CN103740812B - 一种鉴定燕麦属物种a、c基因组的方法 - Google Patents

一种鉴定燕麦属物种a、c基因组的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法，以待鉴定材料DNA为模板，以SEQ？ID？No.3和4所示序列为引物，扩增含有如SEQ？ID？No.1/2所示序列的片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳结果，若扩增得到大小约830bp的片段，则表明此材料中含有A基因组，若扩增得到大小约730bp的片段，则表明此材料中含有C基因组，若扩增得到两条大小分别为830p和730bp左右的条带，则表明此材料含有A和C基因组。本发明方法能够快速、准确地鉴定燕麦材料中是否含有A、C基因组，根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，适合于基层推广使用。

Description

一种鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法。
背景技术
燕麦属(AvenaL.)隶属于禾本科(Poceae)，燕麦簇(Aveneae)。全世界约有30个物种，包含AA、CC两种基因组类型的二倍体，AABB、AACC、CCCC三种基因组类型的四倍体以及AACCDD一种基因组类型六倍体。燕麦属物种中含有许多优质基因，如抗病基因，耐旱基因等，是作物遗传改良重要的基因库。广泛搜集并鉴定燕麦属种质资源不仅有利于筛选出具有更多优异基因的种质资源，更能够为燕麦属物种进化提供更多的材料。因此，亟待开发一种快速稳定的方法对搜集的燕麦属新材料所含染色体类型进行初步鉴定，然后结合形态学和细胞学等方法为新材料的准确分类奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法。
为了实现本发明目的，本发明基于燕麦属物种中A、C基因组上相同基因在片段大小上的差异，提供一种用于PCR检测燕麦属物种A、C基因组的特异性引物对，所述引物对为：
正向引物rpb2-F：5’-AATCACATACGAGCAATAAACG-3’(SEQIDNo.3)
反向引物rpb2-R：5’-GCTGAAACACCCGAAGGA-3’(SEQIDNo.4)
本发明还提供含有上述引物对的用于检测燕麦属物种A、C基因组的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。
本发明进一步提供一种鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法，包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1中所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物；若扩增产物大小约830bp(SEQIDNo.1)，则表明样品中含有A基因组，若扩增产物大小约730bp(SEQIDNo.2)，则表明样品中含有C基因组，若扩增得到两条大小分别为830p和730bp左右的条带，则表明样品中含有A和C基因组。
前述方法中，所述样品是指燕麦属材料的根、茎、叶。
PCR反应体系以25μl计为：
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
本发明方法能够快速、准确地鉴定燕麦材料中是否含有A、C基因组，根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，适合于基层推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例1燕麦属材料A、C基因组PCR鉴定结果；其中，M为DNA分子量标准，1-8号泳道分别为材料A.murphyi、A.insularis、A.clauda、A.brevis、A.fatua、A.sativa、A.sterilis、A.ventricosa。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法
1.材料及来源
选取来自世界不同国家和地区的燕麦属材料44份，其中A基因组二倍体10份，C基因组二倍体10份，AB基因组四倍体10份，AC基因组四倍体4份，ACD基因组六倍体10份。
2.DNA提取
种子发苗后采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取植物总DNA。
表1为材料编号，染色体组成，种子库编号以及来源地。
表164份燕麦属材料
3.PCR扩增
引物序列为：
rpb2-F：5’-AATCACATACGAGCAATAAACG-3’
rpb2-R：5’-GCTGAAACACCCGAAGGA-3’
上述引物由华大基因工程有限公司(北京)合成。
25μlPCR反应体系：
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。从图1可以看出，所有含有A基因组的燕麦材料扩增出大小约为830bp(SEQIDNo.1，831bp)的条带，含有C基因组的燕麦材料扩增出大小约为730bp(SEQIDNo.2，727bp)的条带，含有A和C基因组的燕麦材料扩增出两条条带，大小分别约为830bp和730bp。
分别取燕麦材料的根、茎、叶三个部分，提取DNA，进行鉴定，结果与以上完全相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.用于PCR检测燕麦属物种A、C基因组的特异性引物对，其特征在于，所述引物对为：
正向引物rpb2-F：5’-AATCACATACGAGCAATAAACG-3’和反向引物rpb2-R：5’-GCTGAAACACCCGAAGGA-3’。
2.含有权利要求1所述引物对的用于检测燕麦属物种A、C基因组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.一种鉴定燕麦属物种A、C基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品中的DNA；
2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求1中所述引物对，进行PCR扩增反应；
3）分析PCR产物；若扩增产物大小约830bp，则表明样品中含有A基因组，若扩增产物大小约730bp，则表明样品中含有C基因组，若扩增得到两条大小分别为830p和730bp左右的条带，则表明样品中含有A和C基因组。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25μl计为：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。
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燕麦属物种系统发育与分子进化研究;彭远英;《中国博士学位论文数据库 农业科技辑》;20100715(第07期);摘要，第一章概论，第八章燕麦属基因组特异标记开发，表8-2，图8-1，结论 *
燕麦研究最新进展;刘迎春等;《青海科技》;20111225(第6期);第20-23页 *

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