CN112695098A - 一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家禽品种的鉴定方法，具体涉及一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法。本发明在筛选得到一组闽清毛脚鸡特异性遗传位点的基础上，进一步对所得遗传位点进行优化筛选，筛选得到了闽清毛脚鸡鉴定率高的特异性位点，利用本发明筛选得到的特异性遗位点进行组合鉴定，准确性更高，所得结果更加可靠。
Description
技术领域
本发明涉及家禽品种的鉴定方法，具体涉及一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法。
背景技术
闽清毛脚鸡，俗称闽清本地鸡、闽清土鸡、毛脚鸡、凤尾鸡，属兼用型地方品种。闽清毛脚鸡中心产区为福建省闽清县的白中镇、坂东镇。2009年“闽清毛脚鸡”，被农业部家禽专业委员会评审通过并认定为畜禽遗传资源品种；2014年，“闽清毛脚鸡”列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。近年来，在各界努力下，闽清毛脚鸡品牌已经小有影响。然而， 由于养殖技术门槛低，以其它地方鸡种或杂交的闽清毛脚鸡冒充纯种闽清毛脚鸡时有发生，严重影响了闽清毛脚鸡品牌形象。为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，需要提供一种有效的闽清毛脚鸡种的鉴定方法。
随着研究的不断进行，发明人发现地方鸡种的特异性位点可能有多个，而在实际测序 判断中，并不是所有的特异性位点都能有效地将所述家禽品种与其它品种区分开。主要原 因可能在于特异性标记在不同群体的分布频率不同，不同位点所在基因片段准确复制的难 易程度不同，或者用于扩增的引物的特异性不同。因而，需要优化特异性位点组合、筛选 特异性较高的引物。
发明内容
本发明主要目的是提供一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法。本发明在筛选得到一组闽清毛 脚鸡特异性遗传位点的基础上，进一步对所得遗传位点进行优化筛选，筛选得到了闽清毛 脚鸡鉴定率高的特异性位点。利用本发明筛选得到的特异性遗位点进行组合鉴定，准确性 更高，所得结果更加可靠。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供用于鉴定闽清毛脚鸡的特异性遗传位点，其包括以下特异性遗传位点：
MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--突变基因型为删除片段TTTTG；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛 脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚 鸡基因型为CC。
本发明提供一种闽清毛脚鸡的鉴定方法，所述方法为：利用以下任意一个或几个特异 性遗传位点进行鉴定：
MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--突变基因型为删除片段TTTTG；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛 脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚 鸡基因型为CC。
进一步地，所述方法为利用以下特异性遗传位点进行鉴定：
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛 脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT。
本发明还提供检测以上所述特异性遗传位点的引物，其包括：
用于检测所述标记MQ_tag1的引物为MQ_P1f和MQ_P1r所示两条单链DNA：
MQ_P1f：TAGGAGGCAGAGGATTCATA；
MQ_P1r：CCACAACCACATCTCATCA；
用于检测所述标记MQ_tag2的引物为MQ_P2f和MQ_P2r所示两条单链DNA：
MQ_P2f：TGAGAACCTTATGTCACCAA；
MQ_P2r：GACTTGTGGAGGCAGAAT；
用于检测所述标记MQ_tag3的引物为MQ_P3f和MQ_P3r所示两条单链DNA：
MQ_P3f：CTCCACTAATTGAAGACACTC；
MQ_P3r：GCTTGACTTACGCAGAATC；
用于检测所述标记MQ_tag4的引物为MQ_P4f和MQ_P4r所示两条单链DNA：
MQ_P4f：TCACTTACATCCTCGTCATC；
MQ_P4r：CAGCATATCTCCTCCAACAT；
用于检测所述标记MQ_tag5的引物为MQ_P5f和MQ_P5r所示两条单链DNA：
MQ_P5f：ATCAGTGAGTTGGATCGTAG；
MQ_P5r：CGTACTTACCTAATGAGACCTA；
用于检测所述标记MQ_tag6的引物为MQ_P6f和MQ_P6r所示两条单链DNA：
MQ_P6f：TCTTCCGCTTCCTGATAGT；
MQ_P6r：CAACAACCAACTTCCTCAAG；
用于检测所述标记MQ_tag7的引物为MQ_P7f和MQ_P7r所示两条单链DNA：
MQ_P7f：CCATCAGCAGCACATATCA；
