CN110643717B

CN110643717B - 一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法

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Publication number: CN110643717B
Application number: CN201911032013.6A
Authority: CN
Inventors: 张慧; 于家强; 李辉; 杨莉莉; 曹志平; 栾鹏; 李玉茂
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110643717A

Abstract

本发明公开了一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，属于分子标记方法技术领域。为了解决无法从表型上对公鸡心脏生长发育进行判断，本发明提供了一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，具体方案是根据鸡TCF21基因SNP位点g.‑894C>T上下游332bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，获得公鸡心脏生长发育标记基因型。本发明所提供的方法具有操作简单、费用低、精确度高的特点，可进行自动化检测，是一种有效的分子标记育种手段，可大幅度加快鸡的育种进程。

Description

一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法

技术领域

本发明涉及一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，属于分子标记方法技术领域。

背景技术

动物的心脏功能与生长性状密切相关，在动物育种工作中，心脏生长发育是生长发育要的指标。有文献报道，肉鸡的生长速度与生理适应性状呈负相关，所以应用传统的表型选择同时提高生长速度和改善肉鸡生理适应性状是困难的，通过分子标记辅助选择可以为解决这一矛盾提供新思路。肉鸡心脏生长发育属于数量性状，而数量性状不仅受许多微效基因调控，而且还有可能受到一个或几个主效基因控制，所以将分子遗传标记育种与传统表型选择相结合能极大提高育种效率，加快育种进展。近年来，随着分子遗传学的迅猛发展，遗传标记逐渐被应用于畜禽的标记辅助选择，此项技术可大大提高育种效率、缩短世代间隔，因此开展与肉鸡生长发育要经济性状相关基因多态性的研究具有现实意义。

目前为止，尚未发现有以TCF21基因g.-894C>T位点基因型作为分子标记对公鸡心脏生长发育进行选择的报道。

发明内容

为了解决无法从表型上对公鸡心脏生长发育情况进行判断，本发明提供了一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，所采取的技术方案如下：

1)根据鸡TCF21基因SNP位点g.-894C>T上下游332bp序列设计引物TCF21-F和TCF21-R，获得扩增引物；

2)提取鸡的基因组DNA；

3)利用步骤1)所得的扩增引物以步骤2)提取的DNA为模板，进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；

4)利用限制性内切酶RsaI对步骤3)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

5)利用琼脂糖凝胶对步骤4)所得的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，比较各基因型对应的公鸡心脏性状，确定公鸡心脏生长发育标记基因型，即完成预示和鉴定公鸡心脏生长发育；

步骤1)中所述引物TCF21-F序列如SEQ ID No：1所示；所述引物TCF21-R如SEQ IDNo：2所示；

步骤5)中所述基因型判定标准：①电泳呈现一条带，大小为332bp，则鸡TCF21基因位点g.-894C>T为C碱基，将其命名为CC基因型；②电泳呈现两条带，大小为106bp和226bp，则鸡TCF21基因位点g.-894C>T为T碱基，将其命名为TT基因型；③电泳呈现三条带，大小分别为332bp、106bp和226bp，则该位点处于杂合状态，将其命名为CT基因型；所述公鸡心脏性状是指心脏重和心脏比率，所述公鸡心脏生长发育的标记基因型为CC。

优选的，步骤3)所述的PCR扩增，是25μl反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃30sec，61.8℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤4)所述的酶切，是10μl反应体系，由下列成分组成：3～5U的内切酶，1μl的Buffer，0.3～0.5μg的PCR产物，添加去离子水至10μl；37℃反应3小时。

有益效果

本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的分子标记方法对公鸡心脏生长发育进行判断，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的心脏生长发育的改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。

附图说明

图1为TCF21基因SNP位点g.-894C>T分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

1.本发明涉及的药品和酶如下：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000，大连宝生物公司；dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶、DNAMarker，北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BpuEI，北京NEB公司；琼脂糖(Agarose)，原平皓公司。

