CN116837130A - 一种侧柏dna条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用 - Google Patents

一种侧柏dna条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种侧柏DNA条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用，涉及生物技术领域。所述DNA条形码为核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的侧柏trnS‑trnG spacer+intron序列片段、SEQ ID NO.2所示的侧柏trnT‑5’trnL序列片段、SEQ ID NO.3所示的侧柏RbcL序列片段，所述DNA条形码引物根据以上3个序列设计而成。本发明获得的DNA条形码及其叶绿体DNA引物可以从母系遗传的角度评价侧柏的遗传多样性水平，解析侧柏群体在叶绿体DNA水平上的遗传多样性，对于侧柏属种质资源遗传多样性保护和有效利用具有重要意义。

Description

一种侧柏DNA条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种侧柏DNA条形码的引物组合及其检测方法与应用。
背景技术
侧柏(Platycladusorientalis(L.)Franco)是柏科侧柏属常绿针叶乔木，分布于我国东北、华北、西北、华中、东南、西南等20余个省(区、市)，种质资源丰富。侧柏抗旱耐瘠薄、适应性强，是重要的生态抗逆树种。侧柏材质细密，可制作器具、家具等，侧柏种子和鳞叶可入药，侧柏挥发性次生代谢物是重要的香料成分，具有重要的经济和社会价值。
遗传多样性是指种群内个体之间及种群间遗传变异的总和。遗传多样性分析有助于有效评价、保护侧柏种质资源并建立合理的评价体系，进而为侧柏种质资源创新利用提供科学依据。随着科技进步与发展，植物遗传多样性的检测手段得到了提高和改进，继形态标记、细胞学标记、生化标记后，DNA分子标记能够反映植物基因组DNA序列的变异，可以直接检验DNA水平上的差异，已经广泛用于植物遗传多样性研究。DNA条形码技术是用生物体DNA中的一段保守片段对物种进行快速定位、准确鉴定的技术，具有操作简便、准确性高等特点，在遗传多样性分析、系统发育、种质鉴定等方面应用广泛。
现有技术中目前在侧柏方面的分子标记开发还较少，并未记载有针对侧柏的DNA条形码及叶绿体DNA引物用于鉴定侧柏种质资源，无法满足当前侧柏遗传学研究和遗传改良研究中的科研需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于侧柏属植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等遗传分析的DNA条形码、叶绿体DNA引物及其应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于侧柏遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等遗传分析的引物对组合物，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；
引物对甲为特异结合侧柏的叶绿体基因组trnS-trnGspacer+intron的一对引物，所述trnS-trnGspacer+intron是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.1的双链DNA片段；
引物对乙为特异结合侧柏的叶绿体基因组trnT-5′trnL的一对引物，所述trnT-5′trnL是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.2的双链DNA片段；
引物对丙为特异结合侧柏的叶绿体基因组RbcL的一对引物，所述RbcL是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.3的双链DNA片段。
具体而言，所述引物对甲是由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对乙是由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对丙是由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的引物对。
使用前述引物对组合物进行PCR扩增时，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性60s，60-50℃降落退火60s，72℃延伸90s，10个循环；95℃变性60s，60-50℃降落退火60s，72℃延伸90s，25个循环；最终72℃延伸10min。
所述PCR扩增反应体系为50μL，包括10×Buffer5μL，2.5mMdNTP4μL，正向引物0.75μL(20μM)，反向引物0.75μL(20μM)，模板DNA2.5μL，ExTaq酶0.5Μl，ddH2O36.5μL。