MQ_P7r：TCGTTCTTCAGTCACCTTC；
用于检测所述标记MQ_tag8的引物为MQ_P8f和MQ_P8r所示两条单链DNA：
MQ_P8f：GCTTACCAGTAGAGTTCCAT；
MQ_P8r：CCACCGAAGTCACAAGAA；
用于检测所述标记MQ_tag9的引物为MQ_P9f和MQ_P9r所示两条单链DNA：
MQ_P9f：AGAAGGTAAGGAGGAGCATA；
MQ_P9r：CAGGTTCAAGGAAGTGTAGA；
用于检测所述标记MQ_tag10的引物为MQ_P10f和MQ_P10r所示两条单链DNA：
MQ_P10f：CAACTCTACTTACCTCTTCCT；
MQ_P10r：CTTGGCAGTCTATGTGTCT；
用于检测所述标记MQ_tag11的引物为MQ_P11f和MQ_P11r所示两条单链DNA：
MQ_P11f：TATGACAGAAGGAGAAGATGG；
MQ_P11r：CAACTACAAGGAATGAGATACC；
用于检测所述标记MQ_tag12的引物为MQ_P12f和MQ_P12r所示两条单链DNA：
MQ_P12f：GTGCTATAATTCACTGGTTAGG；
MQ_P12r：GCAGACAAGATTCAAGTATTCC；
用于检测所述标记MQ_tag13的引物为MQ_P13f和MQ_P13r所示两条单链DNA：
MQ_P13f：ATCCATACGGTGCTCCAT；
MQ_P13r：CAGCCATTCACGCATACT；
用于检测所述标记MQ_tag14的引物为MQ_P14f和MQ_P14r所示两条单链DNA：
MQ_P14f：TGATGGAGCAAGGTGAGA；
MQ_P14r：GGTGTGGTTACGATGTGTA；
用于检测所述标记MQ_tag15的引物为MQ_P15f和MQ_P15r所示两条单链DNA：
MQ_P15f：TGCGACCTGACTTGAATC；
MQ_P15r：GCCTGCTCTATATCCTTACC。
本发明还提供以上所述引物在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
本发明提供一种引物组合，其包括以下所述引物对的任意一种和几种组合：
用于检测所述标记MQ_tag1的引物为MQ_P1f和MQ_P1r所示两条单链DNA：
MQ_P1f：TAGGAGGCAGAGGATTCATA；
MQ_P1r：CCACAACCACATCTCATCA；
用于检测所述标记MQ_tag2的引物为MQ_P2f和MQ_P2r所示两条单链DNA：
MQ_P2f：TGAGAACCTTATGTCACCAA；
MQ_P2r：GACTTGTGGAGGCAGAAT；
用于检测所述标记MQ_tag3的引物为MQ_P3f和MQ_P3r所示两条单链DNA：
MQ_P3f：CTCCACTAATTGAAGACACTC；
MQ_P3r：GCTTGACTTACGCAGAATC；
用于检测所述标记MQ_tag4的引物为MQ_P4f和MQ_P4r所示两条单链DNA：
MQ_P4f：TCACTTACATCCTCGTCATC；
MQ_P4r：CAGCATATCTCCTCCAACAT；
用于检测所述标记MQ_tag5的引物为MQ_P5f和MQ_P5r所示两条单链DNA：
MQ_P5f：ATCAGTGAGTTGGATCGTAG；
MQ_P5r：CGTACTTACCTAATGAGACCTA；
用于检测所述标记MQ_tag6的引物为MQ_P6f和MQ_P6r所示两条单链DNA：
MQ_P6f：TCTTCCGCTTCCTGATAGT；
MQ_P6r：CAACAACCAACTTCCTCAAG；
用于检测所述标记MQ_tag7的引物为MQ_P7f和MQ_P7r所示两条单链DNA：
MQ_P7f：CCATCAGCAGCACATATCA；
MQ_P7r：TCGTTCTTCAGTCACCTTC；
用于检测所述标记MQ_tag8的引物为MQ_P8f和MQ_P8r所示两条单链DNA：
MQ_P8f：GCTTACCAGTAGAGTTCCAT；
MQ_P8r：CCACCGAAGTCACAAGAA；
用于检测所述标记MQ_tag9的引物为MQ_P9f和MQ_P9r所示两条单链DNA：
MQ_P9f：AGAAGGTAAGGAGGAGCATA；
MQ_P9r：CAGGTTCAAGGAAGTGTAGA；
用于检测所述标记MQ_tag10的引物为MQ_P10f和MQ_P10r所示两条单链DNA：
MQ_P10f：CAACTCTACTTACCTCTTCCT；
MQ_P10r：CTTGGCAGTCTATGTGTCT；
用于检测所述标记MQ_tag11的引物为MQ_P11f和MQ_P11r所示两条单链DNA：
MQ_P11f：TATGACAGAAGGAGAAGATGG；
MQ_P11r：CAACTACAAGGAATGAGATACC；
用于检测所述标记MQ_tag12的引物为MQ_P12f和MQ_P12r所示两条单链DNA：
MQ_P12f：GTGCTATAATTCACTGGTTAGG；
MQ_P12r：GCAGACAAGATTCAAGTATTCC；
用于检测所述标记MQ_tag13的引物为MQ_P13f和MQ_P13r所示两条单链DNA：
MQ_P13f：ATCCATACGGTGCTCCAT；
MQ_P13r：CAGCCATTCACGCATACT；
用于检测所述标记MQ_tag14的引物为MQ_P14f和MQ_P14r所示两条单链DNA：
MQ_P14f：TGATGGAGCAAGGTGAGA；
MQ_P14r：GGTGTGGTTACGATGTGTA；
