CN101974636A - 通过map2k4基因检测肺癌易感性的试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒及其用途，1)该试剂盒的物质包括：检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；2)检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列包括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；3)特异性引物，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。本发明通过检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点来检测肺癌易感性，可广泛应用于医疗研究。
Description
技术领域
本发明涉及疾病易感性检测用的试剂盒及其用途，尤其是一种通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒及其用途，通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MAP2K4)的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测肺癌的易感性。属于医疗研究领域。
背景技术
原发性支气管肺癌，简称肺癌，是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。由于肺癌常伴早期转移，70％的肺癌病人发现时已是晚期，其5年生存率目前的平均水平只有16％，其病情发展速度与肺癌细胞的生物特性有关。肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病。2009年美国报告新发肺癌219440例，死亡159390例(死亡率53.80/10万)。广州死亡登记的数据标明：1970～1972年肺癌死亡率为11.61/10万，1980～1982年升为32.67/10万，而2000～2002年更上升至48.79/10万。上海及天津死亡登记的数据也都显示肺癌的死亡率在数十年间急剧上升。
肺癌病因和发病机制尚未完全明确。目前一致认为吸烟、空气污染、放射线、肺结核及镍化合物等职业危害是肺癌的危险因素。这些危险因素对细胞而言都是刺激信息，可激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传导通路。MAPK信号通路进一步调控细胞凋亡、炎症反应及细胞增殖等过程，导致肿瘤发生。近年来研究显示很多MAPK基因在各种类型肺癌中均有基因表达的改变，而在非小细胞肺癌中发现了很多MAPK基因的突变。对MAPK基因深入的研究将为肺癌的基因预防和治疗提供理论基础。
SNP(Single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性，是人类基因组作图的第三代遗传标记，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记，已成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关的一种工具。1996年成功研制了SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发检测疾病易感性的试剂盒。
MAP2K4基因位于第17号染色体17p11.2位置，全长＞120kb，mRNA全长3826bp，共11个外显子，编码399个氨基酸的蛋白质。MAP2K4基因编码蛋白是MAPK信号通路中的关键调节分子，它能激活JNK和p38信号通路，进而调节细胞凋亡、炎症反应及细胞增殖等过程。大量的研究显示，肿瘤发生过程中常见MAP2K4基因的失活：肺癌细胞系和胰腺癌细胞系可见MAP2K4基因编码区的纯和性缺失，而在大约5％的人各种肿瘤组织中可检测出导致MAP2K4基因功能丧失的突变。并且MAP2K4基因的低表达与是胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后相关。
rs3826392是位于第17号染色体MAP2K4基因启动子区域的一个T＞G多态。其在世界人群的频率分布，T占0.62，G占0.38左右。中国人群的分布T占0.45，G占0.25左右。分子生物学研究表明，T＞G的替代可增加MAP2K4基因启动子与核蛋白的结合，增加MAP2K4基因的表达。通过大规模人群的肺癌病例对照研究，MAP2K4基因启动子区域的T＞G多态与肺癌发生相关，并且呈基因剂量-反应关系。即使在调整年龄、性别、吸烟、肿瘤家族史等多种混杂因素后，这种相关性仍然存在。发明人的研究还显示rs3826392与散发性肠癌及鼻咽癌的发生相关，均表现为rs3826392基因型为G时肿瘤发生率降低。这个SNP的多态可用于评估个体肺癌的易感性。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了提供一种通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒，主要是通过MAP2K4基因上的rs3826392位点检测肺癌易感性的试剂盒。
本发明的第二个目的，是为了提供一种通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒的用途，主要是通过MAP2K4基因上的rs3826392位点检测肺癌易感性的试剂盒的用途。
本发明的第一个目的可以通过以下技术方案实现：
通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于：
1)该试剂盒的物质包括：检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
2)所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列包括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；
3)所述的特异性引物，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。
本发明的第一个目的还可以通过以下技术方案实现：
实现本发明第一目的的一种实施方案是：试剂盒中供一人份使用的各成分的含量为：
1)10μM特异性引物对两条各0.225μl，5μM特异性荧光探针对两条各0.1μl；
2)5unit/μlTaq DNA聚合酶0.02μl；
3)20mM dNTP混合液0.1μl；
4)25mM MgCl2溶液0.5μl；
5)5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；
6)去离子水4.1μl。
实现本发明第一目的的一种实施方案是：所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列如序列表SEQ ID №：1所示，有义引物序列的Tm值为60℃，反义引物序列的Tm值为58℃；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ ID №：2所示，野生型探针序列的Tm值为66℃，突变型探针序列的Tm值为67℃。
实现本发明第一目的的一种实施方案是：试剂盒的保存温度为-20℃。
本发明的第二个目的可以通过以下技术方案实现：
种通过MAP2K4基因上的rs3826392位点检测肺癌易感性的试剂盒的用途，其特征是：用于检测DNA的MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的基因型。
本发明具有如下突出的有益效果：
由于本发明所述的特异性引物对是针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对；所述的特异性荧光探针是针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA探针对；因此，用于检测DNA的MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的基因型，既适用于检测个体肺癌的易感性，也适用于对胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究，
