CN114717330B - 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用，属于分子标记与遗传育种技术领域。本发明提供了一种与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第12号染色体上41926327bp位点处。本发明所述分子标记与绵羊单胎高产羔数性状显著相关，利用所述分子标记对初生绵羊PIK3CD基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。

Description

与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检 测方法和应用

技术领域

本发明涉及分子标记与遗传育种技术领域，具体涉及与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

我国是全球肉羊养殖和羊肉生产消费第一大国。我国全年羊肉消费占所有肉类消费的6.5％以上，排在肉类消费第4名。据2021年国家统计局数据，2020年底我国活羊存栏量3亿多只，其中绵羊1.73亿只，占比56.5％。绵羊产单羔极大的制约了肉羊产业的发展。因此，提高母羊的每胎产羔数是快速提升肉羊群体产肉量、提高生产经济效益的重要措施。应用基因组学方法能在整个基因组的水平去筛选出与绵羊产羔数性状相关的候选基因和分子标记，在群体中广泛推广应用，可对我国绵羊业的高质量发展带来巨大的经济效益。挖掘出与绵羊产羔数相关的分子标记对绵羊育种提供有效工具。

发明内容

本发明的目的在于提供与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。本发明所述分子标记与绵羊单胎高产羔数性状显著相关，利用所述分子标记对初生绵羊PIK3CD基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。

本发明提供了一种与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第12号染色体上41926327bp位点处。

优选的是，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记在SEQID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第100位存在G/A碱基突变。

本发明还提供了基于上述技术方案所述的分子标记的利用SequenomSNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQID NO.2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物和核苷酸序列如SEQID NO.4所示的延伸引物。

本发明还提供了一种利用SequenomSNP技术检测绵羊单胎产羔数的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述技术方案所述分子标记的试剂或上述技术方案所述的引物组。

优选的是，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。

本发明还提供了基于上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒的检测绵羊单胎产羔数的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；

3)以所述消化产物为模板，使用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

4)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊PIK3CD基因型。

优选的是，所述PCR反应的反应体系，每5μL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂溶液0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8μL；

所述PCR反应的反应程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min。

优选的是，所述延伸反应的反应体系，每2μL包括：10×iplex BufferPlus 0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；

所述延伸反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。

本发明还提供了检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂在单胎多羔绵羊新品种培育或绵羊群体繁殖力提升中应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在检测绵羊PIK3CD基因型中的应用。

本发明提供了与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记。本发明所述分子标记基于绵羊基因组序列信息(Oar_v3.1)，位为绵羊第12号染色体上第41926327bp位点，具有G/A碱基突变，与绵羊单胎高产羔数性状显著相关。利用所述分子标记对初生绵羊PIK3CD基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。本发明提供的检测所述绵羊SNP位点基因型的方法，灵敏度、准确性、稳定性好、性价比更高，可对所述SNP位点实现自动化检测。在绵羊生产过程中，可对AA型个体进行选留，从而提高绵羊群体的繁殖力。

附图说明

图1为本发明提供的通过扩增和延伸后，产物的飞行质谱检测图。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第12号染色体上41926327bp位点处。磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基Delta(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Delta,PIK3CD)是PI3K通路中上游分子PI3K催化亚基的亚型之一，所述SNP分子标记位于PIK3CD基因内，存在G/A碱基突变。

在本发明中，所述分子标记的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：CCCCGGGTTCTTGGACTTGAGCCAGTTGAGCAGAGCATCCTTATTGAAGGCGGCCGTGGCCGCCATGTTGCTCTTGTTCAGCTGGATGTTGGCAATGGTRTCCGAGTGAAGCACCACCTCAATAAGGCCTGTGCGGTCCCCAGTGGAGAGGCAGCCGTAGGGGGTCATCCTAGCCGGGTGGGAGGAGGGGCAGGCAGACA，R＝G/A，所述分子标记在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第100位存在G/A碱基突变。

本发明还提供了基于上述技术方案所述的分子标记的利用SequenomSNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQID NO.2所示的上游引物：ACGTTGGATGGCCATGTTGCTCTTGTTCAG、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物：ACGTTGGATGCCTTATTGAGGTGGTGCTTC和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物：ggtgcttcactcgga。

本发明还提供了一种利用SequenomSNP技术检测绵羊单胎产羔数的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述技术方案所述分子标记的试剂或上述技术方案所述的引物组。

在本发明中，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。本发明对所述阳性模板的制备方法没有特殊限定，采用已知基因型的DNA样品作为阳性模板即可。

本发明还提供了基于上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒的检测绵羊单胎产羔数的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；

3)以所述消化产物为模板，使用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

4)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊PIK3CD基因型。

在本发明中，所述PCR反应的反应体系，每5μL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂溶液0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8μL；

所述PCR反应的反应程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min。

在本发明中，所述延伸反应的反应体系，每2μL包括：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；

所述延伸反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。

本发明还提供了检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂在单胎多羔绵羊新品种培育或绵羊群体繁殖力提升中应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在检测绵羊PIK3CD基因型中的应用。

基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记，位于绵羊第12号染色体上第41926327bp位点上存在G/A碱基突变，其中G为突变前碱基，A为突变后碱基。当所述位点为A碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为G碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。由小尾寒羊三胎产羔数的统计数据表明，所述位点的突变纯合型(AA)产羔数极显著高于野生纯合型(GG)和杂合型(GA)(P<0.01)，这说明该位点的突变增加了小尾寒羊的产羔能力。因此，后续通过对所述SNP位点进行基因分型选择AA基因型个体即可筛选出携带多羔性状的绵羊，为绵羊单胎多羔品种的选育以及提高群体的繁殖性能提供可靠的工具。

