CN108220473B

CN108220473B - 利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料

Info

Publication number: CN108220473B
Application number: CN201810119121.6A
Authority: CN
Inventors: 王凤格; 许理文; 田红丽; 赵久然; 王蕊; 杨扬; 葛建镕; 刘文彬
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108220473A

Abstract

本发明提供利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料。基于叶绿体基因组开发兼容KASP、毛细管、琼脂糖电泳三种平台S型不育材料鉴定的特异InDel位点及其引物，并实现快速、稳定、准确的鉴定。该方法可用于玉米S型不育系、S型不育生产的杂交种，S型不育材料纯度的鉴定等。该方法的应用为S型不育系杂交种三系配套制种提供强有力保障，同时为其它类型雄性不育制种鉴定提供有益借鉴。

Description

利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料。

背景技术

玉米是最早实现杂种优势利用的作物，其杂交种的选育和利用被誉为作物生产上的一次革命。玉米杂交种制种方法有常规和雄性不育两种方法，利用雄性不育配制玉米杂交种，不仅节省大量劳动力，降低成本，而且还可以提高杂交种纯度，提高产量。

玉米雄性不育(male sterile，MS)是指玉米的雄蕊发育异常产生无功能花粉而雌蕊发育正常能够授粉结实的现象。玉米雄性不育大体可分为细胞质雄性不育(cytoplasmicmale sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genetic male sterility,GMS)两类。细胞质雄性不育(CMS)是由细胞核和细胞质基因共同控制的核质互作型雄性不育系，容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种和良种生产上利用的主要雄性不育类型。至今已发现了200多种不同胞质来源的CMS材料，依据雄花育性恢复的专效反应将CMS材料分为S型、C型和T型三种类型。

S型不育系是三种类型种最大的一个组，国内育成的雄性不育系大部分属于S型胞质不育，地方品种资源中S型不育出现的频率也较高。已有研究证明，昌7-2等黄改系材料是S型不育的天然恢复系，国内优良玉米杂交种的多用黄改种质作为父本，充分利用S型胞质不育系是快速实现不育化制种的有效途径。

采用S型胞质不育生产玉米杂交种需要解决三个问题，第一雄性不育胞质类型鉴定，第二雄性不育材料纯度鉴定，第三利用不育系配制杂交种的鉴定，因此建立一种玉米S型不育胞质鉴定的高通量方法具有十分重要的意义。

叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。采用叶绿体基因组上标记位点鉴定不育胞质类型是一种稳定、可靠、创新的方法。基于叶绿体基因标记研发兼容高中低不同通量玉米不育胞质类型的鉴定方法尚未报道。

已报道玉米雄性不育鉴定方法有大田育性观察，细胞学差异比较，育性恢复专效性鉴定，标记位点PCR扩增等方法。前三种方法鉴定周期长，鉴定材料范围受限；基于PCR方法目前没有报道针对叶绿体基因组开发InDel位点的鉴定方法，也没有兼容高中低不同通量鉴定方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料。

本发明的另一目的是提供一种基于叶绿体InDel标记的玉米S型胞质不育材料的高效鉴定方法。

本发明的发明构思如下：(1)玉米代表性试验材料的选取，类型包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、CMS不育三种类型样品等；(2)高浓度、高质量总DNA制备；(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍；(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性；(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组；(6)170份材料叶绿体基因组序列进行比对，筛选出100个叶绿体基因组变异位点；(7)基于170份玉米代表性材料的100个位点的基因型数据，分析不同类群之间的Fst值，即不同类群之间的遗传分化系数，获得S型特异位点20个(17个SNP位点和3个IDNEL位点)；(8)兼容琼脂糖电泳、荧光毛细管电泳和KASP三种分型平台位点，即3个InDel位点；(9)设计引物，利用S型不育系、S型不育系配制杂交种、不同叶绿体胞质类型代表材料进行验证，确定玉米S型不育鉴定的2个特异位点及其引物，具体如下表1和表2。两个位点为CPMIDP01和CPMIDP02，分别属于83个和5个碱基的插入缺失，在玉米B73叶绿体基因组中的物理位置分别为13189bp和52413bp，该物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列(版本号AGPv3)而确定的。表1和表2为CPMIDP01和CPMIDP02位点在琼脂糖、毛细管电泳和KASP平台上的引物信息及对应的基因型信息。