用于检测所述标记MQ_tag15的引物为MQ_P15f和MQ_P15r所示两条单链DNA：
MQ_P15f：TGCGACCTGACTTGAATC；
MQ_P15r：GCCTGCTCTATATCCTTACC。
进一步地，所述引物组合由以下引物对组成：MQ_P2f和MQ_P2r，MQ_P3f和MQ_P3r，MQ_P5f和MQ_P5r，MQ_P7f和MQ_P7r，MQ_P8f和MQ_P8r，MQ_P9f和MQ_P9r，MQ_P10f 和MQ_P10r，MQ_P11f和MQ_P11r，MQ_P12f和MQ_P12r，MQ_P13f和MQ_P13r。
本发明还提供以上所述引物组合在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
本发明还提供包括以上所述引物组合的试剂盒。
本发明还提供以上所述试剂盒在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明筛选得到一组闽清毛脚鸡特异性遗传位点，包括SNPs位点和INDELs位点。本 发明所述特异性遗传位点分布在不同染色体上，以此作为鉴定位点，提高了检测试验的准 确性和柔韧性。
目前，对于生物特异性遗传位点的筛选往往通过软件分析获得具有特异性的位点，而 本发明筛选所得特异性位点是通过对闽清毛脚鸡及其它13个地方鸡种进行简化基因组测序， 经过系统进化树构建、混群分析、Mantel测试、最小等位基因频率-连锁不平衡分析，初步 筛选获得具有闽清毛脚鸡特异性的遗传位点。然后，通过标记组合优化、PCR引物设计与 验证、大群体验证，在此基础上获得了本发明所述闽清毛脚鸡品特异性遗传位点及组合。 筛选所得遗传性特异位点对闽清毛脚鸡的鉴定率均在85％及以上。
本发明所述鉴定方法可更有效地实现对闽清毛脚鸡的鉴定，实用强，所述方法、引物 组合及试剂盒可广泛推广应用，对闽清毛脚鸡种的鉴定和保护具有重要的意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为基于贝叶斯法构建的地方鸡种系统进化树。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指 明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的 相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发 明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图 包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其 指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实 施例详细说明本发明的技术方案。
述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试 剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1简化基因组测序筛选闽清毛脚鸡种特异性SNPs/INDELs标记
(一)
供试样本:包括闽清毛脚鸡(20只)、济宁百日鸡(20只)、琅琊鸡(20只)、寿光鸡(20只)、汶上芦花鸡(20只)、如皋黄鸡(20只)、闽清毛脚鸡(20只)、太湖鸡(20只)、 溧阳鸡(20只)、徐海鸡(20只)、龙胜凤鸡(20只)、狼山鸡(20只)、淮北麻鸡(20只)， 每个品种公母各半。翅静脉采血0.5-1.0ml，置入抗凝管，-70℃保存。
采用CTAB方法提取基因组DNA，以限制性内切酶EcoRI和NIaIII对基因组DNA进行酶切， 然后加上测序接头，构建小片段文库，进行GBS简化基因组测序。
为了检查酶切的效率，便于后续序列分析，进行了染色体电子酶切评估。为了保证数据 质量，对原始序列进行更严格的过滤：去除含有接头序列的读长；去除未知碱基比例大于10％ 的读长；去除低质量读长(Q值低于10的碱基占比高于50％以上)。龙胜凤鸡1个体因质控不合 格，将其从测序数据中剔除。
为分析不同构建方法对系统进化树拓扑形状的影响，研究以地方鸡种简化基因组测序数 据为对象，应用软件包IQ-tree、MrBayes构建系统进化树，所得进化树如图1所示。
以最小等位基因频率-连锁不平衡方法分析259个地方鸡简化基因组序列，筛选得到20个 闽清毛脚鸡品种特异性分子标记。20个SNPs/INDELs位点的物理位置是基于鸡全基因组参考 序列比对确定的，所述鸡全基因组标准序列的版本号为(Gallus gallusGRCg6)。闽清毛脚鸡 品种特异性SNPs/INDELs标记具体如下:
MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--突变基因型为删除片段TTTTG；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛 脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚 鸡基因型为CC；
Candidate2_2位于鸡2号染色体，物理位置1399524处，基因GHRHR与基因ADCYAP1R1之间，闽清毛脚鸡基因型为TT；
Candidate3_2位于3号染色体7106653处，基因NRXN1与基因CTAGE1(OTOR)之 间，闽清毛脚鸡基因型为AA；
