CN114875157A - 与黄颡鱼个体生长性状相关的snp标记及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记及其应用。该SNP标记位于15号染色体的第19195072个碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr15:19195072C>G，其优选基因型是GG。对该候选SNP标记进行引物设计，并在185个雄性个体中进行验证，证实了该SNP标记也适用于雄性黄颡鱼个体。在另一个黄颡鱼养殖群体中SNPChr15:19195072C>G在生长性状上也存在显著性差异，表明该SNP在黄颡鱼生长性状分子标记辅助育种中具有应用前景。

Description

与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记及应用

技术领域

本申请涉及黄颡鱼生长性状相关分子标记技术领域，尤其涉及与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记及应用。

背景技术

人工选择育种常用于选择具有目标性状的亲本，以产生具有该目标性状的后代，利用标记辅助选择(MAS)可极大地提高目标性状选择的效率和准确性。近年来，随着高通量测序技术的进步，测序成本不断下降，全基因组关联分析(GWAS)得到了快速的发展，成为解析动物复杂性状的重要工具。目前，GWAS已在植物和畜禽分子数量遗传学研究中得到广泛的应用，其中部分研究成果已应用到MAS育种实践中。

性别是生物个体雌雄的差别，是一种特殊的性状。研究表明性别会对生物性状的研究结果产生显著影响，因此在相关研究中需要将动物的性别因素考虑在内，然而大多数研究尤其是鱼类研究并没有考虑其对研究结果的影响。黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)是我国重要的水产养殖鱼类，具有明显的雌雄生长二态性，雄性的生长速度约为雌鱼的2.5～3倍。因此，在解析黄颡鱼重要经济性状特别是生长性状的过程中需考虑性别因素对研究的影响。近年来，黄颡鱼全基因组序列成功破译(Gong et al.，2018)，也为黄颡鱼重要经济性状的遗传解析奠定了坚实基础。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种与两性生长异形鱼类—黄颡鱼生长性状相关的SNP标记，以将其应用于黄颡鱼的人工育种中。

第一方面，本申请实施例公开了与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记，所述生长性状包括体长和体重，其中，所述SNP标记位于15号染色体的第19195072个碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr15:19195072C>G，其优选基因型是GG。

第二方面，本申请实施例公开了用于扩增或检测第一方面所述的SNP标记的引物对，其中所述引物对包括如SEQ ID NO.3～4所示的核苷酸序列。

第三方面，本申请实施例公开了用于扩增或检测黄颡鱼个体生长性状的试剂盒，其中所述试剂盒包括第二方面所述的引物对以及与PCR扩增相关的试剂。

第四方面，本申请实施例公开了一种扩增或检测黄颡鱼SNP Chr15:19195072C>G的方法，其中包括：

提取黄颡鱼个体的基因组DNA；

以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增体系为：2×Es Taq MasterMix 5μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、模板1μL、补充双蒸水10μL；

对所述PCR扩增产物进行Sanger测序，以判断所述黄颡鱼个体Chr15:19195072C>G的基因型。

第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的SNP标记的筛选方法，包括以下步骤：

构建黄颡鱼混合家系，采集所述黄颡鱼混合家系的生长性状数据，所述生长性状数据包括体长数据和体重数据；

采用黄颡鱼性别特异性标记对所述黄颡鱼混合家系进行性别鉴定，以获得黄颡鱼雌鱼样本；

提取黄颡鱼雌鱼样本的基因组DNA，构建基因组重测序文库，对所述基因组重测序文库进行PE150双末端测序；

对测序数据集采用FastQC和trim_galore进行质控和过滤后，采用Bowtie2将过滤后的reads比对到黄颡鱼参考基因组上，使用GATK4软件检测SNPs并进行过滤；