具体实施方式
具体实施例1：
本实施例包括：
1)该试剂盒的物质包括：检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
2)所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列如序列表SEQ ID №：1所示，有义引物序列的Tm值为60℃，反义引物序列的Tm值为58℃；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ ID №：2所示，野生型探针序列的Tm值为66℃，突变型探针序列的Tm值为67℃；
3)所述的特异性引物，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。
本实施例中，试剂盒供一人份使用的各物质的含量为：10μM特异性引物对两条各0.225μl，5μM特异性荧光探针两条各0.1μl；(5unit/μl)Taq DNA聚合酶0.02μl；20mM dNTP混合液0.1μl；25mM MgCl2溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.1μl。
本实施所述试剂盒的保存温度为-20℃。
本试剂盒所述的特异性引物是针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对。设计这类引物是本领域技术人员能轻易完成的。优选地，本试剂盒包括具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。特异引物对可用常规的合成技术合成。本领域技术人员能理解，本发明的引物不限于这对引物。
本试剂盒所述的特异性荧光探针是针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点而设计，能特异性检测rs3826392这个肺癌一个基因型的DNA探针对。设计这类探针是本领域技术人员能轻易完成的。优选地，本试剂盒包括具有SEQ ID NO：3和4所示序列的荧光探针对。特异荧光引物对可用常规的合成技术合成。本领域技术人员能理解，本发明的引物不限于这对荧光探针。所有可用于荧光定量PCR检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的探针均在本发明范围内。
本实施例的使用方法如下：
步骤1：DNA模板的提取
用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA；
步骤2：荧光定量PCR反应
使用本发明的荧光定量PCR检测试剂盒，其中包括下列引物对和荧光探针，均针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点：
有义引物1：5’-CATTAAAGGCAAATTGAAGGTGAGA-3’(SEQ ID NO：1)Tm值为60℃
反义引物1：5’-GCCCATGGAGGAGAATTCTG-3’(SEQ ID NO：2)Tm值为58℃
野生型探针：5’-AGGTAGGTGTACTTAAG-3’(SEQ ID NO：3)Tm值为66℃
突变型探针：5’-AGGTAGGTGTACTTCAG-3’(SEQ ID NO：4)Tm值为67℃
荧光定量PCR反应体系总体积为10μl，包括DNA模板(20ng/μl)2μl、10μM特异性引物对(两条)各0.225μl、5μM特异性引物对(两条)各0.1μl、(5unit/μl)Taq DNA聚合酶0.02μl、20mM dNTP混合液0.1μl、25mM MgCl2溶液0.5μl、5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl、去离子水4.1μl。
步骤3：基因型分析
在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪是进行反应，反应条件为50℃ 2min，95℃ 10min，再进行40～55个PCR循环：92℃ 15s，60℃ 1min。反应结束后在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪读取荧光量。
步骤3：基因型分析及确定基因型
采用ABI 7900HT型荧光定量PCR仪自带软件SDS(Sequence Detection Systems)V2.3判读基因型，自动分析结果。被检测DNA的MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点携带有T时，为肺癌易感型。
本发明的应用实施例：
指导人们主动预防肺癌
步骤1：DNA的提取
对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷表。常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。
步骤3：指导人们主动预防肺癌
通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的高低以及患病概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测这肺癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防肺癌的健康知识。
Claims (5)
1.通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于：
1)该试剂盒的物质包括：检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
2)所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列包括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；
3)所述的特异性引物，能特异性扩增出包含针对MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。
2.根据权利要求1所述的通过MAP2K4基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒，其特征在于试剂盒中供一人份使用的各成分的含量为：
1)10μM特异性引物对有义引物序列和反义引物序列各0.225μl，5μM特异性荧光探针对野生型探针序列和突变型探针序列各0.1μl；
2)5unit/μl Taq DNA聚合酶0.02μl；
3)20mM dNTP混合液0.1μl；
4)25mM MgCl2溶液0.5μl；
5)5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；
6)去离子水4.1μl。
3.根据权利要求1所述的通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于：所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性引物对的序列如序列表SEQID №：1所示，有义引物序列的Tm值为60℃，反义引物序列的Tm值为58℃；所述检测MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ ID №：2所示，野生型探针序列的Tm值为66℃，突变型探针序列的Tm值为67℃。
4.根据权利要求1所述的通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于：试剂盒的保存温度为-20℃。
5.通过MAP2K4基因检测肺癌易感性的试剂盒的用途，其物征在于：用于检测DNA的MAP2K4基因上的rs3826392号SNP位点的基因型。
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