CN115948567A - 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，具体公开了与绵羊产羔数性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明的与绵羊产羔数性状相关的SNP分子标记，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第100位多态性为A/G的核苷酸序列。所述SNP分子标记具有第100位的多态性的位点的基因型为AA或GA，对应于绵羊产羔数多；基因型为GG，对应于绵羊产羔数少。本发明可依据GNAQ的基因型信息判断绵羊是否为多胎品种，为绵羊的大规模分子育种提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体地说，涉及与绵羊产羔数性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
母羊的产羔数是衡量绵羊繁殖力的重要指标,因此,提高绵羊的产羔数对发展养羊业十分重要。绵羊的产羔性状是微效多基因控制的数量性状,通过与数量性状位点相连锁的分子标记实现对基因型的直接选择,将传统选育方法和现代分子育种方法相结合运用于育种实践,将会极大地提高选择效率,进一步提高绵羊繁殖性能。策勒黑羊一般性成熟比其他绵羊早。公羊在四个月龄左右性成熟，母羊在四、五个月龄性成熟，发情周期一般在15-17天，发情持续期2-3天，怀孕期一般148-149天，1周岁后即可参加配种，产后发情时间为20-30天，平均产羔率为215％(祁成年et al.,2006)。
GNAQ基因位于绵羊2号染色体上，含有7个外显子，编码区共1080bp，编码359个氨基酸。GNAQ是组成G蛋白的一种α亚基，编码Gaq蛋白。Gilman在1987年第一次发现G蛋白，确定其在信号传递过程中起关键作用(Gilman,1987)。G蛋白的信号转导功能主要取决于α亚基，根据α亚基不同功能可将其分为Gs,Gq,Gi,和G12/134类。Gq包含了Gaq、Ga11、Ga14、Ga15等亚型(Strathmann&Simon,1990)。GNAQ基因是miR-200b的靶基因，miR-200b通过抑制GNAQ基因表达量，引起其下游基因ITPR、PRKCB和MAP3K1基因显著上调，发情相关基因GPR54、KISS1和GnRH显著上调。推测，miR-200b可能通过调控GNAQ基因进而影响发情过程(于要升et al.,2016)。然而，关于GNAQ基因与绵羊产羔数之间的关系还未见报道。
传统的基因型检测方法，大多采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)和PCR-SSCP(polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism)检测方法，这些方法步骤繁琐，不能批量检测，人工成本过高。因此，仍有待于对检测方法的改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种与绵羊产羔数相关的新的SNP分子标记及其应用。
本发明通过对54只策勒黑羊与26只和田羊进行简化基因组测序，使用Fst(前5％)值和π值(前5％和后5％)筛选SNP并获得一些基因，其中包括GNAQ基因，并进一步对其进行研究，挖掘出与棉羊产羔数相关的SNP位点。
第一方面，本发明提供的与绵羊产羔数性状相关的SNP分子标记，其含有如SEQ IDNO.1所示序列第100位多态性为A/G的核苷酸序列。
所述SNP分子标记具有第100位的多态性的位点的基因型为AA或GA，对应于绵羊产羔数多；基因型为GG，对应于绵羊产羔数少。
本发明提供的分子标记，其含有GNAQ基因上的一个SNP位点，该SNP位点为绵羊2号染色体上的第62677376bp位点(NC_040253.1，参考基因组版本：Oar rambouillet v1.0)，该SNP位点存在G/A突变，与棉羊多羔性状具有显著相关性。
第二方面，本发明提供用于扩增上述SNP分子标记的引物组合，其包括正向引物、反向引物和延伸引物，所述正向引物、反向引物和延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2-4所示。
本发明的引物组合是基于Sequenom MassARRAY技术开发获得的。
第三方面，本发明提供含有上述引物组合的试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供上述SNP分子标记或引物组合或试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定绵羊产羔数性状表型中的应用；
(2)在绵羊品种改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在绵羊产羔数性状早期预测中的应用；
(4)在筛选高产羔数绵羊中的应用。
第五方面，本发明提供一种绵羊产羔数性状早期预测的方法，其以待测绵羊基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示引物对进行PCR扩增反应；使用SAP酶消化PCR产物，以消化后的PCR产物作为模板，使用SEQ ID NO.4所示引物进行延伸反应；对延伸产物进行分析，确定SEQ ID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型；
