CN117701738A - 与水牛初产月龄性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，涉及与水牛繁殖性状初产月龄相关的SNP分子标记。本发明提供7个SNP与水牛初产月龄性状(P<0.01)显著相关，该位点可应用于对水牛初产月龄的相关基因的基因型分析中，为水牛高/低水牛初产月龄的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源，加快选育良种水牛。在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高选择效率，加快育种进程，节省中间饲养费用，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及与水牛初产月龄性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
水牛被联合国粮农组织(FAO)认为是最具开发潜力和开发价值的家畜，是我国南方重要的畜种资源。水牛的繁殖性状是重要的经济性状，为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多，通过传统方法选育高繁殖力水牛进展缓慢。目前，全基因组关联分析(GWAS)为数量性状的研究提供了新的方向，通过GWAS测序，可以在全基因组范围内筛选出与动植物经济性状相关的遗传变异，即单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。
水牛的世代间隔长.初产年龄较迟(一般荷斯坦奶牛在30月龄以前已产第一胎，而奶水牛47月龄左右才产第一胎)，前期饲养成本高、投资收益回报年限长，这些因素制约了水牛奶业的进一步发展。因此通过GBS得到的水牛全基因组测序数据、水牛基因组高质量组装(UOA_WB_1)和水牛繁殖性状(初产月龄)三者进行结合分析，可以挖掘出大量之前从未发现的与水牛繁殖性状(初产月龄)相关联的SNP位点。以此增加对复杂性状分子遗传机制的理解，并筛选出影响初产月龄的SNP位点对水牛进行基因育种，降低水牛的初产月龄，提高水牛群体的繁殖能力，最终促进水牛产业发展。
发明内容
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供了一种与水牛初产月龄性状的SNP分子标记及其应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
与水牛繁殖性状相关的SNP分子标记，所述繁殖性状是指水牛初产月龄，所述与水牛初产月龄相关的SNP分子标记至少包括以下标记之一：
标记一：chr4_71082002位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或G；
标记二：chr6_96791388位于如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记三：chr7_59963243位于如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C；
标记四：chr10_13862680位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或T；
标记五：chr12_3176008位于如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记六：chr13_86238940位于如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记七：chr18_59367852位于如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C。
本发明的另一个目的在于提供用于扩增上述的SNP分子标记组合的引物组。
进一步说明，所述引物组包含Forwardprimer和Reverse primer；其中，
所述chr4_71082002分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；
所述chr6_96791388分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
所述chr7_59963243分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；
所述chr10_13862680分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
所述chr12_3176008分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；
所述chr13_86238940分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；
所述chr18_59367852分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示。
本发明第三个目的在于提供一种试剂盒，包括如上所述的引物组。
本发明第四个目的在于提供上述的SNP分子标记组合或上述的引物组在水牛分子标记辅助育种中的应用。
本发明第四个目的在于提供上述的SNP分子标记组合或上述的引物组在水牛繁殖性状鉴定中的应用。
本发明第五个目的在于提供如上述利用分子生物学技术检测水牛基因型的方法，包括以下步骤：根据权利要求1所述的7个SNP分子标记位点两侧翼的核苷酸序列分别设计扩增引物，以水牛个体DNA为模板扩增，将扩增产物进行一代测序，根据测序结果对水牛个体进行基因分型，从而鉴定待测水牛个体的基因型。
进一步说明，所述的方法在水牛分子标记辅助育种中的应用。
本发明第六个目的在于应用上述的SNP分子标记选育/辅助选育与水牛初产月龄性状相关的水牛品种或品系的方法，所述方法是：
提取水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第71082002位点的脱氧核苷酸，测出第71082002位点的脱氧核苷酸为C或G，确定待测水牛的基因型是CC型、CG或GG型，据育种需求，选择CC型、CG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于CG或GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第96791388位点的脱氧核苷酸，测出第96791388位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型、GA型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测7号染色体的第59963243位点的脱氧核苷酸，测出第59963243位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测10号染色体的第13862680位点的脱氧核苷酸，测出第13862680位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测水牛的基因型是TT型、TC或CC型，据育种需求，选择TT型、TC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT或TC型基因的水牛初产月龄远低于CC型；