其中，扩增trnS-trnGspacer+intron序列的正反引物如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，测序时还需要如SEQ ID NO.6所示的加测引物。扩增trnT-5′trnL序列的正反引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，测序时无需加测引物。扩增RbcL序列的正反引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，特别的，测序时还需要如SEQ ID NO.11所示的加测引物。
本发明还提供了一种用于鉴别侧柏的产品，其包括前述引物对组合物。
上述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由上述用于鉴定侧柏多样性或亲缘关系的引物对组合物和下述至少一种试剂和/或仪器组成的系统：进行PCR扩增所需的其它试剂、进行凝胶电泳所需的试剂、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和照相机。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将前述引物分别单独包装的步骤。
当进行PCR时，SEQ ID No.4所示单链DNA和SEQ ID No.5所示单链DNA的摩尔比、SEQ ID No.7所示单链DNA和SEQ ID No.8所示单链DNA的摩尔比、SEQ IDNo.9所示单链DNA和SEQ ID No.10所示单链DNA的摩尔比均为1:1。
本发明还提供了前述的引物组对合物或产品的如下任一种应用：
m1)侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类；
m2)侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
m3)侧柏属植物分子标记辅助育种；
m4)侧柏属植物种质资源保护与利用；
m5)制备侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类的产品；
m6)制备侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；
m7)制备侧柏属植物分子标记辅助育种的产品；
m8)制备侧柏属植物种质资源保护与利用的产品。
本发明还提供了一种鉴别或辅助鉴别侧柏品种资源的方法，包括如下步骤：以前述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测样品的叶绿体基因间区序列，根据遗传距离对待检测样品的叶绿体基因间区序列进行聚类分析，若任意两个待测样品的叶绿体基因间区序列遗传距离为0，则两个待测样品为同一品种或种质或候选为同一品种或种质，若任意两个待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列遗传距离不为0，该两个待测侧柏样品不为同一品种或种质或候选为非同一品种或种质。
具体而言，所述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列具体包括如下步骤：
1)用前述SEQ ID No.4和SEQ ID No.5组成的引物对、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8组成的引物对、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10组成的引物对分别对待测样品进行PCR扩增，得到各引物对的PCR扩增产物；
2)测序所述各引物对的PCR扩增产物，将待测侧柏样品的各引物对的PCR扩增产物的测序结果拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列。
本发明还提供了一种进行侧柏属植物遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
1)采用前述引物对组合物对各待测侧柏种质的基因组DNA进行PCR扩增并测序，获得trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL序列；
2)将各待测侧柏的rnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL序列使用LaunchDnaSPver6软件分析遗传多样性参数，完成侧柏遗传多样性分析。
所述遗传多样性参数包括核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)。
若单倍型多样性(Hd)＞0.5，则说明遗传多样性较高。
所述单倍型多样性是指不同待检测侧柏的trnS-trnGspacer+intron(和/或trnT-5′trn L、和/或RbcL)的序列的单倍型多样性。
本发明还提供了一种侧柏属植物亲缘关系鉴定的方法，包括如下步骤：
1)采用前述引物对组合物对各待测侧柏的基因组DNA进行PCR扩增并测序，获得叶绿体DNA间区的完整序列；