若SEQ ID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型为AA或GA，则预测待测绵羊产羔数多；若SEQ ID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型为GG，则预测待测绵羊产羔数少。
所述PCR扩增反应的程序包括：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；每5ul所述PCR扩增反应的体系包括：基因组DNA 10ng,10×PCR反应缓冲液0.5ul，25mMMgCl2 0.3ul，25mM dNTPs 0.1ul,0.5μM PCR Primer mix 1ul,5U/μL Taq DNA聚合酶0.2ul，余量为去离子水。
每2ul SAP酶消化的体系包括：10×SAP Buffer 0.15ul，1.7U/ul SAP 0.26ul，余量为去离子水；SAP酶消化的反应程序为：37℃40min，85℃5min。
每2ul所述延伸反应的体系为：10×iPLEX buffer plus 0.17ul，IPLEXterminator 0.17ul，0.6-1.3uM Primer Mix 0.69ul，IPLEX enzyme 0.04ul，余量为去离子水；所述延伸反应的条件为：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环]，40个外部循环；72℃180s。
分析延伸产物的方法为质谱检测法。
本发明通过对绵羊2号染色体上的第62677376bp位点(NC_040253.1，参考基因组版本：Oar rambouillet v1.0)上的核苷酸使用Sequenom Mass
SNP技术进行检测，根据检测结果确定棉羊GNAQ的基因型。依据GNAQ的基因型信息判断棉羊是否为多胎品种。具体地，AA和GA基因型的棉羊平均产羔数较多，GG基因型产羔数较少。可筛选高产羔数的基因型AA和较高产羔数的基因型GA，将GG基因型淘汰，从而提高棉羊的平均产羔数，获得高繁殖力的绵羊。
优选，本发明中的绵羊为策勒黑羊。
本发明的有益效果至少在于：
本发明SNP分子标记可用于筛选产羔数量多的绵羊，有利于推动具有高繁殖力的绵羊品种的选育，提高育种效率，为绵羊的大规模分子育种提供理论依据。
本发明采用了Sequenom Mass
SNP技术来检测GNAQ基因的基因型，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。
附图说明
图1为本发明GNAQ基因延伸产物的质谱结果。横坐标为低分子量高度，纵坐标为高分子量高度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例对54只策勒黑羊与26只和田羊进行简化基因组测序，使用Fst(前5％)值和π值(前5％和后5％)筛选SNP并获得一些基因，其中包括GNAQ基因。然后在77只单胎和68只多胎的策勒黑羊中对GNAQ基因上位于绵羊2号染色体上的第62677376bp位点进行了分型并做了产羔数的关联分析(具体如下)。发现其与产羔数相关。
1.基因组DNA提取
采集77只单胎和68只多胎的策勒黑羊的血液样品，使用DNA提取试剂盒(DP318，北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。
2.使用Sequenom Mass
SNP技术对GNAQ基因进行基因分型。
参考绵羊2号染色体上的第62677376bp位点(NC_040253.1，参考基因组版本：Oarrambouillet v1.0)设计GNAQ基因引物。
PCR扩增引物：
F:ACGTTGGATGTCAGTGAGAGAGGGAATTTG(SEQ ID NO.2)；
R:ACGTTGGATGGGAATTTTGTGAAGAGGATGG(SEQ ID NO.3)；
延伸引物R：GTATTATTACCATTTGGATCCATA(SEQ ID NO.4)。
延伸引物长度：24。延伸产物：[AG]。SNP：[A/G]。
上述引物由北京康普森农业科技有限公司合成。
具体检测流程如下：
1.提取待检测策勒黑羊的基因组DNA。
2.使用引物F和R进行PCR扩增。
3.使用SAP酶消化PCR产物。
4.将消化后的PCR产物作为模板，使用延伸引物R进行延伸。
5.对延伸产物进行分析，判断策勒黑羊GNAQ基因的基因型。
其中，PCR扩增体系为基因组DNA 10ng,10×PCR反应缓冲液0.5ul，25mM MgCl20.3ul，25mM dNTPs 0.1ul,0.5μM PCR Primer mix 1ul,5U/μL Taq DNA聚合酶0.2ul，加入去离子水至5ul。PCR扩增程序为：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s，4℃保存。
SAP酶消化体系为：10×SAP Buffer 0.15ul，1.7U/ul SAP 0.26ul去离子水补齐至2ul。反应程序为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。