提取水牛的基因组DNA，检测12号染色体的第3176008位点的脱氧核苷酸，测出第3176008位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AG型基因的水牛初产月龄远低于GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测13号染色体的第86238940位点的脱氧核苷酸，测出第86238940位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的水牛初产月龄远低于AG或GG型
提取水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第59367852位点的脱氧核苷酸，测出第593678520位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AC型基因的水牛初产月龄远低于CC型。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供水牛初产月龄性状的7个SNP(chr4_71082002，chr6_96791388，chr7_59963243，chr10_13862680，chr12_3176008，chr13_86238940，chr18_59367852)与水牛初产月龄(P<0.05)显著相关，该位点可应用于对水牛初产月龄的相关基因的基因型分析中，为水牛高/低初产月龄的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源，加快选育良种水牛。在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高选择效率，加快育种进程，节省中间饲养费用，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明水牛初产月龄性状全基因组关联分析的初产月龄曼哈顿图。附图标记说明：涉及水牛初产月龄性状，高于虚线上的为本发明筛选的7个SNP分子标记chr4_71082002，chr6_96791388，chr7_59963243，chr10_13862680，chr12_3176008，chr13_86238940，chr18_59367852，这些标记分别位于水牛4、6、7、10、12、13、18号染色体上。
图2是本发明水牛初产月龄繁殖性状全基因组关联分析的QQ图。
具体实施方式
以下结合附图对发明的具体实施进一步说明。
实施例1用于检测水牛初产月龄性状的SNP分子标记的筛选与开发
(1)数据来自2000年至2021年在中国广西水牛研究所饲养的1头本地水牛，46头杂交水牛，31头水牛，42头摩拉水牛(共计120头)的系谱、生产记录和繁殖性状的记录。特征初产月龄被定义为水牛从出生到第一次产仔的天数。
样本采集和测序：
使用苯酚/氯仿法从血液中提取基因组DNA。使用琼脂糖凝胶电泳评估和验证基因组DNA的完整性和产量。
使用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后加上带barcode的测序接头，对样本进行混合，构建小片段文库(300-400bp)，并使用Illumina HiSeqTM 2000系统(Illumina，San Diego，CA)进行测序。
(2)表型数据整理及分析：利用R软件对步骤(1)收集到的表型数据进行统计和分析，包括最小值、最大值、平均值、标准差，结果如表1所示
表1水牛表型测定数据统计分析
| 记录数 | 均值 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 变异系数 | |
| 初产月龄/月 | 105 | 44.41 | 15.50 | 5.5 | 120.5 | 34.9 |
(3)DNA提取及测序：用真空采血器从水牛颈静脉采集血液样本，参考《分子克隆实验指南IV》中的酚/氯仿法提取基因组DNA，通过紫外分光光度计检测DNA纯度，检测合格后送往广州基迪奥生物科技有限公司进行简化基因组重测序，测序平台为Illumina HiSeqTM2000，对测序下机数据进行过滤并获得有效信息，过滤标准主要有：1)过滤掉含有接头序列的reads；2)当去除含N比例大于10％的reads；3)去除低质量reads(质量值Q≤10的碱基数占整条read的50％以上)；获得有效数据后，对其进行进一步的测序质量评估，检查错误率分布情况；测序错误率及准确度如表2所示；
表2水牛基因组DNA重测序结果统计
| 数值 | Clean Data(bp) | HQ Clean Data(bp) | Q20(％) | Q30(％) | GC(％) |
| MIN | 676186676 | 664759766 | 97.56 | 92.61 | 42.11 |
| MAX | 2965862268 | 2892808249 | 98.58 | 95.09 | 43.65 |
| MEAN | 1288934542 | 1261925441 | 98.07 | 93.83 | 43.01 |
(4)基因组数据比对：通过生物信息分析软件BWA、SAMtools和GATK对测序获得的基因组数据进行比对及分析；对比参考基因组为水牛的第四版参考基因(GCA_003121395.1)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_003121395.1/)，使用比对软件bwa(0.7.12)采用mem算法将过滤后的reads比对到参考基因组上，比对参数为-k 32-M；比对完之后结果使用picard(1.129)软件(MarkDuplicates等等)进行标记，但不会过滤去。群体样本平均比对率为99.54％。详细信息见表3。
表3水牛基因组数据比对结果统计
(5)SNP质控及过滤：Variant变异指在基因组水平上由单个核苷酸或者几个核苷酸的插入或缺失所引起的的变异形成DNA序列多态性。我们使用软件GATK(3.4-46)的UnifiedGenotyper模块将处理好的比对文件进行多个样本的Variant检测，检测到的变异使用VariantFiltration进行过滤，过滤参数为-Window 4，-filter"QD<4.0||FS>60.0||MQ<40.0"，-G_filter"GQ<20"。经过上述步骤，初步得到的2012270个SNP。
因为稀有等位(群体中频率很低的等位)、高缺失率、高杂合率等位点会引起群体分析和全基因组关联分析异常(线性模型对极端情况的处理能力非常弱)，可能使软件给出错误的结果，所以对原始的标记位点，使用自写的perl脚本，按照以下条件进行过滤：
1)非二等位位点去除。
2)第二等位基因频率(minor allele frequency，MAF)小于0.05的位点去除。
3)缺失率大于0.5的位点去除。
4)杂合比例大于0.8的位点去除。
最后获得常染色体上的691729个SNP用于后续的关联分析；
