CN108676899A - 一种与二花脸母猪产仔性状相关的snp标记及其检测方法 - Google Patents

一种与二花脸母猪产仔性状相关的snp标记及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其检测方法。所述SNP标记位于猪13号染色体上的钙同线蛋白基因CLSTN2的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体上g.80866929核苷酸位点，且存在A/G多态性，所述SNP标记与二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与二花脸母猪的产仔性能相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高产的二花脸母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。

Description

一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其检测方法。
背景技术
产仔数是反映母猪繁殖力、猪场生产水平和经济效应的重要指标，产仔数的高低直接关系到每头母猪提供育肥猪的数量和猪肉供给量。尽管我国能繁母猪数量有所调整，但2017年12月底仍达3500万头左右，如果每头母猪平均每胎多产仔1头，按每年每头母猪产2胎计算，则每年可为整个行业多提供约7000万头猪；换言之，全国可以少养300多万头母猪，保障生猪出栏水平不变。这对当今环保压力巨大的我国养猪业可起到很大的保障作用。随着我国经济持续快速的发展，人们生活水平逐渐提高，对猪肉的需求量也越来越大，因此，人们也越来越关注如何提高猪的产仔数性能。然而，由于传统的选育方法对产仔数提高收效甚微，因此解析产仔数变异的遗传机理，开发和利用新的基因或分子选育标记来提高猪的产仔性能具有重要意义。
二花脸是我国太湖流域产仔性能非常优秀的国家级畜禽遗传资源保护品种，有着“世界猪种产仔之王”的美誉，也是我国养猪业可持续发展的重要资源。多年以来虽然国内已有大量的研究机构利用二花脸来鉴别二花脸猪种高繁殖力的遗传机理，但限于研究方法、手段、材料及繁殖性状本身复杂性等众多因素的制约，二花脸猪种高繁殖力遗传机制并没有得到充分的揭示和有效的利用。
随着梅山猪出口到国外，其高繁殖力优势基因被国外许多机构进行了系统科学的研究和有效利用，提高了其瘦肉型猪种的繁殖力，近年来从法国和丹麦引进的猪种普遍繁殖力很高，我们地方猪高产优势逐渐被削弱，这是一个严重威胁，是国人不得不面对并亟需寻求对策的现实。鉴别和分离尚未被出口的二花脸猪种的高产优势基因，培育性能相对稳定的高产群体、巩固太湖流域这些地方猪种的高产优势已刻不容缓。
从国际猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)可知，目前在猪除10、11号染色体及性染色体上没有定位到影响总产仔数的QTL，其它常染色体上都已定位到影响总产仔数的QTL，但大部分是利用微卫星标记定位的QTL，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，产仔数的低遗传力，提供与母猪窝经产产活仔数和窝经产总产仔数相关的SNP标记。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。
一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于猪13号染色体上的钙同线蛋白基因CLSTN2的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体上g.80866929核苷酸位点，且存在A/G多态性，所述SNP标记与二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。g.80866929位点具有AA基因型的二花脸个体母猪窝经产产活仔数和窝经产总产仔数均显著高于具有GG基因型的二花脸个体母猪窝经产产活仔数和窝经产总产仔数。
一种基于本发明所述的SNP开发分子标记的方法，以含有所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对序列优选为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列进一步优选如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第257位，存在A/G多态性。
按照上述方法得到的分子标记。
所述的分子标记优选如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第257位，存在A/G多态性。
一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
一种检测所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增二花脸母猪基因组中含有所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的A/G多态性。
本发明所述的检测所述SNP标记的方法，优选包括以下步骤：
(1)取一头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA；
(2)用已提取的二花脸母猪基因组DNA为模板，使用权利要求5所述的引物进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第257位的G/T多态性。
步骤(2)所述的PCR扩增进一步优选反应体系为：DNA模板2.5μL、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各1.25μL、PCR Mix试剂25μL、双蒸水20μL；其中所述DNA模板浓度为30ng/μL，所述引物的浓度为10mol/L，所述PCR Mix试剂为南京欧科生物技术有限公司的P394961L型号试剂；PCR扩增的反应程序为：预变性96℃2min；变性96℃20s；退火60℃30s，延伸72℃45s，35个循环；延伸72℃10min。
本发明所述的SNP标记、所述的分子标记、引物对在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。
一种筛选高产二花脸母猪品系的方法，包括检测二花脸母猪g.80866929核苷酸位点的基因型，选育g.80866929核苷酸位点的AA型个体作为种猪。
有益效果：
本发明提供的SNP标记与二花脸母猪的产仔性能相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高产的二花脸母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为染色体上影响猪窝经产产活仔数的GWAS定位结果示意图。即为207头纯种二花脸母猪群体的GWAS定位结果。其中，猪的18条常染色体及X染色体信息标识于X轴，SNP与窝经产产活仔数相关性的-log10(P)值按SNP在基因组中的位置显示Y轴。蓝线表示的是染色体显著水平阈值，红线表示的是基因组显著水平的阈值。
图2为使用本发明的引物扩增CLSTN2基因的电泳图。
图3为CLSTN2基因的突变位点不同基因型的DNA测序结果峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、实验动物来源
江苏常州焦溪二花脸猪专业合作社。
计算207头二花脸母猪的育种值，计算模型为
Y(窝产总仔数)＝parity(胎次)+farm(场)+year(年度)+season(季节)+age(母猪分娩年龄)+sire(与配公猪)+permanent effect(母猪的永久效应)+additive effect(个体的加性效应)+e(残差)，
其中包括固定效应-胎次、母猪分娩的场/年/季，协变量-母猪分娩的年龄，随机效应-与配公猪，永久效应-母猪，个体加性遗传值。选择育种值较高的23个个体与育种值较低的25个个体。
2、提取基因组DNA
采集48头母猪的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。
使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组DNA，所需试剂包括：
裂解液实验室配备
蛋白酶K(德国MERCK生物科技有限公司)
Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)
Tris饱和酚:氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)
氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)
无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)
3M乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)
具体步骤如下所述：