2)将各待测侧柏的上述叶绿体DNA间区的完整序列进行比对，根据各待测侧柏的遗传距离构建系统发育树，分析各待测侧柏所属居群间的亲缘关系；若两个居群在一个分支，则说明二者亲缘关系较近，属于一个进化分支。
本发明还提供了一种DNA条形码，包括前述trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL。
上述任一所述应用或方法中，所述侧柏不仅包括侧柏属的各种品种、无性系、家系、优株，还包括其变种、栽培变种，以及它们的无性繁育(如扦插繁殖、嫁接繁殖)后代。
本发明基于侧柏叶绿体基因组序列开发设计获得了三个DNA条形码及其扩增叶绿体引物，并利用不同来源的侧柏种质资源验证了本发明开发的DNA条形码及其扩增引物在遗传多样性分析、亲缘关系鉴定方面的有效性。通过实验证明：本发明开发的DNA条形码及其叶绿体DNA引物实现了侧柏种质资源的准确鉴别，从母系遗传的角度揭示了侧柏的遗传多样性水平，有效丰富了侧柏属种质亲缘关系分析和遗传多样性评估的技术方法。利用本发明开发的DNA条形码及其叶绿体DNA引物能够进行侧柏属植物亲缘关系鉴定、遗传多样性分析等工作。可有效评估侧柏遗传多样性、系统发育和种质鉴定
附图说明
图1为本发明实施例2中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例2中31份侧柏品种资源的聚类图；
图3为本发明实施例2中的不同来源侧柏的居群亲缘关系树。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1叶绿体DNA引物设计
1、3个侧柏叶绿体DNA基因间区
(1)从GenBank(GenBank登录号：KX832626.1)中下载侧柏(Platycladusorientalis)的叶绿体DNA全基因组序列，从叶绿体DNA全基因组中获得3个基因间区trn S-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.1、SE Q IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。
trnS-trnGspacer+intron(SEQ ID NO.1)是下述序列中大写字母所示核苷酸序列，共计1729bp，具体如下：
caagtgactgaacggagagagagggattcgaaccctcggtacaaatagttTGTACAACGGATTAGCAA TCCACCGCTTTAGTCCGCTCAGCCATCTCTCCTAGATGGCAGATCTAAAATGAATATAGCATTTCACTAAATAAAGACCAACATTTGTGAGAATCCAATTTTCTGTTCTTTATTCCGTTCCAAACAATTCATAGCCCGGCCAGTATCTGGCCAGGCTATTATCTTTCCTAGATAAGGAATTAATTGACCAAATTATGAGGAATACAGTGCTCTACCTAATCTGAAAACTAAAATAATTGTTATAAAAGTAACAGCAATAAAAAGGGCTATCAAAATTTGACCTTGTAATATCATTTGTTTATTTCCTTTTTTTCAATTTTTCTTTTGTTATTATATAAACAATAAGTTATCATAATATAATAGATAAGCACTACTCTTCTCTTTTTAATTCCAACTGTTTCAGATTCTAATCTGGATGAGATGTTCTAGATTGAAAATGGATAGATTGAAGGATAAAAAAGAGATTTCAAAGACTAAGAGTGGATTCTTTTTCATTTTAATGAAAATGATCATAATTTTCATTTTCTATATCTGTCATAAAAAAAAAAAAAAAACTAATTCAAAATTGTTAATAGTTAGAACAACTATCTATTAATTAGAATGGATAGTAACTAATATAATACTTATTAGTAATGGAGTATTCCCTATAATATTGATTATAAATTATTCTTGTAAGAGTAAAAACAAAACAATTTTTACAAGGTAAGGAACGGAGGGAGTGAAAAGAAACTATCTGTTATTGAATTTTCAGAAATAGGAAAATATGATGATAGGAACTTGCATTAGATTCTTATTAGAATCTAAAAATGATTTTTTCTTTTCCCTATTGGACAAAAAATCGATCTGTATGATACAATGAAATTGTGGCGGGTATAGTTTAGTGGTAAAAGTGTGATTCGTTCTATCATTATATTCAGCAGAGTTGAAGGATCTTTCAACTCTCGTTTTTAGTTTAGAAAAAACTATATTTCTATATAGGTTTTAAACCTCTCCTATGAATACCCTGGGTCAGGAAAGGAATTGTGCACATTCTCGTAATTTGAATTTGGAATGATAAAATGACCATATTTTCCATTCCATTCAAGATGGCGAAACAGAATGTAGAATGTTTTCAAGGATTAGACCGATCTGCCTAATCGGATCAATCAAAGATCCATGGATATCAAAATATTATTTTTCACCGTAACTAAATGTTCAACTGCTAAAATAGCAAAAGTTGGAGTCAAATAGCTAGATAACAGTGACTTTGGTTTACTTTAGTCACCGTGATTTTGTTTGAGCTCGGTGAAATTTGGTTTCCTCTAGGATCGCAATCAGTAGAAATAGGGAACGAAATAATTAGAAAGATTTTTGAGTCCAATATTAAGAATTTTTCAATCTGATCTTTCTATAGGGATCATCTATCAAGTGAAGAGATATTTTCTATTTAAGGTTGTTAACCTGAAGTTAAGAGGAAAGAACTACATATAAACTAACATAGATGTTATGGAGCAGAGCATAAATAATTTATGTATTGATGTGAAATGTGAAAAATCGTTTTGTTATTAGACCTCCCTTTTTATCTCTCTCTCATGGAGGAGCCGAATGAAATGAAATTTTCATGTTCGGTTCTGAATTAGAGGCGTTAATCAACGTCGACTATAACCCCTAGCCTTCCAAGCTAACGATGCGGGTTCGATTCCCGCTACCCGCTCATTCATATTGCCTTATTcttattcaaaatgttttttttcatgtccatgttacctatctattttttctctttcgttcccgaatctcgttatgaatggag
trnT-5′trnL(SEQ ID NO.2)是下述序列中大写字母所示核苷酸序列，共计1034bp，具体如下：
atgcctatggttgactaattgtctggcttcaggaatagtaagcgccatacccaatcgaaaaaggatattatccaagcgcatttcgagtaattgtaatagaacctgacctgtggatcccttggctcttctagcaatacgaacatattgaagtaattggcgctctggaagtccataatgaaaacgtaatctttgtttttcttttagacggacaggatatttagaaggtttaataggtttaaaatgttttttttttataggctttttaattctgttgggtgttttcttacttagtcctggtaaagttttgagacgacttattatttttaaacgaggtccgcgataacgggacataaaaaactccttatttcaagaaatgacattaactaatgttggaaaGAGGAATAATATAAACAGCACGAATATTGGAATGATTTTATATACAGATAAAAAAACAAATTATCTTCAACTTTCAAATCAAAATATTGTAGAGAAAAAAAAGATATGTTTCAATCATTGATTTCGTTTCTAGTTGAAACGAATCATGCCACGACAGACCCGGCGGACCGACGATTCGAAAAGTAAGAGTCTTGTCCTTATTTCATAGATTTTAACGATCTATGGTTGATTTTAACGATCTATGGTTGATAATGGTAAGAAATGAAAAGAATAAAAACGAGCCAGCTATCGGGATCGAACCGATGACCATCGCATTACAAGTGCGGCGCTCTCACCTCTGAGCTAAGCAGGCTCATATGCATGCAGAAGCAGGCTCATATGCATGCAGTATGTAGTCACATGCTTATTGGCTGAAATGAAAAGATAAAAGATCTCTTCGAAATCACTAGAATTATAGCGAATCGAATTCTAATAATGCAATTCAGATTAAAATGAAACATTGCGTCAACTTATCTTAATTGATTACTATAAATCAATAATGGGGCGTGGCCAAGCGGTAAGGCAGCAGGTTTTGGTCCTGTTATTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCGTCCCAGGTGGAACAGTATTATCGAATTGAAAAAAAAGAAGACTCTTCTTATAGAAGGGAAATATTATTTCGATAAGATTTTAAATAGAGAAAGGGATATTTTTGCGGTGTAGGATGGAACAAGATTGCATCAAAAATGCAGAAAGAATATAATGCTCATGCAAATGAAATAATTGATGGGATGCAATTATTGTTTTTGTTTGTTTTATGATTTCGTTCTACAAGAAGGGGATATGGCGGAATCGGTAGACGCTACGGACTTAAATTTTTTGAGCCTTGGTATGGAAACTTACCAAGTGATAGCATCCAAATCCAGGGAACCCTGGGATATTTTGAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCAATTTACTAGAGACAATAGTTTCCTTTGCGAGAAAGGGATAGGTGCAGAGACTCAACGGAAGCTATTCTAacgaatcaacataatttggattggatacattcgattatttacagaatgtcttttgcattttatttaacgcttgaaaaagtatttgtttttttataaccaaaaccaatatacaaaaataacgattagagtt
