CN114196761A - 一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法 - Google Patents

一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，包括以下步骤：步骤一、收集至少1000头纯种杜洛克猪的饲料报酬和剩余采食量性状表型数据，并建立回归模型对表型数据进行矫正，分别提取纯种猪肌肉组织DNA储存备用；步骤二、进行深度全基因组重测序，全基因组水平挖掘SNP位点，建立优质SNP位点集合；步骤三、基于全基因组关联分析，检测与饲料报酬和剩余采食量相关的SNP位点，然后通过生物信息学分析筛选出显著且连锁不平衡程度低的SNP位点，形成候选SNP位点集合；步骤四、SNP芯片建库，液相捕获技术进行富集捕获，然后进行高通量测序，本发明所制备液相SNP芯片具备成本低，同时在猪饲料效率的应用上大大提高了准确性，降低了错误率。

Description

一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法
技术领域
本发明涉及动物遗传育种和分子生物学技术领域，尤其涉及一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法。
背景技术
猪是我国重要的肉产品来源，养猪业的目的是满足人们不断增长的对猪肉及其制品的消费需求。饲料成本在猪的生产消耗中占显著的比例，因此饲料效率在生猪产业具有重要的经济意义。然而随着我国规模化养殖的发展，猪的饲料效率对养猪业的经济效益产生越来越大的影响。
随着基因组学及分子标记技术的快速发展，家畜基因型分析进入新的时代。SNP作为遗传标记在基因组上分布最为丰富，单个位点的突变率很低，很容易通过芯片技术实现自动化和规模化。因此基于饲料报酬和剩余采食量关联的SNP(Single NucleotidePolymorphism)位点开发基因组范围的分子标记进行基因组选择是提高猪饲料效率的有效方法。近年来，猪的高密度芯片广泛应用于科研和生产上，Illumina、Affymetrix等公司相继推出不同的SNP的基因分型高通量检测平台并且发布了多款商业芯片，然而这些芯片通常包含多个品种、各种性状的SNP位点，很难挖掘与饲料报酬和剩余采食量相关的位点，因此利用当前芯片的研究基础，亟需开发一款覆盖全基因组并且针对饲料报酬和剩余采食量性状的猪全基因组SNP芯片。
当前猪的商业SNP芯片主要针对固定的SNP位点，在针对特定性状时，往往检测力不够，特异性不高，不够灵活，而且成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，解决了背景技术中所提商业SNP芯片检测不够灵活、检测力不高和成本较高的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，包括以下步骤：
步骤一、收集至少1000头纯种杜洛克猪的饲料报酬和剩余采食量性状表型数据并建立回归模型对对表型数据进行矫正，分别提取纯种猪肌肉组织DNA并储存备用；
步骤二、对提取的纯种猪肌肉组织DNA进行深度全基因组重测序，在全基因组水平挖掘SNP位点，建立优质SNP位点集合；
步骤三、基于全基因组关联分析，检测与饲料报酬和剩余采食量相关的SNP位点，然后通过生物信息学分析筛选出显著且连锁不平衡程度低的SNP位点，形成候选SNP位点集合；
步骤四、SNP芯片建库，根据这些SNP位点用液相捕获技术进行富集捕获，然后进行高通量测序；
进一步的，步骤一中，通过所收集纯种猪的性别、出生年月以及体重所述回归模型，回归模型为：
Y(饲料报酬)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)；
Y(剩余采食量)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)；
纯种猪肌肉组织DNA提取步骤：1)取黄豆大小的肌肉组织样品，将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml离心管中；2)加入裂解液800μl和蛋白酶K30μl，置于55℃恒温水浴箱孵育过夜，至管中无组织块为止；；3)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；4)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃，12000r/min离心12min；5)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；6)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；7)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清；8)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；9)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL，于-20℃下保存备用；10)对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测，合格样品置于-80℃冰箱保存待用。