Candidate4_1位于4号染色体4196467处，基因FHL1的5‘UTR区以及基因SLC9A6 的3’UTR区，闽清毛脚鸡基因型为AA；
Candidate9_1位于鸡9号染色体6864614处，基因CORO1C第8内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
CandidateZ_1位于鸡Z染色体66449744处，基因UGCG与基因SUSD1之间，闽清毛 脚鸡基因型为GG。
MQ_tag1、MQ_tag2为特异性INDELs位点，其它均为SNPs位点。
检测以上所述特异性遗传位点的引物：
用于检测所述标记MQ_tag1的引物为MQ_P1f和MQ_P1r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag2的引物为MQ_P2f和MQ_P2r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag3的引物为MQ_P3f和MQ_P3r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag4的引物为MQ_P4f和MQ_P4r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag5的引物为MQ_P5f和MQ_P5r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag6的引物为MQ_P6f和MQ_P6r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag7的引物为MQ_P7f和MQ_P7r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag8的引物为MQ_P8f和MQ_P8r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag9的引物为MQ_P9f和MQ_P9r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag10的引物为MQ_P10f和MQ_P10r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag11的引物为MQ_P11f和MQ_P11r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag12的引物为MQ_P12f和MQ_P12r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag13的引物为MQ_P13f和MQ_P13r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag14的引物为MQ_P14f和MQ_P14r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记MQ_tag15的引物为MQ_P15f和MQ_P15r所示两条单链DNA；
用于检测所述标记Candidate2_2的引物为Candidate_P2_2f和Candidate_P2_2r所示两 条单链DNA；
用于检测所述标记Candidate3_2的引物为Candidate_P3_2f和Candidate_P3_2r所示两 条单链DNA；
用于检测所述标记Candidate4_1的引物为Candidate_P4_1f和Candidate_P4_1r所示两 条单链DNA；
用于检测所述标记Candidate9_1的引物为Candidate_P9_1f和Candidate_P9_1r所示两 条单链DNA；
用于检测所述标记CandidateZ_1的引物为Candidate_PZ_1f和Candidate_PZ_1r所示两 条单链DNA；
各引物序列、长度，扩增片段长度及退火温度如下表1所示。
表1.检测闽清毛脚鸡品种特异性标记所用扩增引物
(二)
应用上述筛选得到的20个标记对20份闽清毛脚鸡血样和360份非闽清毛脚鸡血样进 行鉴定。具体操作步骤如下：
以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。
PCR扩增过程：
1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各l0ng，5μL 2×power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足。
2)反应程序：首先94℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,50.6-56.1℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。
扩增产物送至测序公司进行序列检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测 片段扩增长度，作为基因分型结果。各特异性遗传位点的鉴定结果如表2所示。
表2.闽清毛脚鸡品种特异性标记鉴定率
由上述表2可知，鹿苑_tag1-12所述遗传特异性位点对闽清毛脚鸡的鉴定率均在85％及以 上，其中多个位点的鉴定率可达95％以上；而筛选所得Candidate2_2等五个位点对闽清毛脚鸡 的鉴定率均低于80％而淘汰。依据表2所示验证结果，本发明所述各特异性位点均可很好地用 于闽清毛脚鸡的鉴定。
