CN105256045B - 一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引物对 - Google Patents

一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引物对。本发明提供的鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法是检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G，以确定待测猪的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型。通过试验证明：本发明的方法操作简单、费用低、准确度高，并可实现自动化的直接检测对猪进行育种，不仅可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，而且降低了育种花费，能有效降低或提高实际生产中的猪的pH值，在猪的育种工作中将发挥巨大作用。

Description

一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引 物对
技术领域
本发明涉及一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引物对，属于生物技术领域。
背景技术
猪肉pH值的大小不仅对猪肉的口感有重要影响，还与猪肉失水率，肉色等显著相关，极大地影响着猪肉的销售。猪宰后24小时背最长肌的pH值是反映猪肉pH值的标准指标之一，是猪肉品质育种的育种目标的重要组成部分。但是，由于pH值只能在动物长成之后才能测定，一方面加大了育种成本，另一方面拉长了世代间隔，遗传进展缓慢。分子生物技术的飞速发展和猪遗传连锁图谱的构建，为pH值等数量性状开展育种更准确、进展更快速的分子育种提供了研究基础。且由于猪是人类研究的一种重要的模式动物，找到对猪肉pH值有影响的基因有可能对人类的研究提供一定的借鉴意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的方法包括如下步骤：检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G，以确定待测猪的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述猪个体的基因型确定所述猪宰后24小时背最长肌的pH值大小：GG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AG基因型的猪个体，AG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AA基因型的猪个体；
所述GG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述AG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为A和G的杂合体；
所述AA基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；
所述MAP2K4基因如序列表中序列3所示。
上述方法中，所述检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G为如下1)或2)：
1)直接测序；
2)用能够扩增含有猪MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸的引物对扩增所述待测猪的基因组DNA，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基均为A，则所述猪的基因型为AA基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基为A和G，则所述猪的基因型为AG基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基均为G，则所述猪的基因型为GG基因型。
上述方法中，所述B)包括如下步骤：所述引物对满足如下条件：以所述猪个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有MAP2K4基因的第118位氧核糖核苷酸；
所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂是检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质；
所述MAP2K4基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
上述试剂中，所述物质为由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂盒。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂盒包括上述试剂。
上述试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小中的应用也属于本发明的保护范围。
上述试剂或上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法或上述试剂或上述试剂盒在猪育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法或上述试剂或上述试剂盒在选育宰后24小时背最长肌的pH值大的种猪中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种选育宰后24小时背最长肌的pH值大的猪的方法。
本发明提供的选育宰后24小时背最长肌的pH值大的猪的方法包括选择GG基因型的猪进行育种；
所述GG基因型为MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸均为G的纯合体；
所述MAP2K4基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
上述方法或上述试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸也为国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629位脱氧核糖核苷酸。
本发明提供了一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法。该方法是检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G，以确定待测猪的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型。只需进行PCR反应，测序即可判别个体的基因型。通过试验证明：本发明的方法操作简单、费用低、准确度高，并可实现自动化的直接检测对猪进行育种，不仅可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，而且降低了育种花费，能有效降低或提高实际生产中的猪的pH值，在猪的育种工作中将发挥巨大作用。
附图说明
图1为AA基因型个体和GG基因型个体MAP2K4基因g.59380629A>G多态性位点附近序列的测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大民杂交猪(Sus scrofa)，由大白猪和民猪杂交获得，该猪购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽实验基地。
实施例1、猪宰后24小时背最长肌pH值大小的鉴定方法及应用
一、猪MAP2K4基因g.59380629A>G多态性位点的确定
(一)以两头大民杂交猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。
(二)引物的设计与合成
根据猪MAP2K4基因内的国际猪基因组10.2版本参考序列信息，设计并合成如下引物：
U(上游引物)：5’-GCTGCTTTGCTGTTTGACTA-3’(SEQ ID No.1)；
D(下游引物)：5’-CAGTTTCTAAGCCCAACATTCT-3’(SEQ ID No.2)。
(三)PCR扩增
分别以步骤(一)得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。
PCR扩增体系：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs终浓度为10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补足体系至50μl。
PCR扩增程序：95℃变性5min；然后95℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
(四)测序及序列分析
将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列(如SEQ ID No.3所示)和产物2的序列(如SEQ ID No.4所示)。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4只存在一个碱基的差异，均为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4中自5’末端起第118位，该处的碱基为A或G，该位点附近的序列如图1所示(其中箭头所示为该多态性位点)，该位点位于GenBank AAAession Number为NC_010454.3的自5′末端起第13739位，因此将该位点命名为g.59380629A>G。
在国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629个核苷酸位点的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)均为A的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合AA基因型，国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629个核苷酸位点的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)均为G的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合GG基因型，国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629个核苷酸位点的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)为A和G的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合AG基因型。
二、猪MAP2K4基因g.59380629A>G多态性位点与猪宰后24小时背最长肌pH值性状的相关性分析
为确定g.59380629A>G多态性位点与猪宰后24小时背最长肌pH值性状是否相关，以591头大民杂交猪为实验材料，进行如下试验：
(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中(三)的方法进行PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是纯合AA基因型、杂合AG基因型还是纯合GG基因型。
(二)测定并记录每头猪的pH值大小。
(三)根据猪的基因型以及猪pH值大小得到如下结论：纯合GG基因型的猪宰后24小时背最长肌pH值大于杂合AG基因型的猪个体，杂合AG基因型的猪宰后24小时背最长肌pH值大于纯合AA基因型的猪个体。
(四)对g.59380629A>G位点与猪宰后24小时背最长肌pH值性状以最小二乘法开展关联分析。所用模型如下：Y＝S+P+B+G+e。其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为胎次效应，B为屠宰批次效应，G为基因型效应，e为残差效应。
结果如表1所示：从表1可以看出，在猪宰后24小时背最长肌pH值性状中，纯合GG基因型的猪宰后24小时背最长肌pH值大于杂合AG基因型的猪个体，杂合AG基因型的猪宰后24小时背最长肌pH值大于纯合AA基因型的猪个体，纯合GG基因型的猪宰后24小时背最长肌pH值比纯合AA基因型的猪个体高约0.29(P<0.05)。说明本发明用MAP2K4基因国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629位核苷酸(序列表中序列3所示的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核酸)的多态性鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值的方法与猪宰后24小时背最长肌pH值的实际测定结果一致。
在实际的猪育种中，为获得更高pH值性状的猪，最好选择GG基因型的猪进行育种。
表1、猪的基因型与猪pH值的相关性分析
注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)
综合所述，可以按照如下方法鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小：
检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G，以确定待测猪的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据猪个体的基因型确定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小：GG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AG基因型的猪个体，AG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AA基因型的猪个体；
GG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸均为G的纯合体；
AG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为A和G的杂合体；
AA基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸均为A的纯合体；
MAP2K4基因如序列表中序列3所示。