为了实现本发明目的，本发明基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米S型胞质不育材料的InDel标记，所述InDel标记位点为CPMIDP01和/或CPMIDP02，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示，在B73叶绿体基因组中的物理位置分别为13189bp和52413bp；标记CPMIDP01的上、下游侧翼序列分别如SEQ ID NO:14-15所示，标记CPMIDP02的上、下游侧翼序列分别如SEQ ID NO:16-17所示，含有如SEQ ID NO:1所示的83个碱基插入的材料为玉米S型胞质不育材料，含有如SEQ ID NO:2所示的5个碱基缺失的材料为玉米S型胞质不育材料。

本发明还提供用于检测所述InDel标记的PCR引物，用于检测标记CPMIDP01和CPMIDP02的PCR引物序列分别如SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示。

本发明还提供一种基于叶绿体InDel标记的玉米S型胞质不育材料的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-4或SEQ ID NO:5-6所示的引物，进行PCR扩增；

3)分析PCR产物。

优选地，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板2μL，20μmol/L上、下游引物各0.25μL，2.5mmol/L dNTP 1.2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，1单位Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer 2μL，ddH₂O补齐至20μL。

优选地，PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

优选地，步骤3)采用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测PCR产物，对于SEQ ID NO:3-4所示引物，若电泳片段长度为339bp，判定待测玉米为玉米S型胞质不育材料；对于SEQID NO:5-6所示引物，若电泳片段长度为238bp，判定待测玉米为玉米S型胞质不育材料。

本发明还提供基于KASP技术开发的用于检测所述InDel标记的引物，用于检测标记CPMIDP01和CPMIDP02的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:7-10和SEQ ID NO:11-13所示。

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)KASP反应：向步骤1)提取的DNA模板中加入KASP Primer mix和KASP ROXstandard reaction mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物。

其中，所述KASP Primer mix为SEQ ID NO:7和8所示引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与SEQ ID NO:9和10所示引物形成的混合物；或者，

所述KASP Primer mix为SEQ ID NO:11和12所示引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与SEQ ID NO:13所示引物形成的混合物。

优选地，本发明所述荧光标签序列为：5’-FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

5’-HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

优选地，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reactionmix(Kbiosciences,Herts UK)0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL，ddH₂O 0.5μL；所述KASPPrimer mix中各引物的浓度为100μM。

优选地，PCR反应程序为：94℃15min；采用降落PCR的方式，94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，58℃1min，30个循环。

优选地，步骤3)采用荧光检测仪分析PCR产物，对于SEQ ID NO:7-10所示引物，若检测显示为插入，判定待测玉米为玉米S型胞质不育材料；对于SEQ ID NO:11-13所示引物，若检测显示为缺失，判定待测玉米为玉米S型胞质不育材料。

本发明还提供含有所述琼脂糖、毛细管电泳PCR引物或所述KASP荧光原位检测引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述琼脂糖、毛细管电泳PCR引物或所述KASP荧光原位检测引物，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在检测InDel标记CPMIDP01和CPMIDP02中的应用。

本发明还提供所述PCR引物或所述KASP引物，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或选育玉米S型胞质不育材料中的应用。

本发明进一步提供所述InDel标记，所述PCR引物或所述KASP引物，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在玉米品种检测、玉米分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了用于玉米S型不育鉴定的特异位点，并分别基于电泳、KASP平台设计引物。基于琼脂糖、毛细管电泳平台，根据扩增片段的长度判定是否为S雄性不育材料；基于KASP分型平台，根据基因型结果是插入/缺失判定是否为S雄性不材料。

本发明中适于琼脂糖电泳、毛细管电泳以及KASP样本高通量两种分型平台的玉米S型不育胞质类型鉴定引物开发评估的技术路线见图1。

表1基于琼脂糖、毛细管电泳分型平台，CPMIDP01、CPMIDP02位点的引物信息及对应的基因型

*选用荧光毛细管电泳平台进行检测时引物的5'端标记FAM荧光基团。

表2基于KASP分型平台，CPMIDP01、CPMIDP02位点引物信息，及对应的基因型

注：上游引物在5'端分别增加通用接头序列。上游引物1-FAM增加的通用接头序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，上游引物2-HEX增加的通用接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