实施例2一种有效鉴定闽清毛脚鸡的方法
所述方法包括，采用以下特异性遗传位点进行鉴定：
MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--(突变基因型为删除片段TTTTG)；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛 脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚 鸡基因型为CC。若待测鸡种具有以上所述特异性位点且基因型于闽清毛脚鸡相同则该鸡种为闽清毛脚鸡。
实施例3一种有效鉴定闽清毛脚鸡的方法
所述方法包括，采用以下特异性遗传位点进行鉴定：MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡 基因型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为AA；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因 型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚 鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽 清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基 因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因 型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡 基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基 因型为TT。若待测鸡种具有以上所述特异性位点且基因型于闽清毛脚鸡相同则该鸡种为闽清毛脚鸡。
实施例4一种引物组合
所述引物组合由以下引物对组成：MQ_P2f和MQ_P2r，MQ_P3f和MQ_P3r，MQ_P5f 和MQ_P5r，MQ_P7f和MQ_P7r，MQ_P8f和MQ_P8r，MQ_P9f和MQ_P9r，MQ_P10f和 MQ_P10r，MQ_P11f和MQ_P11r，MQ_P12f和MQ_P12r，MQ_P13f和MQ_P13r。
所述引物组合可用于闽清毛脚鸡种的鉴定，也可用于制备鉴定闽清毛脚鸡种的试剂盒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于鉴定闽清毛脚鸡的特异性遗传位点，其特征在于，其包括以下特异性遗传位点：
MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--(突变基因型为删除片段TTTTG)；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为CC。
2.一种闽清毛脚鸡的鉴定方法，其特征在于，利用以下任意一个或几个特异性遗传位点进行鉴定：MQ_tag1位于鸡1号染色体172713037处，基因FREM2第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为--(突变基因型为删除片段TTTTG)；
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag4位于鸡3号染色体71462156处，基因USP45第8内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚鸡基因型为AA；
MQ_tag6位于鸡5号染色体23747340处，AMBRA1基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag14位于鸡25染色体2265790处，基因LOC408038下游区域，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag15位于鸡Z染色体75215975处，基因LOC112530706第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为CC。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用以下特异性遗传位点进行鉴定：
MQ_tag2位于鸡2号染色体36785616处，基因ZNF385D与UBE2E2之间，闽清毛脚鸡为插入基因型，基因型为TT；
MQ_tag3位于鸡2号染色体90080648处，基因CARMIL1第2内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag5位于鸡4号染色体33359244处，SH3D19基因与GATB基因之间，闽清毛脚鸡基因型为AA；
MQ_tag7位于鸡6号染色体15730043处，SAMD8基因第1内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag8位于鸡7号染色体23125070处，TNS1基因与IGFBP5基因之间，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag9位于鸡10号染色体12633814处，CFAP161基因与MESDC1基因之间，闽清毛脚鸡基因型为CC；