延伸反应的体系为：10×iPLEX buffer plus 0.17ul，IPLEX terminator0.17ul，1uM Primer Mix 0.69ul，IPLEX enzyme 0.04ul，补加去离子水至2ul。反应条件为：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环]，40个外部循环；72℃180s；4℃保存。
将反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐。
将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
上机进行质谱检测，并收集数据，判断每只策勒黑羊GNAQ基因的基因型。
经过质谱分析得到PCR产物大小为114bp。延伸产物的质谱检测结果见图1。
数据分析：
使用费希尔精确检验对绵羊2号染色体上的第62677376bp位点(NC_040253.1，参考基因组版本：Oar rambouillet v1.0)的不同基因型与策勒黑羊产羔数进行关联分析，结果见表1。
表1不同基因型与策勒黑羊产羔数关联分析
在绵羊2号染色体上的第62677376bp位点(NC_040253.1，参考基因组版本：Oarrambouillet v1.0)存在一个[G/A]类型SNP位点与策勒黑羊产羔数显著相关。挑选AA，GA基因型的策勒黑羊个体更有利于筛选具有多胎性状的策勒黑羊。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.与绵羊产羔数性状相关的SNP分子标记，其特征在于，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第100位多态性为A/G的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记具有第100位的多态性的位点的基因型为AA或GA，对应于绵羊产羔数多；基因型为GG，对应于绵羊产羔数少。
3.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物组合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和延伸引物，所述正向引物、反向引物和延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2-4所示。
4.含有权利要求3所述引物组合的试剂或试剂盒。
5.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定绵羊产羔数性状表型中的应用；
(2)在绵羊品种改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在绵羊产羔数性状早期预测中的应用；
(4)在筛选高产羔数绵羊中的应用。
6.一种绵羊产羔数性状早期预测的方法，其特征在于，以待测绵羊基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示引物对进行PCR扩增反应；使用SAP酶消化PCR产物，以消化后的PCR产物作为模板，使用SEQ ID NO.4所示引物进行延伸反应；对延伸产物进行分析，确定SEQID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型；
若SEQ ID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型为AA或GA，则预测待测绵羊产羔数多；若SEQ ID NO.1所示序列第100位的多态性位点的基因型为GG，则预测待测绵羊产羔数少。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序包括：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；每5ul所述PCR扩增反应的体系包括：基因组DNA10ng,10×PCR反应缓冲液0.5ul，25mM MgCl2 0.3ul，25mM dNTPs 0.1ul,0.5μM PCRPrimer mix 1ul,5U/μL Taq DNA聚合酶0.2ul，余量为去离子水。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，每2ul SAP酶消化的体系包括：10×SAPBuffer 0.15ul，1.7U/ul SAP 0.26ul，余量为去离子水；SAP酶消化的反应程序为：37℃40min，85℃5min。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，每2ul所述延伸反应的体系为：10×iPLEX buffer plus 0.17ul，IPLEX terminator0.17ul，0.6-1.3uM Primer Mix0.69ul，IPLEX enzyme 0.04ul，余量为去离子水；所述延伸反应的条件为：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环]，40个外部循环；72℃180s。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，分析延伸产物的方法为质谱检测法。
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