本发明的发明点在于：(1)叶绿体基因组变异位点挖掘：通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性。在本发明中选取来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料，基于拼接的170个叶绿体基因组序列，利用DnaSp 5.0统计变异位点和序列多态，确定叶绿体多态位点，其中不同遗传背景材料，高质量基因序列均是获得准确可靠叶绿体多态位点的重要因素。(2)玉米S型雄性不育特异位点确定：通过将所有类型玉米自交系(包括T、C、S三类CMS材料)的叶绿体基因组的变异位点的基因型数据进行分析，分析类群之间遗传分化系数，确定S型雄性不育材料的特异位点。(3)兼容两类分型平台玉米S型不育材料鉴定特异引物的获得：从S型不育鉴定特异位点中选取兼容电泳和KASP两种分型平台的InDel位点，并分别设计引物，利用代表性系列材料进行验证，分别在KASP、荧光毛细管、琼脂糖电泳高中低三种通量平台上验证确定特异引物。

本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料，获得叶绿体基因组序列，比较核苷酸多态性，开发玉米雄性不育S型胞质类型的特异位点，基于KASP、荧光毛细管、琼脂糖三种平台建立一种兼容高中低不同通量平台的鉴定方法。

本发明利用重测序数据开发玉米S型不育特异鉴定引物，并在三种分型平台上实现高效鉴定。该方法具有不受环境条件影响，不受生长季节限制，结果准确可靠的优点。

本发明提供的基于叶绿体InDel标记的玉米S型不育制种的高效鉴定方法，该方法可用于玉米S型不育系、S型不育生产的杂交种，S型不育材料纯度的鉴定。该方法的应用为利用S型不育材料进行玉米三系配套制种提供强有力保障，同时为其它类型雄性不育制种鉴定提供有益借鉴。

附图说明

图1为本发明兼容琼脂糖、毛细管电泳、KASP样本高通量不同平台的玉米S型不育胞质类型鉴定特异引物开发评估的技术路线图。

图2为本发明实施例1中基于KASP样本高通量分型平台，京科968在CPMIDP02-KASP引物上的分型结果图。常规制种京科968、京724显示为红色数据点即“TCTTT”片段插入，S型不育制种京科968、S型不育京724显示为蓝色数据点即“TCTTT”片段缺失。

图3为本发明实施例2中基于荧光毛细管电泳平台，常规制种京科968(A)、S型不育制种京科968(B)、京724(C)、S型不育京724(D)在CPMIDP02-CE引物上的电泳结果图。

图4为本发明实施例3中基于琼脂糖电泳平台，不同类型非S型不育自交系、S型不育材料、京科968、京724、京科968(S)、京724(S)724在CPMIDP01-CE引物上的电泳结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1利用CPMIDP01-KASP、CPMIDP02-KASP特异引物，基于KASP样本高通量分型平台，鉴别京科968是否为S型雄性不育制种获得杂交种，鉴别京724是否为S型不育系

待测样本DNA提取：待测京科968、京724，每个样品随机选取50粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，每个样品从50个单株中随机选取了30个单株的绿叶混合，基因组DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。

PCR扩增：PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL(表2中的引物)，ddH₂O 0.5μL。所述KASP Primer mix中各引物的浓度为100μM。

PCR反应程序为：94℃15min；采用降落PCR的方式，94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，58℃1min，30个循环。

指纹数据获得：将扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，Middlesex，UK)进行分析获得每个样品每个数据点的指纹数据。

结果判定：基于表2中所列出的基因型进行判定。引物CPMIDP01-KASP，如果分型结果显示为83个碱基片段插入，检测材料为不育制种京科968和不育京724；如果分型结果显示为83个碱基片段缺失，检测材料为正常京科968和正常京724。引物CPMIDP02-KASP，如果分型结果显示为“TCTTT”片段插入，检测材料为正常京科968和正常京724；如果分型结果显示为“TCTTT”片段缺失，检测材料为不育制种京科968和不育京724(图2)。

实施例2利用CPMIDP01-CE、CPMIDP02-CE特异引物，基于荧光毛细管电泳平台，鉴别京科968是否为S型雄性不育制种获得杂交种，鉴别京724是否为S型不育系

PCR扩增：PCR反应体系为：DNA模板2μL，20μmol/L上、下游引物各0.25μL(表1中引物)，2.5mmol/L dNTP 1.2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，1单位Taq DNA聚合酶(Genacea，美国)，10×PCR Buffer 2μL，ddH₂O补齐至20μL。

PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

荧光毛细管电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在电泳板中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入SSR Analyzer软件分析获得片段长度格式的基因型。

结果判定：基于表1中所列出的基因型进行判定。引物CPMIDP01-CE，如果电泳片段长度为339bp，检测材料为不育制种京科968和不育京724；如果电泳片段长度为256bp，检测材料为正常京科968和正常京724。引物CPMIDP02-CE，如果如果电泳片段长度为243bp，检测材料为正常京科968和正常京724，如果电泳片段长度为238bp，检测材料为不育制种京科968和不育京724(图3)。

实施例3利用CPMIDP01-CE特异引物，基于琼脂糖电泳平台，鉴别京科968是否为S型雄性不育制种获得杂交种，鉴别京724是否为S型不育系

待测样本DNA提取：待测京科968、京724，每个样品随机选取50粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，每个样品从50个单株中随机选取了30个单株的绿叶混合，基因组DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。待扩增的DNA样本，同时加入已知的对照样品。选取B73作为非S型不育材料的阳性对照，京724(S)为S型不育材料的阳性对照。

琼脂糖电泳：制胶，按琼脂糖浓度为2.0％比例配制。电泳，取10μL扩增产物，加入2μL溴酚蓝，混匀，用微量移液器加到样品孔中。接通电极，在最高电压不超过5V/cm(100V-150V恒压电泳)下进行电泳，使扩增产物从负极向正极移动。当溴酚蓝迁移的位置表明，PCR扩增片段已足够分离时，结束电泳。在凝胶成像系统或紫外投射仪上观察鉴定，并照相保存。

结果判定：基于表1中所列出的基因型进行判定。引物CPMIDP01-CE，如果待测样品电泳片段位置与京724(S)样品位置相同，基于Ladder估算片段长度大约在339bp位置，则检测材料为不育制种京科968和不育京724；如果待测样品电泳片段长度位置与B73样品位置相同，基于Ladder估算片段长度大约在256bp位置，则检测材料为正常京科968和正常京724(图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料

<130> KHP171117994.0

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

actgtataca cggatacaga atccgctata tccgtttgtg aaataaaggc taaatcccct 60

cccctcaact ccatatctaa ata 83

<210> 2

<211> 5

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

tcttt 5

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctaactcatc tcagatgcaa gtccact 27

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactgaggaa gtcgcaatta atgca 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaccctgct gcattgtctt g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgcagtact cacactgga 19

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttttattaaa actttttcct taccgctttt a 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctttttatta aaactttttc cttaccgctt ttt 33

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgcaagtcc actttcaata tatctctgta 30

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccctcccctc aactccatat ctaaa 25

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagtttgaa agattgtact gctctttc 28

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaagtttga aagattgtac tgctctttt 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attaggaggg gttcttttgt gcagaaaaa 29

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 14

tatgaaatga tctactaact catctcagat gcaagtccac tttcaatata tctctgtata 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 15

agcggtaagg aaaaagtttt aataaaaaga agaatcaatg gattcatgat taaacccctc 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 16

ctctccccct ttgtataaat atttcacatt tcaaatgcaa gtttgaaaga ttgtactgct 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 17

ttttctttct ttttctgcac aaaagaaccc ctcctaattc actaatttgt aggaagatac 60

Claims

1.叶绿体InDel标记在玉米S型胞质不育材料分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

3)分析PCR产物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板2μL，20μmol/L上、下游引物各0.25μL，2.5mmol/LdNTP 1.2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，1单位Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer 2μL，ddH₂O补齐至20μL；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤3)采用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测PCR产物。

4.叶绿体InDel标记在玉米S型胞质不育材料分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)KASP反应：向步骤1)提取的DNA模板中加入KASP Primer mix和KASP ROX standardreaction mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物；

所述KASP Primer mix为SEQ ID NO:7和8所示引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与SEQ ID NO:9和10所示引物形成的混合物；或者，

所述KASP Primer mix为SEQ ID NO:11和12所示引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与SEQ ID NO:13所示引物形成的混合物；

其中，所述荧光标签序列为：5’-FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

5’-HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reaction mix 0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL，ddH₂O 0.5μL；所述KASP Primer mix中各引物的浓度为100μM；

PCR反应程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃20s，58℃1min，30个循环。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)采用荧光检测仪分析PCR产物。