使用TASSEL软件的混合线性模型对生长性状数据与所述过滤后的SNPs进行关联分析，以获得与黄颡鱼生长性状相关的SNP标记。

在本申请实施例中，所述黄颡鱼性别特异性标记为XY1。

在本申请实施例中，用于扩增所述黄颡鱼性别特异性标记的引物序列如SEQ IDNO.1～2所示。

在本申请实施例中，所述SNP标记的筛选方法还包括：

从所述黄颡鱼混合家系随机挑取黄颡鱼雄性样本，并提取其基因组DNA；

使用如SEQ ID NO.3～4所示的引物进行PCR扩增；

对扩增产物进行测序，以鉴定Chr15:19195072C>G的基因型。

第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的SNP标记在预测黄颡鱼生长性状或黄颡鱼育种中应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本申请在解析黄颡鱼生长性状的过程中，考虑到性别因素对研究结果的影响。先从黄颡鱼混合家系的125条雌性个体的基因组中筛选到1与黄颡鱼雌性个体体长和体重相关的候选SNP；然后对该候选SNP标记进行引物设计，并在185个雄性个体中进行验证，证实了该SNP标记也适用于雄性黄颡鱼个体。同时，在另一个黄颡鱼养殖群体中也验证出SNPChr15:19195072C>G与生长性状相关联，表明该SNP在黄颡鱼生长性状分子标记辅助育种中具有应用前景。

附图说明

图1为本申请实施例提供的黄颡鱼雌、雄个体鉴定结果图。

图2为本申请实施例提供的雌性黄颡鱼体长性状GWAS分析中的曼哈顿图和QQ-plot图。

图3为本申请实施例提供的Chr15:19195072C>G不同基因型雌性黄颡鱼体长统计结果图。

图4为本申请实施例提供的雌性黄颡鱼体重性状GWAS分析中的曼哈顿图和QQ-plot图。

图5为本申请实施例提供的3号染色体上与雌性黄颡鱼体重在染色体水平上相关的SNP(Chr3:32884295)的位置及其上下游0.5Mb内包含的基因结果图。

图6为本申请实施例提供的15号染色体上与雌性黄颡鱼体重在染色体水平上相关的SNP(Chr15:16019035)的位置及其上下游0.5Mb内包含的基因结果图。

图7为本申请实施例提供的Chr15:19195072C>G不同基因型雌性黄颡鱼体重统计结果图。

图8为本申请实施例提供的Chr15:19195072C>G标记分型图。

图9为本申请实施例提供的Chr15:19195072C>G不同基因型雄性黄颡鱼体长和体重统计结果图。

图10为本申请实施例提供的Chr15:19195072C>G不同基因型在验证黄颡鱼群体中的体长和体重统计结果图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

实施例1与黄颡鱼个体生长性状相关SNP标记的筛选

1、养殖与样品采集

采用人工繁殖，构建黄颡鱼混合家系，并进行同塘养殖，养殖过程中严格执行“定时、定点、定量”的投喂原则。养殖6个月后，随机捕获1000尾试验鱼，测量并记录每尾鱼体长和体重数据，同时采集试验鱼尾鳍组织用于基因组DNA的提取。

2、基因组DNA提取与雌、雄个体检测

采用酚-氯仿法提取基因组DNA。提取的基因组DNA使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，经紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解及是否有蛋白质残留，并用Nanodrop2000分光光度计测定其浓度。以测得DNA浓度为参考，将DNA工作液统一稀释为50ng/uL。

为了避免黄颡鱼性别对生长性状GWAS分析的影响，使用黄颡鱼性别特异性标记引物(引物序列详细信息见表1)对试验鱼进行性别鉴定。PCR扩增反应体系如表2所示，扩增反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸40s(34个循环)；72℃终延伸5min。

表1黄颡鱼性别特异性标记引物相关信息

引物名称	引物序列(5’-3’)	产物大小(bp)
			XY1-F	gattgtagaagccatctccttagcgta，如SEQ ID NO.1所示	X:955
XY1-R	catgtagatcactgtacaatccctg，如SEQ ID NO.2所示	Y:826