(6)全基因组关联分析(GWAS)：利用GCTA软件进行主成分分析，随后利用GEMMA软件结合表型信息及基因组SNP信息进行关联分析，在某一性状内，剔除表型值离散在平均值±3倍标准差外的个体，主成分的前三个值以及性别作为协变量加入混合线性模型中，模型如下：
y＝Xα+Zβ+Wμ+e
其中，y为表型向量，X为基因型矩阵，α为基因型效应向量，Q为固定效应矩阵(本研究中为PCA得分矩阵)，β为固定效应向量，K为随机效应矩阵，主要指亲缘关系矩阵，μ为随机效应向量，e为残差向量。针对每个SNP位点，都检验α是否为0，α为0的概率值p用于衡量标记基因型与表型的关联程度，p值越小，α为0的概率越小，该标记越可能与性状关联。
(7)筛选并提取与水牛初产月龄性状相关的SNP分子标记：通过R软件提取达到显著关联水平的位点，显著性阈值设置为Bonferroni调整的全基因组提示性显著性(5×10-6)，以检测有意义的相关性。这些位点的信息见图1～2和表4所示，它们与水牛的初产月龄相关联，可以用于水牛初产月龄性状的选育。
在水牛育种时，可以利用上述SNP分子标记，在其两侧翼的核苷酸序列上设计引物，在水牛出生时采集血液并提取基因组DNA，利用引物对待测水牛材料进行基因分型，保留带有目的性状基因型的个体，可以加快育种速度。
表4 7个分子标记的信息
实施例2：7个SNP标记位点引物组在水牛初产月龄性状检测中的应用
对挑选的水牛进行颈静脉采集血液并采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用核酸浓度测定仪检测DNA浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳测定DNA样品质量。针对筛选出来的7个候选SNP位点设计扩增引物(如表5)。引物序列为：
表5 7个候选SNP位点引物设计
注：表中的F即上游引物Forward primer，R即下游引物Reverse primer
利用上述引物，以水牛血液基因组DNA为模板进行PCR扩增。采用50μL PCR反应体系：ddH2O 19μL，Premix TaqTM25μL，DNA模板2.0μL，引物(上游引物和下游引物均为10μmol/L)各2.0μL。
PCR反应条件：
95℃预变性4min；94℃变性10s，退火30s(温度为55℃)，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。
用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。将上述获得的PCR纯化产物回收后直接送至华大基因(深圳)生物科技公司进行一代测序。根据测序结果对个体基因分型。基因分型结果见表6。
表6 7个候选SNP位点在水牛基因型频率和等位基因频率
从表6中可以看出突变位点chr4_71082002的C等位基因频率要明显大于G等位基因频率；突变位点chr6_96791388的G等位基因频率要明显大于A等位基因频率；chr7_59963243位点的C等位基因频率要明显大于A等位基因频率；chr10_13862680位点的T等位基因频率要明显大于C等位基因频率；chr12_3176008和chr13_86238940位点的A等位基因频率明显大于G；chr18_59367852位点的A等位基因频率要明显大于C等位基因频率。
表7水牛初产月龄显著关联SNP验证
初产月龄表型值以“最小二乘均值±标准差”表示，同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)；SNP位点基因型按照突变型、杂合型、参考型依次排列。结果表明，通过验证发现候选chr4_71082002，chr6_96791388，chr7_59963243，chr10_13862680，chr12_3176008，chr13_86238940，chr18_59367852不同基因型与水牛初产月龄具有显著差异(表7)，chr4_71082002候选CC型初产月龄显著小于CG或GG型，chr6_96791388候选GG型或GA型初产月龄显著小于AA型，chr7_59963243候选CC型初产月龄显著小于AA型，chr10_13862680候选TT型或TC型初产月龄显著小于CC型，chr12_3176008候选AA型或AG型初产月龄显著小于GG型，chr13_86238940候选AA型初产月龄显著小于AG型或GG型，chr18_5936785候选AA型或AC型初产月龄显著小于CC型，能够缩短繁殖间隔，可作为鉴定水牛繁殖性状初产月龄的分子标记辅助育种，应用到生产中。
实施例4：
在水牛育种时，可以利用以上7个SNP分子标记，在其两侧翼的核苷酸序列上分别设计扩增引物，在水牛3～6月龄时采集水牛颈静脉血液，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以水牛个体DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物一代测序，根据测序结果进行基因分型，保留带有目的性状基因型的个体，可以缩短育种年限，加快育种速度。
可应用本申请的SNP分子标记选育/辅助选育与水牛初产月龄性状相关的水牛品种或品系的方法，所述方法是：
提取水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第71082002位点的脱氧核苷酸，测出第71082002位点的脱氧核苷酸为C或G，确定待测水牛的基因型是CC型、CG或GG型，据育种需求，选择CC型、CG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于CG或GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第96791388位点的脱氧核苷酸，测出第96791388位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型、GA型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测7号染色体的第59963243位点的脱氧核苷酸，测出第59963243位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测10号染色体的第13862680位点的脱氧核苷酸，测出第13862680位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测水牛的基因型是TT型、TC或CC型，据育种需求，选择TT型、TC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT或TC型基因的水牛初产月龄远低于CC型；