更进一步的，在所述纯种猪肌肉组织DNA提取步骤中，对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测：对目标区域捕获(液相)前对DNA样本进行检测，检测方法包括以下2种：使用检测器对DNA浓度进行精准定量，总量在250ng以上的DNA样本可以用来建库；琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白质污染，
进一步的，在步骤二中，对合格样本进行基因重组测序并构建样本库，对重测序原始下机数据使用软件进行数据处理，得到高质量数据，数据质量控制过程具体步骤如下：1)测序read匹配上adapter序列的25％或者以上则删除整条read；2)如果测序read中质量值低于20的碱基占整条read的30％或者以上则删除整条read；3)如果测序read中N含量占整条read的1％或者以上，则删除整条read；4)获得高质量的Clean reads。
更进一步的，对Clean reads进行生物信息学分析，得到高质量SNP数据，具体步骤如下：1)使用软件将通过质量控制的数据比对到猪参考基因组11.1版本参考序列上，得到序列比对信息，生成序列比对结果；2)使用不同软件，将比对结果文件排序并去除PCR扩增等原因产生的重复序列；3)使用软件进行变异检测，最终获得高质量SNP位点数据。
进一步的，在步骤三中，全基因组关联分析筛选SNP候选位点集合步骤如下：使用软件对上述个体的表型性状(矫正后)和全基因组SNP位点进行关联分析，构建混合线性模型，模型为：y＝Xm+Wa+e
y表示矫正后的表型性状向量；
m表示SNP效应；
a表示残余多基因效应；
e表示残差；
X和W分别表示m和a关联矩阵；
根据关联分析的P值对结果进行过滤，保留P＜1e-3的SNP位点，然后根据连锁不平衡r2值过滤剩余位点，去除连锁不平衡r2＞0.8的SNP位点。最终获得候选SNP位点集合。
进一步的，在步骤四中，选取部分种猪个体提取DNA，然后对提取的合格DNA样本进行建库以及对候选SNP位点集合所在区域进行捕获，建库和捕获流程如下：
1)基因组DNA片段化：选取200ng DNA，采用酶切打断的方式将基因组DNA随机打断(150-200bp)；
2)DNA片段末端修复加A，接头连接，纯化，通过Pre-PCR进行文库富集。文库总量在750ng以上，浓度在25ng/ul，文库长度约在270bp-320bp间，判定为合格文库；
3)探针与文库杂交形成RNA-DNA杂合体；
4)带链霉亲和素标记的的磁珠捕获RNA-DNA杂合体；
5)洗脱非特异性结合文库，纯化，得到特异性文库，文库富集；富集后的浓度一般在1-10ng/ul，浓度在1ng/ul为合格文库，可安排上机测序；
6)对合格文库进行高通量测序。
本发明的有益效果是：
(1)该方法开发了一款针对饲料效率相关性状的液相SNP芯片，与当前的SNP芯片相比，极大降低成本；此外，由于该芯片是针对饲料报酬和剩余采食量的专门化芯片，因此在有关猪饲料效率的应用上大大提高了准确性，降低了错误率。
附图说明
图1为本发明所提供的全基因组重测序建库实验流程；
图2为本发明所提供的SNP位点所在区域进行捕获的液相杂交捕获实验流程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
根据本发明的实施例，提供了一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法。
实施例一
一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，包含以下步骤：
步骤一、实验动物来源于新希望猪场，收集1000头纯种杜洛克猪的饲料报酬和剩余采食量性状表型数据，并通过性别、出生年月以及体重等建立回归模型对表型数据进行矫正，模型为：
Y(饲料报酬)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)
Y(剩余采食量)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)；
采集这1000头猪的肌肉组织，于-20℃冰箱保存备用。
使用试剂盒提取肌肉组织DNA，所需试剂包括：
裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0；100mM EDTA,pH8.0)(实验室配制)、DNA提取试剂盒(Qiagen公司)、蛋白酶K(德国MERCK生物科技公司)、Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)、Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)、氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)、无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)
具体步骤如下所述：
1)取黄豆大小的肌肉组织样品，将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml离心管中；
2)加入裂解液800μl和蛋白酶K30μl，置于55℃恒温水浴箱孵育过夜，至管中无组织块为止；