2.缓冲液与常用试剂的配制如下：

1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

TE缓冲液：10mM Tris·Cl,1mM EDTA,pH8.0,高压灭菌。

20×SET缓冲液：3MNaCl,1M Tris·Cl(pH 8.0),20mM EDTA(pH 8.0),高压灭菌。

50×TAE缓冲液：242g Tris碱，57.1ml冰乙酸,100ml 0.5MEDTA(pH8.0),加水至1L。

0.5M EDTA：186.1g EDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

禽血裂解液：10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0),0.5％SDS。

实施例1.预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法。

本实施例所述的预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法包括如下步骤：

2)提取鸡的基因组DNA；

5)利用琼脂糖凝胶对步骤4)所得的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，比较各基因型对应的公鸡心脏重和心脏比率，确定公鸡心脏生长发育标记基因型，即完成预示和鉴定公鸡心脏生长发育；

步骤1)中引物设计方法如下：

根据鸡TCF21基因SNP位点g.-894C>T上下游332bp，所述序列如SEQ ID：3所示，设计引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：

TCF21-F:5’-GGAGCCCTCTCTTCCCCTCTTCTT-3’

TCF21-R:5’-CGTGCTGTCTAAACGCTGTCCTGTA-3’

步骤2)中提取鸡的基因组DNA可以采用以下两种方法：

方法一：

(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。

(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。

(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。

(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。

(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。

方法二：

(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。

(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。

(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀

(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。生长发育复第三和第四步骤一次。

(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24：23：1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23：1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。

(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。

(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。

上述方法中的鸡血来自于东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第二十一世代共675只个体。对高、低脂系肉鸡7周龄时翅静脉采血，EDTA-Na₂抗凝。

第二十一世代高脂鸡是第十九世代肉鸡高脂系经过系内繁殖两代后获得的，第二十一世代低脂鸡是第十九世代肉鸡低脂系经过系内繁殖两代后获得的，第十九世代高、低对高、低脂系肉鸡的详细信息记载在Genet Sel Evol.2017 Feb 24；49(1):25.doi:10.1186/s12711-017-0299-0.TCF21 is related to testis growth and developmentin broiler chickens.Zhang H,Na W,Zhang HL,Wang N ZQ,Wang SZ,Wang ZP,Zhang Z,Li H.

步骤3)中鸡DNA的扩增体系反应条件如下：

PCR反应

(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂：

(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。

94℃变性5min；94℃30sec，61.8℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。

(3)反应结束后，取PCR反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

步骤4)中酶切鉴定体系及反应条件如下：

3～5U的内切酶RsaI，1μl的Buffer，0.3～0.5μg的PCR产物，去离子水添加至10μl；37℃反应3小时。

步骤5)中利用3％琼脂糖凝胶检测酶切结果并进行基因判定，电泳结果有以下三种情况，如图1所示。

①电泳呈现一条带，大小为332bp，则鸡TCF21基因位点g.-894C>T为C碱基，将其命名为CC基因型；

②电泳呈现两条带，大小为106bp和226bp，则鸡TCF21基因位点g.-894C>T为T碱基，将其命名为TT基因型；

③电泳呈现三条带，大小分别为332bp、106bp和226bp，则该位点处于杂合状态，将其命名为CT基因型；

对所有鸡只电泳结果进行统计，结果显示，TCF21基因SNP位点g.-894C>T的等位基因在高、低脂系间的分布存在极显著差异(P<0.01)(表1)。

表1 SNP位点g.-894C>T在高、低脂系第二十一世代群体中等位基因频率

选择CC基因型的公鸡，组成心脏重和心脏比率大的公鸡群体，即作为心脏生长发育能力强的公鸡群体，用于后续育种。

为了验证本实施例所用分子标记方法用于预示和鉴定公鸡心脏生长发育的可靠性，进行如下实验：

对东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第二十一世代共675只个体，7周龄屠宰前测定活重，屠宰后测定心脏重，并除以7周龄活生长发育计算出心脏比率。

根据群体的特点，构建如下线性模型：

Y＝μ+G+F+D(F)+BW7+e

模型用于在东北农业大学高、低脂系肉鸡双向品系第二十一世代群体中分析位点多态性与心脏重、心脏比率的相关性，Y为性状观察值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，F为公鸡家系的随机效应，D(F)为公鸡家系内与配母鸡的随机效应，BW7作为协变量，e为剩余值，然后利用JMP7.0统计软件将基因型效应与性状进行相关分析，并估计性状的最小二乘均值。P<0.05为显著相关，P<0.01为极显著相关。