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后，将凝胶置于紫外凝胶检测仪上检测电泳结果，根据电泳条带确定试验鱼性别，雌鱼扩增出一条955bp的片段，雄鱼扩增出两条带，片段大小分别为826bp和955bp(图1)。

3、重测序与SNP变异检测

随机挑选经上述步骤筛选得到的125个黄颡鱼雌性个体的基因组DNA送北京诺禾致源科技股份有限公司进行建库，质检合格的文库在Illumina NovaSeq 6000测序平台上进行PE150双末端测序。测序原始数据经FastQC和trim_galore质控和过滤后，采用Bowtie2将过滤后的reads比对到黄颡鱼参考基因组上，使用GATK4软件检测SNPs并进行过滤。

4、生长性状全基因组关联分析

使用TASSEL软件的混合线性模型(MLM)进行黄颡鱼雌性个体体长、体重全基因组关联分析。

5、结果分析

基于Illumina NovaSeq 6000测序平台，125尾雌鱼重测序共产生18.9Tb rawreads。在去除测序数据中的接头和低质量的reads后，共获得554.03Gb的clean data，包含18.5Tb的clean reads。将每个样品的clean data与黄颡鱼参考基因组(http://dx.doi.org/10.5524/100506)进行比对，共获得6845347个SNPs，经过MAF>0.05和缺失数据<30％过滤后，得到了3235493个SNPs；继续经LD修剪后，得到了1259870个SNPs，以用于进一步的GWAS分析。

对雌性黄颡鱼体长性状的GWAS结果如图2、3所示。图2示出了在Chr15染色体上检测到1个在基因组水平上与体长相关的SNP，命名为Chr15:19195072C>G。如图3所示，在雌鱼Chr15:19195072C>G位点，GG基因型平均体长显著高于GC基因型和CC基因型，GC基因型和CC基因型在平均体长上也有显著性差异。

对雌性黄颡鱼体重性状的GWAS结果如图4～7所示。如图4所示，在3号染色体和15号染色体共检测到3个与体重相关的SNPs，其中1个SNP在基因组水平上与体重相关，且与上述体长相关SNP位点(Chr15:19195072C>G)相同。图5、6分别示出了在染色体水平上与体重相关的2个SNPs位点(Chr3:32884295和Chr15:16019035)，根据雌性黄颡鱼基因组信息，发现这2个SNPs均位于基因间区域，此外，为了寻找与雌性黄颡鱼体长性状相关的候选基因，还标示出SNPs上下游0.5Mb内的基因。如图7所示，雌鱼Chr15:19195072位点3种基因型之间在平均体重上均存在显著差异。

综合上述结果，本实施例筛选出1个同时与雌性黄颡鱼体长和体重相关的SNP标记，位于15号染色体第19195072个碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr15:19195072C>G，GG基因型为优选基因型，其生长性能更佳。

实施例2 Chr15:19195072C>G与黄颡鱼雄性个体生长性状的关联分析1、Chr15:19195072C>G在黄颡鱼雄性个体中基因分型

为了验证Chr15:19195072C>G是否与黄颡鱼雄性个体生长性状相关，本申请利用Priemer 5.0软件设计了一对用于扩增该SNP的引物(如表3)，使用该引物对上述混合群体中随机挑选的185个雄性黄颡鱼个体进行PCR扩增，PCR反应体系如表4所示，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸30s(35个循环)；72℃终延伸5min。

表3引物信息Chr15:19195072C>G的特异性扩增和基因分型的引物信息

表4 PCR扩增反应体系

2×Es Taq Master Mix	5μL
		XY-F(10μM)	0.5μL
XY-R(10μM)	0.5μL
		DNA template	1μL
ddH<sub>2</sub>O	up to 10μL

PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后，将凝胶置于紫外凝胶检测仪上检测电泳结果，确定每个样品扩增片段大小。使用反向引物对合格的PCR扩增产物进行Sanger测序，测序所用引物与PCR扩增引物相同。使用Chromas软件读取Sanger测序峰图，判断每个样本SNP Chr15:19195072C>G的基因型(图8)。