RbcL(SEQ ID NO.3)是下述序列中大写字母所示核苷酸序列，共计1846bp，具体如下：
taatagacacaaagttaaaccatcatactttagctcactttgggtgagagctagaagtgattgaaggtctttgccccccaggcctagatctactgatctgatccaccgaccccatcgagtaatccagaatattagagaataggcgaatattcttttctCTAACCGAATTATCTATTCCCATCCAGTCGGTATTCGGCTCAATCTTAAAAGAAAAGATTGGGCCGAGTTCGTTTCGATTAAGGGACCAAACAGACGAAAGTCACTCGATTACAAGCGATCAATCGTATCAAATTCAAATTTGATTTCCTTCCATACTTCGCAAGCGGCAGCTAGTTCAGGACTCCATTTAGTAGCTTCTCGGATCACTTCATTACCTTCACGCGCAAGATCACGTCCTTCATTACGAGCTTGTACACAAGCTTCTAAAGCGACCCGATTAGCCACTGCACCAGGTGCATTTCCCCAAGGGTGCCCCAAAGTCCCTCCACCAAACTGTAATACGGAATCATCTCCAAAGATCTCGGTCAGAGCAGGCATATGCCAAACGTGAATACCTCCTGAAGCTACAGGCAGAACACCCGGCATAGAGACCCAATCTTGAGTGAAATAAATACCACGACTTCGGTCTTTTTCAATAAAATCATCACGTAATAGATCAACAAAACCCAAAGTGACTTCTCGTTCTCCTTCAAGTTTACCTACTACAGTACCAGCATGAATATGATCTCCACCAGACATACGTAGTGCTTTAGCTAGTACACGGAAGTGCATACCATGATTTCTTTGTCTGTCAATAACTGCGTGCATTGCGCGGTGAATGTGAAGAAGTAGGCCGTTATCTCGGCAATAATGAGCCAACGAAGTATTTGCCGTAAAACCTCCAGTCAGATAGTCATGCATGACTATAGGAACTCCCAATTCTCTGGCGAATACTGCTCTTTTAATCATTTCTTCACATGTACCTGCAGTCGCATTCAGGTAATGTCCCTTAATCTCACCCGTCTCAGCCTGAGCTTTATAAAGTGCTTCTGCACAAAAGCAGAAACGATCTCTCCAGCGCATAAATGGTTGGGAATTCACGTTTTCATCATCCTTGGTAAAATCAAGTCCACCACGGAGACATTCATAAACCGCTCTACCATAATTCTTGGCAGATAGACCCAATTTTGGTTTGATAGTACATCCCAACAAAGGACGACCATATTTATTTAATTTATCCCTTTCTACTTGAATACCATGTGGTGGGCCTTGAAAAGTTTTTGAATAAGCAGGAGGAATTCGTAAATCTTCCAGACGTAGAGCCCGTAAAGCTTTGAATCCAAATACATTACCTACAATAGAAGTAAACAGGTTAGTCACAGAGCCTTCTTCAAAAAGATCTAAAGGGTAAGCTACATAGGCAATAAATTGAGTTTCTTCTCCAGGAACGGGTTCAATATCATAGCATCGCCCCTTGTAGCGATCAAGACTGGTAAGTCCGTCGGTCCAAACAGTGGTCCACGTACCAGTGGAAGATTCGGCAGCTACTGCTGCTCCCGCTTCTTCGGGGGGCACTCCAGGTTGAGGAGTGACTCGGAATGCTGCCAAGATATCAGTATCTTTGGTCTGATATTCCGGAGTATAATAAGTTAATCTGTAATCTTTAACACCCGCTTTGAATCCGACACTTGCTTTAGTCTCTGTTTTTGGTGACATAAATAAGTCCCTCCCTATGATTTATTGGTTAATAGCTCTTACAAGAACGAGGTCTACTCGACCTGGGTGTCGAACGTAAAGAATCATTTTTGTATAAAAAAATTTGTACAAAATACTCATTTTGTAGCCTCTATTGTAAAAAAGGCTTTTCTTTCATTCAAGTTATATTCTATCATGTTGTGTATGTATCATGCAACCCAATTTCTTAGTTTGACCTGAGGACCTTTCGGCAATTCCAATTTATTCTATTATTTTTCTTTATCTCAACAAAATTGCATCAGCAGCCTCTAGTCGTGTTCTAGCTCTTTTgagagctacatcagcctcgattgcttgtctcttgccttcagctcgcgcacgatcagctttcgcttttgccagtctaaaactttcctgagcctcttg
2、叶绿体DNA引物设计
利用Primer5.0软件根据trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL的核苷酸序列信息设计引物，目的片段长度在500～1700bp，送至北京博友顺生物技术有限公司合成。