本发明所述的引物组或所述试剂盒能够检测与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记。基于SequenomSNP技术检测绵羊所述SNP位点分子标记的基因型，具有灵敏度高、准确性号、性价比高的特点，可同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测，操作更加便捷，检测结果真实可靠。

本发明中所述应用可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种和实践生产过程中，可将AA纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

下面结合具体实施例对本发明所述的与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

一种利用SequenomSNP技术检测绵羊PIK3CD基因型并预测母羊每胎平均产羔数的方法

1、实验材料

以380只有产羔记录的小尾寒羊绵羊为检测对象。

2、试剂及仪器

试剂：10×PCR反应缓冲液，25mmol/LMgCl₂溶液，25μmol/L dNTPs，5U/μLTaqDNA聚合酶，正向引物F和反向引物R，10×iplex BufferPlus，iplex Terminator，1μmol/L延伸引物，iplex Enzyme，去离子水等；

基因扩增：ABI9700384 Dual；

质谱点样：MassARRAYNanodispenserRS1000；

质谱分析：MassARRAYCompact System；

所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(Beijing CompassBiotechnology Co,Ltd)。

3、基因组DNA的提取

取EDTA-K2抗凝剂处理的绵羊血液1mL，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞，然后用裂解液裂解其它细胞释放出基因组DNA，然后采用酚氯仿法提取基因组DNA。

4、利用SequenomSNP技术进行基因分型

针对绵羊第12号染色体上第41926327bp位点(PIK3CD，NC_019469.1：41,916,318-41,988,437)，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1(2012年08月)设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.2(F)：ACGTTGGATGGCCATGTTGCTCTTGTTCAG；

SEQ ID NO.3(R)：ACGTTGGATGCCTTATTGAGGTGGTGCTTC；

SEQ ID NO.4(E)：GGTGCTTCACTCGGA。

上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。

检测流程如下：

1、提取待测绵羊的基因组DNA；

2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述正向引物F和反向引物R进行PCR扩增反应；

3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物E进行延伸反应；

5、分析延伸产物，从而判定绵羊PIK3CD基因型。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系为(5μL)：10ng/μL基因组DNA1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs0.1μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水1.8μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min；4℃保存。

对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系为(2μL)：10×SAP Buffer 0.17μL，1.7U/μL SAP Enzyme 0.3μL，去离子水1.53μL；

反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。

延伸反应体系为(2μL)：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminator0.2μL，0.6-1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；

反应条件为：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔Spectro CHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为86bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：

待测绵羊第12号染色体上第41926327bp位点不同基因型分析统计结果及不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析如表1所示。

表1绵羊第12号染色体上第41926327bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

注：同一列肩标不同小写字母代表差异极显著(P＜0.01)。

由此可见，通过对本发明提供的位于绵羊第12号染色体上第41926327bp位点进行分型即可确定待测绵羊产羔性能；在实践过程中，可将AA纯合个体选留下来，可以显著提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种以及肉羊规模化生产具有潜在的应用价值。

由以上实施例可知，本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒应用，并具体提供了一种利用SequenomSNP技术检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，该方法具有灵敏度，准确性更高的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccccgggttc ttggacttga gccagttgag cagagcatcc ttattgaagg cggccgtggc 60

cgccatgttg ctcttgttca gctggatgtt ggcaatggtr tccgagtgaa gcaccacctc 120

aataaggcct gtgcggtccc cagtggagag gcagccgtag ggggtcatcc tagccgggtg 180

ggaggagggg caggcagaca 200

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg gccatgttgc tcttgttcag 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg ccttattgag gtggtgcttc 30

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgcttcac tcgga 15

Claims (4)

1.一种基于与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记的利用Sequenom MassARRAY^®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组的检测绵羊单胎产羔数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测绵羊的基因组DNA；

2）以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，利用引物组中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；

3）以所述消化产物为模板，使用引物组中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

4）利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊PIK3CD基因型；

所述引物组为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物；

基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第12号染色体上41926327bp位点处；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第100位存在G/A碱基突变；

其中G为突变前碱基，A为突变后碱基，当所述位点为A碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状，当所述位点为G碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系，每5µL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1µL，10×PCR反应缓冲液0.5µL，25mmol/L MgCl₂溶液0.4µL，25μmol/L dNTPs 0.1µL， 5U/μL Taq DNA聚合酶0.2µL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8µL；

所述PCR反应的反应程序为：95℃ 2min；95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 60s，40个循环；72℃ 5min。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述延伸反应的反应体系，每2µL包括：10×iplex Buffer Plus 0.2µL，iplex Terminator 0.2µL，0.6~1.3μmol/L 延伸引物0.94µL，iplex Enzyme 0.041µL，去离子水0.619µL；

所述延伸反应的反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，（52℃ 5s，80℃ 5s，5个循环），40个循环；72℃ 3min。

4.一种基于与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记的利用Sequenom MassARRAY^®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组在筛选高单胎产羔数绵羊品种中的应用；基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第12号染色体上41926327bp位点处；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第100位存在G/A碱基突变；

所述引物组为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物；

其中G为突变前碱基，A为突变后碱基，当所述位点为A碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状，当所述位点为G碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。