从心脏重和心脏比率的表型数据来看，低脂系个体的心脏重和心脏比率极显著高于高脂系个体(表2)，低脂系个体的心脏生长发育优于高脂系个体。

表2肉鸡高、低脂系第二十一世代群体的心脏重和心脏比率表型数据

以肉鸡高、低脂双向选择品系第二十一世代群体为材料，分析位点g.-894C>T多态性与肉鸡心脏重和心脏比率的相关性，结果显示，位点g.-894C>T多态性对心脏重和心脏比率的影响达到显著水平(P<0.05)(表3)。

表3位点g.-894C>T与肉鸡心脏重和心脏比率的相关性(P值)

注：*表示显著相关(P<0.05)

对在高、低脂系二十一世代中，与鸡心脏重和心脏比率显著相关的SNP位点进行不同基因型个体间最小二乘均值的多重比较，结果发现，g.-894C>T位点的CC基因型个体的心脏重、心脏比率显著高于CT、TT基因型个体(表4)。

表4 TCF21基因g.-894C>T位点不同基因型个体间心脏重、心脏比率的比较分析

注：同一行不同字母表示差异显著。

以上结果表明，TCF21基因SNP位点g.-894C>T可作为公鸡心脏生长发育的候选基因，TCF21基因SNP位点g.-894C>T的CC基因型可以用于预示和鉴定公鸡心脏生长发育，可以组建CC基因型个体为主的公鸡种群进行选种，从而提高肉鸡的心脏功能。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> g.-894C>T 位点上游引物TCF21-F

<400> 1

ggagccctct cttcccctct tctt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> g.-894C>T 位点下游引物TCF21-R

<400> 2

cgtgctgtct aaacgctgtc ctgta 25

<210> 3

<211> 332

<212> DNA

<213> 多态性分析位点序列

<400> 3

ggagccctct cttcccctct tcttcagcac ccatagcccc actggcccca gcagtggcgt 60

ggtgcccggc ctggctctgc aggattcagg atctccaaca cccagtacgc tgggggagtt 120

tggatgaaga gaaaggactg ggatgccctg gaagtccagt gggaagcctg gaaaaaggca 180

gctccttctg cctccagagc tcaggctgca atagcgaggt ccaagtgctc ccttcctgga 240

acacactagt agctggacag gatgcactct ccagtataat catccacaaa tctccctcag 300

attaggttac aggacagcgt ttagacagca cg 332

Claims

1.一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，其特征在于，步骤如下：

1）根据SEQ ID NO.3所示的序列设计引物TCF21-F和TCF21-R，获得扩增引物；

2）提取鸡的基因组DNA；

3）利用步骤1）所得的扩增引物以步骤2）提取的DNA为模板，进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；

4）利用限制性内切酶RsaI对步骤3）所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

5）利用琼脂糖凝胶对步骤4）所得的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，比较各基因型对应的公鸡心脏性状，确定公鸡心脏生长发育的标记基因型，即完成预示和鉴定公鸡心脏生长发育；

步骤1）中所述引物TCF21-F序列如SEQ ID No：1所示；所述引物TCF21-R如SEQ ID No：2所示；

步骤5）中所述基因型判定标准：①电泳呈现一条带，大小为332bp，则SEQ ID NO.3所示的序列的106位是C碱基，将其命名为CC基因型；②电泳呈现两条带，大小为106bp和226bp，则SEQ ID NO.3所示的序列的106位为T碱基，将其命名为TT基因型；③电泳呈现三条带，大小分别为332bp、106bp和226bp，则该位点处于杂合状态，将其命名为CT基因型；所述公鸡心脏性状是指心脏重和心脏比率，所述公鸡心脏生长发育的标记基因型为CC。

2. 根据权利要求1所述的一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，其特征在于，步骤3）所述的PCR扩增，是25μl反应体系，由下列成分组成：

10×PCR reactionbuffer 2.5μl

2.5mM dNTPMixture 2.0μl

10μM引物TCF21-F 0.5μl

10μM引物TCF21-R 0.5μl

5U/μlEX-Taq 0.25μl

去离子水 18.25μl

50ng/μl的基因组DNA 1.0μl

PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃30sec，61.8℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；72℃延伸10min。

3. 根据权利要求1或2所述的一种预示和鉴定公鸡心脏生长发育的分子标记方法，其特征在于，步骤4）所述的酶切，是10μl反应体系，由下列成分组成：3~5U的内切酶，1μl 的Buffer，0.3~0.5μg的PCR 产物，添加去离子水至10μl；37℃反应3小时。