扩增trnS-trnGspacer+intron的引物：
P2-F(SEQ ID NO.4)：5'-TGTACAACGGATTAGCAAT-3'
P2-R(SEQ ID NO.5)：5'-AATAAGGCAATATGAATGAGC-3'
测序trnS-trnGspacer+intron的引物，需要使用P2-F、P2-R及P2-R2，P2-R2序列如下：
P2-R2(SEQ ID NO.6)：5'-TCTACATTCTGTTTCGCCAT-3'
扩增trnT-5′trnL或用于trnT-5′trnL测序的引物：
P3-F(SEQ ID NO.7)：5'-GAGGAATAATATAAACAGCACGA-3'
P3-R(SEQ ID NO.8)：5'-TAGAATAGCTTCCGTTGAGT-3'
扩增RbcL的引物：
P5-F(SEQ ID NO.9)：5'-CTAACCGAATTATCTATTCCC-3'
P5-R(SEQ ID NO.10)：5'-AAAAGAGCTAGAACACGACT-3'
测序trnS-trnGspacer+intron的引物，需要使用P2-F、P2-R及P2-R2，P2-R2序列如下：
P5-F2(SEQ ID NO.11)：5'-CGGCAATAATGAGCCAACGAA-3'。
实施例2侧柏种质资源遗传多样性分析
1、种质资源来源
本实施例所用31份侧柏种质具体如下：
京洒柏1号～京洒柏9号：通过实生选优培育而成的侧柏优系，为京洒柏系列，记载于“国家林业和草原种质资源库”，公众可从北京市农林科学院林业果树研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
侧柏优树1733号、侧柏优树1747号、侧柏优树1773号、侧柏优树1766号、侧柏优树县1774号：来自河南郏县国家侧柏良种基地，记载于“国家林业和草原种质资源库”，公众可从北京市农林科学院林业果树研究所或国家侧柏良种基地获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
蝶叶侧柏和立叶：分别为北京市林木良种、植物新品种，记载于“国家林业和草原种质资源库”，公众可从北京市农林科学院林业果树研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
京柏2301、京柏2302、京柏2303、京柏2304、京柏2305、京柏2306、京柏2307、京柏2308、京平柏1号、京平柏3号、京平柏4号、京平柏5号、京平柏6号、京平柏7号、京海柏1号：记载于“国家林业和草原种质资源库”，公众可从北京市农林科学院林业果树研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
上述种质资源具体信息如下：
表1 31份种质资源资料
2、DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取前述31份侧柏种质叶片的基因组DNA，用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组DNA的纯度和完整性，备用。
3、PCR扩增
根据下表PCR扩增体系和程序，以前述31份侧柏种质的基因组DNA为模板，用实施例1中扩增trnS-trnG spacer+intron的引物、扩增trnT-5′trnL的引物和扩增RbcL的引物分别进行PCR，扩增每份种质的trnS-trnG spacer+intron叶绿体DNA基因间区、trnT-5′trnL叶绿体DNA基因间区、RbcL叶绿体DNA基因间区。
表2 PCR扩增体系
试剂名称 体积
10×Buffer 5μL
2.5mM dNTP 4μL
Primer F(20μM) 0.75μL
Primer R(20μM) 0.75μL
模板DNA 2.5μL
ExTaq酶 0.5μL
ddH2O 36.5μL
表3 PCR扩增程序
将前述PCR扩增获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果如图1所示，其中，从左至右，从上至下，依次为JG1、JG2、JG3、JG4、JG5、JG6、JG7、JG8、JG9、JX1733、JX1747、JX1763、JX1766、JX1774、BJ1、BJ2、BJ3、DY、BJ4、BJ5、LY、BJ6、BJ7、BJ8、BJ9、BJ10、BJ11、BJ12、BJ13、BJ14和BJ15。对于扩增成功并得到单一条带的样品进行切胶回收，按照OMEGA公司E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒说明书进行。然后送测序公司(北京博友顺生物技术有限公司)进行测序，测序仪为美国ABI3730 DNA Sequencer。每个样品在每个叶绿体DNA基因间区的扩增产物均进行正反向测序，获得31份种质的3个叶绿体DNA基因间区的完整序列。
4、数据统计与分析
4.1侧柏种质资源鉴定