MQ_tag10位于鸡12染色体15612830处，基因FAM19A4第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为GG；
MQ_tag11位于鸡14染色体9698701处，基因GRIN2A第3内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT；
MQ_tag12位于鸡15染色体12332985处，基因MED13L与TBX3之间，闽清毛脚鸡基因型为AA。
MQ_tag13位于鸡17号染色体9204163处，STRBP基因第16内含子，闽清毛脚鸡基因型为TT。
4.检测权利要求1所述特异性遗传位点的引物，其特征在于，其包括：
用于检测所述标记MQ_tag1的引物为MQ_P1f和MQ_P1r所示两条单链DNA：
MQ_P1f：TAGGAGGCAGAGGATTCATA；
MQ_P1r：CCACAACCACATCTCATCA；
用于检测所述标记MQ_tag2的引物为MQ_P2f和MQ_P2r所示两条单链DNA：
MQ_P2f：TGAGAACCTTATGTCACCAA；
MQ_P2r：GACTTGTGGAGGCAGAAT；
用于检测所述标记MQ_tag3的引物为MQ_P3f和MQ_P3r所示两条单链DNA：
MQ_P3f：CTCCACTAATTGAAGACACTC；
MQ_P3r：GCTTGACTTACGCAGAATC；
用于检测所述标记MQ_tag4的引物为MQ_P4f和MQ_P4r所示两条单链DNA：
MQ_P4f：TCACTTACATCCTCGTCATC；
MQ_P4r：CAGCATATCTCCTCCAACAT；
用于检测所述标记MQ_tag5的引物为MQ_P5f和MQ_P5r所示两条单链DNA：
MQ_P5f：ATCAGTGAGTTGGATCGTAG；
MQ_P5r：CGTACTTACCTAATGAGACCTA；
用于检测所述标记MQ_tag6的引物为MQ_P6f和MQ_P6r所示两条单链DNA：
MQ_P6f：TCTTCCGCTTCCTGATAGT；
MQ_P6r：CAACAACCAACTTCCTCAAG；
用于检测所述标记MQ_tag7的引物为MQ_P7f和MQ_P7r所示两条单链DNA：
MQ_P7f：CCATCAGCAGCACATATCA；
MQ_P7r：TCGTTCTTCAGTCACCTTC；
用于检测所述标记MQ_tag8的引物为MQ_P8f和MQ_P8r所示两条单链DNA：
MQ_P8f：GCTTACCAGTAGAGTTCCAT；
MQ_P8r：CCACCGAAGTCACAAGAA；
用于检测所述标记MQ_tag9的引物为MQ_P9f和MQ_P9r所示两条单链DNA：
MQ_P9f：AGAAGGTAAGGAGGAGCATA；
MQ_P9r：CAGGTTCAAGGAAGTGTAGA；
用于检测所述标记MQ_tag10的引物为MQ_P10f和MQ_P10r所示两条单链DNA：
MQ_P10f：CAACTCTACTTACCTCTTCCT；
MQ_P10r：CTTGGCAGTCTATGTGTCT；
用于检测所述标记MQ_tag11的引物为MQ_P11f和MQ_P11r所示两条单链DNA：
MQ_P11f：TATGACAGAAGGAGAAGATGG；
MQ_P11r：CAACTACAAGGAATGAGATACC；
用于检测所述标记MQ_tag12的引物为MQ_P12f和MQ_P12r所示两条单链DNA：
MQ_P12f：GTGCTATAATTCACTGGTTAGG；
MQ_P12r：GCAGACAAGATTCAAGTATTCC；
用于检测所述标记MQ_tag13的引物为MQ_P13f和MQ_P13r所示两条单链DNA：
MQ_P13f：ATCCATACGGTGCTCCAT；
MQ_P13r：CAGCCATTCACGCATACT；
用于检测所述标记MQ_tag14的引物为MQ_P14f和MQ_P14r所示两条单链DNA：
MQ_P14f：TGATGGAGCAAGGTGAGA；
MQ_P14r：GGTGTGGTTACGATGTGTA；
用于检测所述标记MQ_tag15的引物为MQ_P15f和MQ_P15r所示两条单链DNA：
MQ_P15f：TGCGACCTGACTTGAATC；
MQ_P15r：GCCTGCTCTATATCCTTACC。
5.权利要求4所述引物在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
6.引物组合，其特征在于，其包括以下所述引物对的任意一种和几种组合：
用于检测所述标记MQ_tag1的引物为MQ_P1f和MQ_P1r所示两条单链DNA：
MQ_P1f：TAGGAGGCAGAGGATTCATA；
MQ_P1r：CCACAACCACATCTCATCA；
用于检测所述标记MQ_tag2的引物为MQ_P2f和MQ_P2r所示两条单链DNA：
MQ_P2f：TGAGAACCTTATGTCACCAA；
MQ_P2r：GACTTGTGGAGGCAGAAT；
用于检测所述标记MQ_tag3的引物为MQ_P3f和MQ_P3r所示两条单链DNA：
MQ_P3f：CTCCACTAATTGAAGACACTC；
MQ_P3r：GCTTGACTTACGCAGAATC；
用于检测所述标记MQ_tag4的引物为MQ_P4f和MQ_P4r所示两条单链DNA：
MQ_P4f：TCACTTACATCCTCGTCATC；
MQ_P4r：CAGCATATCTCCTCCAACAT；
用于检测所述标记MQ_tag5的引物为MQ_P5f和MQ_P5r所示两条单链DNA：
