CN107012253B - 一种鉴定栽培燕麦母本的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定栽培燕麦母本的方法，步骤包括：(1)提取待测栽培燕麦的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；(3)通过PCR扩增产物的核苷酸序列鉴定栽培燕麦的母本。本发明还提供了鉴定栽培燕麦母本的专用引物对，以及含有该专用引物对的试剂盒。本发明利用分子学手段对栽培燕麦进行鉴定，避免了利用形态学方法进行鉴定时存在的证据不足等问题，实现了对栽培燕麦的遗传资源更加合理、准确的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定植物品种的方法，具体属于一种鉴定栽培燕麦母本的方法。
背景技术
燕麦是世界性的古老粮草兼用作物，更是糖尿病患者的专属食材。因其富含一种水溶性膳食纤维(β-葡聚糖)，对预防和治疗人类“三高症”具有显著功效，而受到全世界的热捧。目前，世界各地的燕麦栽培品种已达数百种；在我国，自六七十年代起，已经育成的燕麦栽培品种也有上百种。然而栽培燕麦的品质和产量却没有因为品种的增多而得到改善。因此，鉴定栽培燕麦的亲本，厘清燕麦栽培品种间的亲缘关系，提高燕麦育种工作的效率一直是人们关注的内容。目前燕麦品种培育中用的亲本都是通过对一些形态特征的筛选而确定的，这些形态特征可能是由环境的影响造成的，并不能在后代中遗传，因此降低了育种效率，浪费了大量的人力和财力。
叶绿体DNA(cpDNA)具有拷贝数高、分子量小、无组织特异性、进化速度快等特点，在遗传上具有自主性，是严格的母系遗传。ccsA-ndhD是叶绿体DNA中变异速率较快的一个片段，研究发现，ccsA-ndhD的碱基替换速率比cpDNA分子的其它区域高5-10倍。这一片段具有很多的信息位点，在揭示种内不同个体之间遗传差异方面有广泛的应用，利用cpDNAccsA-ndhD碱基突变来鉴定不同群体、个体的亲缘关系已经在人参、山药、藻类等多种植物中开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定栽培燕麦母本的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于鉴定栽培燕麦母本的专用引物对，是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
一种用于鉴定栽培燕麦母本的试剂盒，它包括所述专用引物对；还可包括PCR扩增的常规试剂，如缓冲液、dNTP、Taq酶等。
一种鉴定栽培燕麦母本的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测栽培燕麦的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的引物对序列为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2；
(3)通过PCR扩增产物的核苷酸序列鉴定栽培燕麦的母本。
所述栽培燕麦的总DNA的提取方法可为标准的CTAB法。
所述PCR扩增的反应体系可以如下：双蒸水23.1ul；10×tris-HCl缓冲液(pH8.3，500mM KCl,15mM MgCl2)3ul；dNTP(2.5mM)0.7ul；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各1ul；Taq酶(5U/ul)0.2ul；DNA模板1ul(30ng)。
所述PCR扩增的程序具体可为：94℃--5分钟；然后以94℃--10秒，60℃--20秒，72℃--30秒，循环35次；最后在72℃保温5分钟。
所述专用引物对、所述试剂盒或所述方法均可应用于栽培燕麦遗传资源鉴定。
本发明针对叶绿体ccsA-ndhD设计了一对专用引物，该专用引物可以分析栽培燕麦的母本，从而对栽培燕麦的遗传资源进行鉴定，避免了利用形态学原理进行鉴定时存在的证据不足等问题，可实现对栽培燕麦的遗传资源进行更加合理、准确的鉴定。
附图说明
图1为鉴定栽培燕麦母本的流程图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、栽培燕麦母本的鉴定
对667个栽培燕麦样品分别进行ccsA-ndhD测定，每个样品测定步骤如下：
1、利用标准的CTAB法对栽培燕麦叶片进行总DNA提取；
2、对步骤1提取的总DNA进行PCR扩增：PCR扩增的引物对：
正向引物:5’-GGTTTGCATAGTTATGGTTCGT-3’(SEQ ID No.1)；
反向引物:5’-CTGGACCACGGGAACTCTTT-3’(SEQ ID No.2)。
PCR扩增体系：双蒸水23.1ul；10×tris-HCl缓冲液(pH8.3，500mM KCl,15mMMgCl2)3ul；dNTP(2.5mM)0.7ul；SEQ ID No.1(10uM)1ul；SEQ ID No.2(10uM)1ul；Taq酶(5U/ul)0.2ul；DNA模板1ul(30ng)。
PCR扩增程序：94℃--5分钟；然后以94℃--10秒，60℃--20秒，72℃--30秒，循环35次；最后在72℃保温5分钟。
3、将步骤2扩增得到的PCR产物利用天根公司生产的普通DNA产物纯化试剂盒纯化。
4、利用测序仪对纯化的PCR产物进行测序获得一段核苷酸序列。
667个栽培燕麦样本的PCR扩增产物的测序结果见表1。
表1 667个栽培燕麦样本的PCR扩增产物的测序结果
| 单倍型 | 个体数 | 序列号 |
| hap1 | 210 | 见SEQ ID No.3 |
| hap2 | 457 | 见SEQ ID No.4 |
将栽培燕麦的ccsA-ndhD核苷酸序列通过MEGA软件进行比对并手工校正。根据序列分析的结果可以判定栽培燕麦的样本间是否存在序列变异。在栽培燕麦667份样本中仅检测到2个单倍型，将这2个单倍型一次标注为hap1和hap2(单倍型对应的序列见表1)。
分别以栽培燕麦ccsA-ndhD序列的hap1和hap2作为检索对象，在NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)数据库中进行搜索比对，发现hap1与Avenasterilis(GenBank Accession Number:KX756180)中的293bp序列相似度为100％；hap2与Avena sativa(GenBank Accession Number:KM974733)中的293bp序列相似度为100％。
从以上示例可以看出，应用叶绿体ccsA-ndhD能够揭示栽培燕麦的母本，从而能够对栽培燕麦的遗传资源进行合理、准确的鉴定，对燕麦的育种工作具有重要的指导意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西大学
<120> 一种鉴定栽培燕麦母本的方法
<130> .
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Avena
<400> 1
ggtttgcata gttatggttc gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Avena
<400> 2
ctggaccacg ggaactcttt 20
<210> 3
<211> 293
<212> DNA
<213> Avena sterilis
<400> 3
ctgaaacctt catgaaatgc acgtttttac ttttttgttt tatttgagaa ccctttgaac 60
gccctctcaa agggttctca aataaaacaa aaaagatcta attagacttt ttactttttt 120
ctgcattaat agtaatagag cggactaatt aaaaaaacct atttaggata ataattggat 180
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cctattactg gtaaaaagat acagattaaa ataaagagtt cccgtggtcc aga 293
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Claims (2)
1.一种鉴定栽培燕麦母本的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测栽培燕麦的总DNA；
（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的引物为序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对；
（3）通过PCR扩增产物的核苷酸序列鉴定栽培燕麦的母本；
所述PCR扩增的反应体系如下：双蒸水23.1ul；10×tris-HCl缓冲液pH8.3，500mM KCl,15mM MgCl2 3ul；dNTP 2.5mM 0.7ul；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各1ul；Taq酶5U/ul0.2ul；DNA模板1ul 30ng；
所述PCR扩增的程序为：94℃--5分钟；然后以94℃--10秒，60℃--20秒，72℃--30秒，循环35次；最后在72℃保温5分钟。
2.如权利要求1所述的一种鉴定栽培燕麦母本的方法，所述栽培燕麦的总DNA的提取方法为标准的CTAB法。
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