对于每个基因间区正反向测序获得的序列进行人工校对，使用MEGA7.0(Kumaretal.2016)软件进行序列拼接、序列比对以及3个叶绿体DNA基因间区片段trnS-trnG spacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL的合并分析，拼接后得到待测样品的叶绿体基因间区序列，通过Neighbour-Joining法进行聚类分析。实验结果如图2所示，从图中可以看出，31份侧柏属种质资源中任意两个叶绿体基因间区序列的遗传距离均不为0，该31份侧柏属种质资源中的任意两个种质不为同种质。本实施例提供的引物对可以将31份侧柏属种质资源全部区分开，鉴定成功率为100％，即前述引物对可以准确鉴定31份侧柏品种(种质)资源。
由此可见，实施例1中的引物可用于鉴定侧柏。
4.2侧柏叶绿体DNA的多态性
使用LaunchDnaSPver6软件计算侧柏叶绿体DNA的遗传多样性参数以及Tajima’sD，包括：变异位点(Vs)、单一突变位点(Ss)、简约信息性位点(Ps)、单倍型数(h)、单倍型多样性(Hd)、单倍型多样性方差(Vh)和单倍型多样性标准差(Sh)。这些参数是叶绿体DNA遗传多样性分析的参数指标，也均是LaunchDnaSPver6软件中的参数。结果如表4和表5所示。trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL片段的长度分别为1550bp左右、878bp左右和1611bp左右。
31份种质资源中：长度为1611bp的RbcL的核苷酸多态性最高，包括7个单一突变位点，1个简约信息位点和6个插入/缺失位点。长度为878bp的trnT-5′trnL有1个简约信息位点和6个插入/缺失位点；长度为1550bp的trnS-trnGspacer+intron有3个单一突变位点，2个简约信息位点和14个插入/缺失位点。3个叶绿体基因片段合并后，序列长度4039bp，共有多态位点13个，其中单一突变位点10个，简约信息位点3个，插入/缺失位点25个。31份侧柏种质的3个叶绿体基因间区共有变异位点13个。trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL区域的变异位点分别为5、1、8个，变异位点差别较大的区域集中在RbcL区域上，其核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸差异(k)均为最大，说明它是侧柏cpDNA片段中核苷酸多态性较高的区域。
表4侧柏31份种质的3个叶绿体DNA区域的多态性信息
trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL区域单倍型(h)数分别为4、2、4个，以RbcL区域单倍型(基因)多样性最高(0.514)，trnS-trnGspacer+intron区域单倍型(基因)多样性最低，为0.342。3个区域合并后的叶绿体基因片段，共有单倍型9个。核苷酸多态性、平均核苷酸差异、单倍型(基因)多样性、单倍型多样性方差、单倍型多样性标准差分别为Pi0.00045、k1.824、Hd0.809，Vh0.00281、Sh0.053。Tajima’sD检验中，3个区域合并之后的叶绿体DNA片段在P＞0.10水平上，差异不显著，由此可见侧柏的3个叶绿体DNA区域在进化上遵循中性进化。
由此可见，在31份侧柏品种资源中，trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL区域的变异位点数量分别为5、1、8个，单倍型数量分别为4、2、4个，合并之后的叶绿体DNA片段的单倍型有9个。核苷酸多样性和单倍型多样性最高的区域均为RbcL(Hd0.514，Pi0.00058)，最低的为trnS-trnGspacer+intron(Hd0.324，Pi0.00043)。31份侧柏品种资源3个叶绿体DNA区域合并后的遗传多样性较高(Hd＝0.809)，3个叶绿体DNA区域在进化上遵循中性进化模型。
表5侧柏31份种质3个叶绿体DNA区域的单倍型多样性
单倍型多样性(Hd)是指样本中随机抽取到两个不同单倍型的频率，单倍型多样性越高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。
4.3侧柏居群间的遗传关系
预先按照地域将前述31份种质资源分为三个组别(居群)：河南侧柏(包括JX1733、JX1747、JX1763、JX1766和JX1774)、北京侧柏(包括BJ1、BJ2、BJ3、DY、BJ4、BJ5、LY、BJ6、BJ7、BJ8、BJ9、BJ10、BJ11、BJ12、BJ13、BJ14和BJ15)、金叶侧柏(包括JG1、JG2、JG3、JG4、JG5、JG6、JG7、JG8、JG9)，再利用MEG A7.0软件计算3个侧柏群体(类型)间的遗传距离，利用Neighbour-Joining法分析不同居群间的亲缘关系(图3)。根据聚类结果，3个群体(居群)分为2个类群，其中类群1为北京侧柏和河南侧柏群体(北京侧柏和河南侧柏群体这两个居群位于同一进化分支上)，类群2为金叶侧柏类型，与北京侧柏和河南侧柏群体这两个居群均不位于同一进化分支。由此可见，实施例1提供的引物可用于扩增待测种质的叶绿体基因间区，根据各待测种质的叶绿体基因间区序列的同源性分析各待测种质的亲缘关系的远近。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.用于获取侧柏多样性的引物对组合物，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；