2、雄性Chr15:19195072C>G不同基因型个体体长和体重的关联分析

每个样本在SNP Chr15:19195072C>G成功分型后，将各基因型样本的平均体长和体重差异进行比较分析。结果如图9所示，表明GG基因型的平均体长与体重极显著高于CC基因型(p<0.01)。

实施例3与黄颡鱼个体生长性状相关SNP的验证

1、养殖与样品采集

采用人工繁殖，构建另外一个黄颡鱼混合家系，养殖方式同实施例1。养殖6个月后，随机捕获201尾试验鱼，测量并记录每尾鱼体长和体重数据，同时采集试验鱼尾鳍组织用于基因组DNA的提取。

2、基因组DNA提取与雌、雄个体检测

基因组DNA提取与雌、雄个体检测同实施例1。

3、Chr15:19195072C>G与黄颡鱼生长性状的关联分析

Chr15:19195072C>G基因分型与分析同实施例2。

4、结果分析

在201尾试验鱼中，分别鉴定到96尾雌鱼和105尾雄鱼。Chr15:19195072C>G不同基因型体长和体重比较分析结果如图10所示，表明在黄颡鱼雌性与雄性群体中，GG基因型的平均体长与体重极显著高于GC基因型和CC基因型(p<0.01)。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gattgtagaa gccatctcct tagcgta 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

catgtagatc actgtacaat ccctg 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

actcctcatt ctcatctttc g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctcactcatt atggtgttgt atg 23

Claims (9)

1.与黄颡鱼个体生长性状相关的SNP标记，所述生长性状包括体长和体重，其中，所述SNP标记位于15号染色体的第19195072个碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr15:19195072C>G，其优选基因型是GG。

2.用于扩增或检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其中所述引物对包括如SEQ IDNO.3～4所示的核苷酸序列。

3.用于扩增或检测黄颡鱼个体生长性状的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求2所述的引物对以及与PCR扩增相关的试剂。

4.一种扩增或检测黄颡鱼SNP Chr15:19195072C>G的方法，其中包括：

提取黄颡鱼个体的基因组DNA；

以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增体系为：2×Es Taq Master Mix 5μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、模板1μL、补充双蒸水10μL；

对所述PCR扩增产物进行Sanger测序，以判断所述黄颡鱼个体Chr15:19195072C>G的基因型。

5.权利要求1或2所述的SNP标记的筛选方法，其中包括以下步骤：

构建黄颡鱼混合家系，采集所述黄颡鱼混合家系的生长性状数据，所述生长性状数据包括体长数据和体重数据；

采用黄颡鱼性别特异性标记对所述黄颡鱼混合家系进行性别鉴定，以获得黄颡鱼雌鱼样本；

提取黄颡鱼雌鱼样本基因组DNA，构建基因组重测序文库，对所述基因组重测序文库进行PE150双末端测序；

对测序数据集采用FastQC和trim_galore进行质控和过滤后，采用Bowtie2将过滤后的reads比对到黄颡鱼参考基因组上，使用GATK4软件检测SNPs并进行过滤；

使用TASSEL软件的混合线性模型对生长性状数据与所述过滤后的SNPs进行关联分析，以获得与黄颡鱼生长性状相关的SNP标记。

6.根据权利要求5所述的SNP标记的筛选方法，其中所述黄颡鱼性别特异性标记为XY1。

7.根据权利要求5所述的SNP标记的筛选方法，其中用于扩增所述黄颡鱼性别特异性标记的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

8.根据权利要求5所述的SNP标记的筛选方法，其中还包括：

从所述黄颡鱼混合家系随机挑取黄颡鱼雄性样本，并提取其基因组DNA；

使用如SEQ ID NO.3～4所示的引物进行PCR扩增；

对扩增产物进行测序，以鉴定其中的Chr15:19195072C>G的基因型。

9.权利要求1所述的SNP标记在预测黄颡鱼生长性状或黄颡鱼育种中应用。

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