提取水牛的基因组DNA，检测12号染色体的第3176008位点的脱氧核苷酸，测出第3176008位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AG型基因的水牛初产月龄远低于GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测13号染色体的第86238940位点的脱氧核苷酸，测出第86238940位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的水牛初产月龄远低于AG或GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第59367852位点的脱氧核苷酸，测出第593678520位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AC型基因的水牛初产月龄远低于CC型。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (9)
1.与水牛繁殖性状相关的SNP分子标记，其特征在于：所述繁殖性状是指水牛初产月龄，所述水牛为水牛；所述与水牛初产月龄相关的SNP分子标记至少包括以下标记之一：
标记一：chr4_71082002位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或G；
标记二：chr6_96791388位于如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记三：chr7_59963243位于如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C；
标记四：chr10_13862680位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或T；
标记五：chr12_3176008位于如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记六：chr13_86238940位于如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
标记七：chr18_59367852位于如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C。
2.用于扩增如权利要求1所述的SNP分子标记组合的引物组。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述引物组包含Forwardprimer和Reverse primer；其中，
所述chr4_71082002分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；
所述chr6_96791388分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
所述chr7_59963243分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；
所述chr10_13862680分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
所述chr12_3176008分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；
所述chr13_86238940分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；
所述chr18_59367852分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述引物组。
5.如权利要求1所述的SNP分子标记组合或权利要求2或3任一项所述的引物组在水牛分子标记辅助育种中的应用。
6.如权利要求1所述的SNP分子标记组合或权利要求2或3任一项所述的引物组在水牛繁殖性状鉴定中的应用。
7.利用分子生物学技术检测水牛基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求1所述的7个SNP分子标记位点两侧翼的核苷酸序列分别设计扩增引物，以水牛个体DNA为模板扩增，将扩增产物进行一代测序，根据测序结果对水牛个体进行基因分型，从而鉴定待测水牛个体的基因型。
8.权利要求7所述的方法在水牛分子标记辅助育种中的应用。
9.一种应用权利要求1所述的SNP分子标记选育/辅助选育与水牛初产月龄性状相关的水牛品种或品系的方法，其特征在于，所述方法是：
提取水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第71082002位点的脱氧核苷酸，测出第71082002位点的脱氧核苷酸为C或G，确定待测水牛的基因型是CC型、CG或GG型，据育种需求，选择CC型、CG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于CG或GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第96791388位点的脱氧核苷酸，测出第96791388位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型、GA型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测7号染色体的第59963243位点的脱氧核苷酸，测出第59963243位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述CC型基因的水牛初产月龄远低于AA型；
提取水牛的基因组DNA，检测10号染色体的第13862680位点的脱氧核苷酸，测出第13862680位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测水牛的基因型是TT型、TC或CC型，据育种需求，选择TT型、TC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT或TC型基因的水牛初产月龄远低于CC型；
提取水牛的基因组DNA，检测12号染色体的第3176008位点的脱氧核苷酸，测出第3176008位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AG型基因的水牛初产月龄远低于GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测13号染色体的第86238940位点的脱氧核苷酸，测出第86238940位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的水牛初产月龄远低于AG或GG型；
提取水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第59367852位点的脱氧核苷酸，测出第593678520位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测水牛的基因型是AA型、AC或CC型，据育种需求，选择AA型、AC或CC型基因的水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型或AC型基因的水牛初产月龄远低于CC型。
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