引物对甲为特异结合侧柏的叶绿体基因组trnS-trnGspacer+intron的一对引物，所述trnS-trnGspacer+intron是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.1的双链DNA片段；
引物对乙为特异结合侧柏的叶绿体基因组trnT-5′trnL的一对引物，所述trnT-5′trnL是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.2的双链DNA片段；
引物对丙为特异结合侧柏的叶绿体基因组RbcL的一对引物，所述RbcL是一条链的核苷酸序列是SEQ ID NO.3的双链DNA片段。
2.根据权利要求1所述的引物组对合物，其特征在于，所述引物对甲是由SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对乙是由SEQ IDNo.7和SEQ IDNo.8所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对丙是由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的引物对。
3.一种用于鉴别侧柏的产品，其包括权利要求1所述的引物对组合物。
4.权利要求1所述的引物组对合物或权利要求3所述的产品的如下任一种应用：
m1)侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类；
m2)侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
m3)侧柏属植物分子标记辅助育种；
m4)侧柏属植物种质资源保护与利用；
m5)制备侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类的产品；
m6)制备侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；
m7)制备侧柏属植物分子标记辅助育种的产品；
m8)制备侧柏属植物种质资源保护与利用的产品。
5.一种鉴别或辅助鉴别侧柏种质资源的方法，包括如下步骤：以权利要求1中所述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测样品的叶绿体基因间区序列，根据遗传距离对待检测样品的叶绿体基因间区序列进行聚类分析，若任意两个待测样品的叶绿体基因间区序列遗传距离为0，则两个待测样品为同一品种或种质或候选为同一品种或种质，若任意两个待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列遗传距离不为0，该两个待测侧柏样品不为同一品种或种质或候选为非同一品种或种质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述以权利要求1中所述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列具体包括如下步骤：
1)用权利要求1中的SEQ ID No.4和SEQ ID No.5组成的引物对、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8组成的引物对、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10组成的引物对分别对待测样品进行PCR扩增，得到各引物对的PCR扩增产物；
2)测序所述各引物对的PCR扩增产物，将待测侧柏样品的各引物对的PCR扩增产物的测序结果拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列。
7.一种进行侧柏遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
1)采用权利要求1所述的引物对组合物对各待测侧柏的基因组DNA进行PCR扩增并测序，获得trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL序列；
2)将各待测侧柏的trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL序列使用LaunchDnaSPver6软件分析遗传多样性参数，完成侧柏遗传多样性分析。
8.一种侧柏居群间遗传关系分析的方法，包括如下步骤：
1)采用权利要求1所述的引物对组合物对各待测侧柏的基因组DNA进行PCR扩增并测序，获得叶绿体DNA间区的完整序列；
2)将各待测侧柏的上述叶绿体DNA间区的完整序列进行比对，根据各待测侧柏所属居群间的遗传距离分析侧柏居群间遗传关系。
9.DNA条形码，包括权利要求1中所述trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和RbcL。
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