Claims (9)

1.一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的方法，包括如下步骤：检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G，以确定待测猪的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述猪个体的基因型确定所述猪宰后24小时背最长肌的pH值大小：GG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AG基因型的猪个体，AG基因型的猪宰后24小时背最长肌的pH值大于AA基因型的猪个体；
所述GG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述AG基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为A和G的杂合体；
所述AA基因型为MAP2K4基因自5’末端第118位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；
所述MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸为国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629位脱氧核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G为如下1)或2)：
1)直接测序；
2)用能够扩增含有猪MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸的引物对扩增所述待测猪的基因组DNA，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基均为A，则所述猪的基因型为AA基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基为A和G，则所述猪的基因型为AG基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基均为G，则所述猪的基因型为GG基因型；
所述2)包括如下步骤：所述引物对满足如下条件：以所述猪个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有MAP2K4基因的第118位氧核糖核苷酸；
所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
3.一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂，是检测待测猪的MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质；
所述物质为由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对；
所述MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸为国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629位脱氧核糖核苷酸。
4.一种鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的试剂盒，包括权利要求3所述的试剂。
5.权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小中的应用。
6.权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定猪宰后24小时背最长肌的pH值大小的产品中的应用。
7.权利要求1或2所述的方法或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在猪育种中的应用。
8.权利要求1或2所述的方法或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在选育宰后24小时背最长肌的pH值大的种猪中的应用。
9.一种选育宰后24小时背最长肌的pH值大的猪的方法，包括选择GG基因型的猪进行育种；
所述GG基因型为MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸均为G的纯合体；
所述MAP2K4基因的第118位脱氧核糖核苷酸为国际猪基因组10.2版本参考序列12号染色体上第59380629位脱氧核糖核苷酸。
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