3)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；
4)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃，12000r/min离心12min；
5)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
6)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；
7)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；
8)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
9)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用；
10)对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测：对目标区域捕获(液相)前对DNA样本进行检测，检测方法包括以下2种：Qubit对DNA浓度进行精准定量，总量在250ng以上的DNA样本可以用来建库；琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白质污染。所有合格样品置于-80℃冰箱保存待用。
步骤二、将步骤一中检测合格的DNA样本在深圳华大公司进行测序并且对合格样本构建文库，然后根据公司标准流程进行全基因组重测序(图1)。对重测序原始下机数据使用SOAPnuke软件进行数据处理，得到高质量数据，数据质量控制过程具体步骤如下：
1)测序read匹配上adapter序列的25％或者以上则删除整条read；
2)如果测序read中质量值低于20的碱基占整条read的30％或者以上则删除整条read；
3)如果测序read中N含量占整条read的1％或者以上，则删除整条read；
4)获得高质量的Clean reads。
对Clean reads进行生物信息学分析，得到高质量SNP数据，具体步骤如下：
1)使用BWA软件将通过质量控制的数据比对到猪参考基因组11.1版本参考序列上，得到序列比对信息，生成序列比对结果；
2)使用SAMTools和Picard软件，将比对结果文件排序并去除PCR扩增等原因产生的重复序列；
3)使用GATK软件进行变异检测，最终获得高质量31205109个SNP位点。
步骤三、使用GEMMA软件对上述个体的表型性状(矫正后)和全基因组SNP位点进行关联分析，构建混合线性模型，模型为：
y＝Xm+Wa+e
y表示矫正后的表型性状向量；
m表示SNP效应；
a表示残余多基因效应；
e表示残差；
X和W分别表示m和a关联矩阵；
根据关联分析的P值对结果进行过滤，保留P＜1e-3的SNP位点，然后根据连锁不平衡r2值过滤剩余位点，去除连锁不平衡r2＞0.8的SNP位点。最终获得候选SNP位点集合。最终获得候选27312个SNP位点数据。
步骤四、选取322个纯种猪个体提取DNA，然后对提取的合格DNA样本进行建库以及对候选27312个SNP位点所在区域进行捕获(图2)；
SNP芯片建库和捕获方法为使用试剂盒进行建库和捕获；
所需试剂包括以下2种：
建库试剂盒为Enzyme Plus Library Prep Kit(艾吉泰康公司)、捕获试剂盒为艾吉泰康TargetSeq
Figure BDA0003367381910000081
Kit(Ada-block，for BGI)(艾吉泰康公司)
具体建库和捕获操作流程如下：
1)基因组DNA片段化：选取200ng DNA，采用酶切打断的方式将基因组DNA随机打断(150-200bp)；
2)DNA片段末端修复加A，接头连接，纯化，通过Pre-PCR进行文库富集。文库总量在750ng以上，浓度在25ng/ul,文库长度约在270bp-320bp间,判定为合格文库。
3)探针与文库杂交形成RNA-DNA杂合体；
4)带链霉亲和素标记的的磁珠捕获RNA-DNA杂合体；
5)洗脱非特异性结合文库，纯化，得到特异性文库，文库富集；富集后的浓度一般在1-10ng/ul，浓度在1ng/ul为合格文库，可安排上机测序。
6)对合格文库进行高通量测序。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、收集至少1000头纯种杜洛克猪的饲料报酬和剩余采食量性状表型数据并建立回归模型，对表型数据进行矫正，分别提取纯种猪肌肉组织DNA并储存备用；
步骤二、对提取的纯种猪肌肉组织DNA进行深度全基因组重测序，在全基因组水平挖掘SNP位点，建立优质SNP位点集合；
步骤三、基于全基因组关联分析，检测与饲料报酬和剩余采食量相关的SNP位点，然后通过生物信息学分析筛选出显著且连锁不平衡程度低的SNP位点，形成候选SNP位点集合；
步骤四、SNP芯片建库，根据这些SNP位点用液相捕获技术进行富集捕获，然后进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，步骤一中，通过所收集纯种猪的性别、出生年月以及体重所述回归模型，回归模型为：
Y(饲料报酬)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)；
