管中研碎，用CTAB法提取DNA。
在离心管中加入40μL的PBS(150mMNaCl,150mMNA3PO4,pH7.2，)，随后加入450μL的TES缓冲液(0.1MTris，pH8，10mMEDTA,2％SDS)、10μL的蛋白酶K(10mg/ml)和10mg的PVP，在金属浴58℃放置12h。从金属浴中取出后加入150μL的5MNaCl和65μL的10％CTAB，将样品在金属浴65℃放置10分钟，取出后加入氯仿/异戊醇(24：1)进行抽提，静置后加入225μL的5MNH4Ac，冰上放置30分钟以上，取出后12000g离心20分钟，弃上清。向沉淀中加入异丙醇，沉淀过夜。12000g离心20分钟，弃上清，沉淀用70％的酒精洗涤，晾干后，加入100μL的ddH2O溶解DNA。
3、采用LraF1/LraR1按实施例1中步骤3的方法对绿盲蝽DNA进行PCR扩增，10头绿盲蝽均检测到取食了绿豆(图3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.绿豆特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对包括：
正向引物LraF1：5'-TCACATCGAACCTGTTCCTGGG-3’
反向引物LraR1：5'-CCACCACGAAGACATTCATAAA-3’。
2.含有权利要求1所述引物对的用于PCR检测绿豆的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×PCRMasterMix。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测绿豆中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LraF1和LraR1进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以20μL计为：
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；72℃5分钟。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，绿豆的扩增产物大小为323bp。
10.检测植食性昆虫体内微量绿豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用CTAB法提取待测昆虫总DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LraF1和LraR1进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物；
其中，PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；72℃5分钟。
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