(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2mL离心管中；
(2)加入裂解液(自己配备)800μL，及蛋白酶K30μL(20mg/ml)；
(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；
(4)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；
(5)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
(6)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；以下步骤换1.5ml的离心管
(7)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；
(8)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；
(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
(10)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
3、猪全基因组6万个(60K)SNP基因型检测
上述个体的DNA在Illumina Beadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60K SNP(Illumina，美国)基因型判定。利用PLINK对所有样本60K芯片数据进行质量控制，剔除检出率低于0.95、家系孟德尔错误率高于0.05的个体；最小等位基因频率小于0.05的SNP标记。
4、全基因组关联(GWAS)分析
使用GEMMA软件对分型个体的60K SNP标记型数据和窝经产产活仔数表型数据进行GWAS分析，采用Bonferroni校正法控制多重检验，将基因组显著性阈值确定为0.05/标记数。GWAS的结果显示，猪13号染色体上存在1个与窝产总仔数显著相关的SNP位点(图1)。
实施例2
本实施例为实施例1中得到的SNP位点g.80866929A/G在二花脸母猪群体内的验证。
1、提取二花脸母猪基因组DNA
采集具有准确窝经产产活仔数和窝经产总产仔数记录的313头纯种二花脸母猪的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。利用上述方法提取耳组织基因组DNA，经过质量、浓度检测后将浓度稀释到30ng/μL于-20℃下保存备用。
2、目的片段PCR扩增与测序
用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板2.5μL、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各1.25μL、PCR Mix试剂25μL、双蒸水20μL；设置PCR扩增体系：预变性96℃2min；变性96℃20s；退火60℃30s；延伸72℃45s；35个循环；然后延伸10min。
PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为427bp，电泳图见图2，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读g.80866929A/G的基因型，然后利用SAS软件进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为Yijklmn＝u+HFSi+AGEj+PAk+Pl+Gm+Bn+Pl+eijklmn
其中：Yijklmn为猪的产仔数；HFSi为第i个厂年季固定效应；AGEj是母猪分娩年龄作为协变量；PAk为胎次k的固定效应；Pl代表母猪的永久环境效应；Gm代表第m个SNP的基因型固定效应；Bk是与配公猪的随机效应；不同胎次的产仔数记录作为重复数据处理；eijklmn为残差。
显著性的P值经过10000次的随机抽样校正。
表1给出了g.80866929 A/G突变位点在纯种二花脸群体中对窝经产产活仔数和窝经产总产仔数的影响效应。由表1可知，纯种二花脸猪中，g.80866929 A/G位点的AA基因型个体与GG型个体相比较：窝经产产活仔数和窝经产总产仔数平均分别增加1.03头和0.85头。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育g.80866929 A/G位点的AA型均可逐步提高二花脸母猪的窝经产产活仔数和窝经产总产仔数，达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。
表1 g.80866929 A/G SNP位点与二花脸母猪窝经产产活仔数和窝经产总产仔数的关联分析
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 427
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
ctcttggtca aatgcggtgc cagcctcaag gaggccaagc ctagtagaat acgatcttac 60
ctttgggagc ttgtgttcca gtggagaatg actacatgta aatagctgat gttcagcaca 120
gggcacataa tgttgggggc atgattctgt ggggtgatgg tctttcttct ttcccaagtc 180
cttgagtttg ctccatgagt gtcccatgct tctttagggg agaagctagg agctgtccag 240
ctgtcccagg agctacgacc taggtctttg cagtggtcgg tgtactgtgg cctcacttcc 300
tgctcctgca gtctgcctct cctgaccttc tgtctcctgt gacctccttc aggctgtacc 360
aagtgaggag gtgtggcctg gtgggtgagg catccccaaa aggttggggg gcctgggaga 420
ccttata 427
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcttggtca aatgcggtgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tataaggtct cccaggcccc 20

Claims (10)

1.一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上g.80866929核苷酸位点，且存在A/G多态性，所述SNP标记与二花脸母猪窝经产产活仔数和窝经产总产仔数极显著相关。
2.一种基于权利要求1所述的SNP开发分子标记的方法，其特征在于以含有权利要求1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。
3.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：SEQ IDNO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第257位，存在A/G多态性。
4.按照权利要求2或3的方法得到的分子标记。
5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第257位，存在A/G多态性。
6.一种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ IDNO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
7.一种检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于包含PCR扩增二花脸母猪基因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的A/G多态。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取一头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA；
(2)用已提取的二花脸母猪基因组DNA为模板，使用权利要求5所述的引物进行PCR扩增；
(3)扩增产物测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第257位的A/G多态性。
9.权利要求1所述的SNP标记、权利要求4或5所述的分子标记、权利要求6所述的引物在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。
10.一种筛选高产二花脸母猪品系的方法，其特征在于包括检测二花脸母猪国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上g.80866929核苷酸位点的基因型，选育g.80866929核苷酸位点基因型为AA型的个体作为种猪。
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