Y(剩余采食量)＝year(年度)+month(月度)+gender(性别)+weight(体重)+Farm(场次)+e(残差)；
纯种猪肌肉组织DNA提取步骤：1)取黄豆大小的肌肉组织样品，将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml离心管中；2)加入裂解液800μl和蛋白酶K30μl，置于55℃恒温水浴箱孵育过夜，至管中无组织块为止；；3)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；4)取650μL上清加Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃，12000r/min离心12min；5)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；6)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；7)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清；8)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；9)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL，于-20℃下保存备用；10)对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测，合格样品置于-80℃冰箱保存待用。
3.根据权利要求2所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，在所述纯种猪肌肉组织DNA提取步骤中，对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测：对目标区域捕获(液相)前对DNA样本进行检测，检测方法包括以下2种：使用检测器对DNA浓度进行精准定量，总量在250ng以上的DNA样本可以用来建库；琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白质污染。
4.根据权利要求1所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，在步骤二中，对合格样本进行基因重组测序并构建样本库，对重测序原始下机数据使用软件进行数据处理，得到高质量数据，数据质量控制过程具体步骤如下：1)测序read匹配上adapter序列的25％或者以上则删除整条read；2)如果测序read中质量值低于20的碱基占整条read的30％或者以上则删除整条read；3)如果测序read中N含量占整条read的1％或者以上，则删除整条read；4)获得高质量的Clean reads。
5.根据权利要求4所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，对Clean reads进行生物信息学分析，得到高质量SNP数据，具体步骤如下：1)使用软件将通过质量控制的数据比对到猪参考基因组11.1版本参考序列上，得到序列比对信息，生成序列比对结果；2)使用不同软件，将比对结果文件排序并去除PCR扩增等原因产生的重复序列；3)使用软件进行变异检测，最终获得高质量SNP位点数据。
6.根据权利要求1所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，在步骤三中，全基因组关联分析筛选SNP候选位点集合步骤如下：使用软件对上述个体的表型性状(矫正后)和全基因组SNP位点进行关联分析，构建混合线性模型，模型为：y＝Xm+Wa+e
y表示矫正后的表型性状向量；
m表示SNP效应；
a表示残余多基因效应；
e表示残差；
X和W分别表示m和a关联矩阵；
根据关联分析的P值对结果进行过滤，保留P＜1e-3的SNP位点，然后根据连锁不平衡r2值过滤剩余位点，去除连锁不平衡r2＞0.8的SNP位点。最终获得候选SNP位点集合。
7.根据权利要求1所述的一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法，其特征在于，在步骤四中，选取部分种猪个体提取DNA，然后对提取的合格DNA样本进行建库以及对候选SNP位点集合所在区域进行捕获，建库和捕获流程如下：
1)基因组DNA片段化：选取200ng DNA，采用酶切打断的方式将基因组DNA随机打断(150-200bp)；
2)DNA片段末端修复加A，接头连接，纯化，通过Pre-PCR进行文库富集。文库总量在750ng以上，浓度在25ng/ul，文库长度约在270bp-320bp间，判定为合格文库；
3)探针与文库杂交形成RNA-DNA杂合体；
4)带链霉亲和素标记的的磁珠捕获RNA-DNA杂合体；
5)洗脱非特异性结合文库，纯化，得到特异性文库，文库富集；富集后的浓度一般在1-10ng/ul，浓度在1ng/ul为合格文库，可安排上机测序；
6)对合格文库进行高通量测序。
CN202111386954.7A 2021-11-22 2021-11-22 一种主选父系品种猪饲料报酬的液相芯片的制作方法 Pending CN114196761A (zh)

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