MQ_P5f：ATCAGTGAGTTGGATCGTAG；
MQ_P5r：CGTACTTACCTAATGAGACCTA；
用于检测所述标记MQ_tag6的引物为MQ_P6f和MQ_P6r所示两条单链DNA：
MQ_P6f：TCTTCCGCTTCCTGATAGT；
MQ_P6r：CAACAACCAACTTCCTCAAG；
用于检测所述标记MQ_tag7的引物为MQ_P7f和MQ_P7r所示两条单链DNA：
MQ_P7f：CCATCAGCAGCACATATCA；
MQ_P7r：TCGTTCTTCAGTCACCTTC；
用于检测所述标记MQ_tag8的引物为MQ_P8f和MQ_P8r所示两条单链DNA：
MQ_P8f：GCTTACCAGTAGAGTTCCAT；
MQ_P8r：CCACCGAAGTCACAAGAA；
用于检测所述标记MQ_tag9的引物为MQ_P9f和MQ_P9r所示两条单链DNA：
MQ_P9f：AGAAGGTAAGGAGGAGCATA；
MQ_P9r：CAGGTTCAAGGAAGTGTAGA；
用于检测所述标记MQ_tag10的引物为MQ_P10f和MQ_P10r所示两条单链DNA：
MQ_P10f：CAACTCTACTTACCTCTTCCT；
MQ_P10r：CTTGGCAGTCTATGTGTCT；
用于检测所述标记MQ_tag11的引物为MQ_P11f和MQ_P11r所示两条单链DNA：
MQ_P11f：TATGACAGAAGGAGAAGATGG；
MQ_P11r：CAACTACAAGGAATGAGATACC；
用于检测所述标记MQ_tag12的引物为MQ_P12f和MQ_P12r所示两条单链DNA：
MQ_P12f：GTGCTATAATTCACTGGTTAGG；
MQ_P12r：GCAGACAAGATTCAAGTATTCC；
用于检测所述标记MQ_tag13的引物为MQ_P13f和MQ_P13r所示两条单链DNA：
MQ_P13f：ATCCATACGGTGCTCCAT；
MQ_P13r：CAGCCATTCACGCATACT；
用于检测所述标记MQ_tag14的引物为MQ_P14f和MQ_P14r所示两条单链DNA：
MQ_P14f：TGATGGAGCAAGGTGAGA；
MQ_P14r：GGTGTGGTTACGATGTGTA；
用于检测所述标记MQ_tag15的引物为MQ_P15f和MQ_P15r所示两条单链DNA：
MQ_P15f：TGCGACCTGACTTGAATC；
MQ_P15r：GCCTGCTCTATATCCTTACC。
7.根据权利要求6所述引物组合，其特征在于，其由以下引物对组成：MQ_P2f和MQ_P2r，MQ_P3f和MQ_P3r，MQ_P5f和MQ_P5r，MQ_P7f和MQ_P7r，MQ_P8f和MQ_P8r，MQ_P9f和MQ_P9r，MQ_P10f和MQ_P10r，MQ_P11f和MQ_P11r，MQ_P12f和MQ_P12r，MQ_P13f和MQ_P13r。
8.权利要求6或7所述引物组合在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
9.包括权利要求6所述引物组合的试剂盒。
10.权利要求9所述试剂盒在鉴定闽清毛脚鸡种中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202011411518.6A CN112695098A (zh) | 2020-12-04 | 2020-12-04 | 一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011411518.6A CN112695098A (zh) | 2020-12-04 | 2020-12-04 | 一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法 |
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|---|---|
| CN112695098A true CN112695098A (zh) | 2021-04-23 |
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105907867A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-31 | 江苏省家禽科学研究所 | 用于鉴定狼山鸡种特异性的snp标记及测定snp位点的方法 |
| CN106434867A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-02-22 | 江苏省家禽科学研究所 | 监测家禽保种效果的snp标记筛选方法及其在鸡保种上的应用、以及snp标记的鉴定方法 |
| WO2020122507A1 (ko) * | 2018-12-12 | 2020-06-18 | 충남대학교산학협력단 | 토종닭의 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도 |
-
2020
- 2020-12-04 CN CN202011411518.6A patent/CN112695098A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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