CN107267611A - 一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测AHRR基因p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用。所述引物组包括一对特异性引物及两条野生型和突变型荧光探针，其序列依次如SEQ ID NO：1～4所示；所述检测方法具体为：S1.提取待测样本DNA；S2.以步骤S1所述DNA为模板，用上述引物进行荧光定量PCR检测，确定p.Pro189Ala位点的基因型；通过该位点的基因型可进行肺癌易感性评估，若p.Pro189Ala位点编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感型。本发明设计的p.Pro189Ala位点检测引物特异性强，扩增效率高；采用的检测方法简便、高效，且实现了判断结果的自动性，在疾病预防检测中具有较大的应用前景。

Description

一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒 和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用。
背景技术
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居各种肿瘤之首，严重威胁居民健康和生命安全。最新的研究数据表明，全球范围内每年肺癌新发病例约180万；而在我国，2015年新发肺癌患者达73.3万例。由于肺癌常伴早期转移，70％的肺癌病人发现时已是晚期，其5年生存率的平均水平低于20％。研究表明，肺癌是多因素、多基因疾病，是环境与遗传因素共同作用的结果。随着分子生物学的发展，目前已发现了大量的肺癌易感基因，但是其生物学机制仍未阐明。肺癌的早期诊断和预防仍未得到很好的解决。因此，寻找肺癌早期发病、诊断和治疗的特异性生物标志物，促进肺癌的科学防治，显得尤为重要。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。SNP是基因组最广泛存在的一类多态性标记，它以高密度以及二态性所适宜的快速、大规模的筛查和易于分型的特点决定了它比其他多态性标志更适合对复杂性疾病的研究。证据表明，SNP作为第三代遗传标记，对疾病、毒物的易感性和耐受性、疾病临床表型的多样性，以及对药物治疗的反应性都有着重要的影响。目前常规用于疾病易感基因变异的主要检测方法包括PCR-限制性片段长度多态性法(RFLP)和实时荧光定量PCR法。RFLP法的原理是当突变影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，可通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有突变。但这种方法存在耗时长、操作繁琐等缺点。而应用于SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发快速检测疾病易感性的试剂盒。
吸烟是肺癌发病的主要环境危险因素。烟草暴露含有的致癌物质多环芳香烃可与体内的芳香烃受体(aryl-hydrocarbon receptor，AHR)结合并且激活机体内AHRR信号通路，参与多种致畸、致癌、致突变等反应。芳香烃受体抑制因子(aryl-hydrocarbonreceptor repressor，AHRR)是受AHR信号通路激活的转录因子，其通过负反馈机制抑制AHR依赖的下游基因表达。研究表明，AHRR基因作为AHR信号通路的关键抑制分子，可参与细胞生长、分化和凋亡、免疫炎症及血管生成等过程，在肿瘤发生发展中亦发挥着重要的作用。此外，有证据显示，位于AHRR基因的单核苷酸多态可影响AHRR基因的结构与功能，从而与复杂疾病的发生有关。
人类芳香烃受体抑制因子AHRR基因位于第5号染色体5p15.33区域，全长约134kb，包含12个外显子，编码719个氨基酸的蛋白质。有研究报道显示，AHRR基因编码区的遗传变异位点p.Pro189Ala(rs2292596；565C>G)可降低对AHRR基因的抑制效率，增加口腔癌的发病风险，而p.Pro189Ala位点是否与肺癌发病相关，需要我们进一步研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种检测AHRR基因编码区p.Pro189Ala位点基因型的引物组；该引物组特异性高，扩增效率高，可准确鉴别p.Pro189Ala SNP位点的基因型。
本发明的目的是提供一种检测AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala基因型的引物组。
本发明的另一目的是提供一种检测p.Pro189Ala位点基因型的方法。
本发明的再一目的目是提供一种肺癌易感性检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明首先提供AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala在个体肺癌易感性评估中的应用或在作为个体肺癌易感性评估的靶点方面的应用。
本发明通过大样本的中国南方人群肺癌病例对照研究，发现p.Pro189Ala位点与肺癌发病显著相关，并且呈基因剂量-反应关系。即使在调整年龄、性别、吸烟、肿瘤家族史等多种混杂因素后，这种相关性仍然存在。
具体地，所述应用为首先提取样本基因组DNA，再通过SNP基因分型技术测定p.Pro189Ala位点的基因型，若Pro189Ala位点的编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感性。
优选地，所述SNP基因分型技术为Taqman-MGB探针法。
一种检测AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala基因型的引物组，所述引物组包括一对特异性引物及两条野生型和突变型荧光探针，其序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。
所述
特异性引物F：5’-ACACCCACCTGTCTCCAAGG-3’(SEQ ID NO：1)
特异性引物R：5’-GCACCAGAACATTTATGACTAC-3’(SEQ ID NO：2)
野生型荧光探针：FAM-CGGGGCCTGCCCAAACA-MGB(SEQ ID NO：3)
突变型荧光探针：HEX-CGGGGGCTGCCCAAACACC-MGB(SEQ ID NO：4)
同时，本发明所述p.Pro189Ala位点基因型的检测引物在在肺癌易感性检测和/或在制备肺癌易感性检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。
一种AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala基因型的检测方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样本DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，用权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测，确定p.Pro189Ala位点的基因型。
优选地，步骤S2所述荧光定量PCR反应体系为：DNA模板2μL，10μM特异性引物各0.3μL，5μM荧光探针各0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.05μL，20mM dNTP 0.1μL，25mM MgCl2 0.5μL，5×荧光定量PCR反应缓冲液2.5μL，去离子水4.0μL，共10μL。
优选地，步骤S2所述荧光定量PCR反应体系为：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共50个循环。
优选地，所述荧光定量PCR检测仪器为ABI 7900HT型荧光定量PCR仪，其自带软件SDS(Sequence Detection Systems)V2.3判读基因型，自动分析结果。
此外，所述检测方法在肺癌易感性检测和/或在制备肺癌易感性检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。
具体地，所述应用为利用上述的p.Pro189Ala基因型的检测方法对样本的p.Pro189Ala进行基因型检测，若Pro189Ala位点的编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感型。
同时，本发明还提供一种肺癌易感性检测试剂盒，所述试剂盒包含上述检测p.Pro189Ala1位点基因型的引物组。
优选地，所述试剂盒还包含有荧光定量PCR所需试剂。
更优选地，所述荧光定量PCR所需试剂为Taq DNA聚合酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
优选地，所述试剂盒中还包含有样本基因组DNA提取所需试剂。
更优选地，所述试剂盒中还包含有硅胶吸附法提取基因组DNA所需耗材。
作为一种优选地可实施方式，本发明所述肺癌易感性检测试剂盒的使用方法如下：
S1.提取待测样本DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，用权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测，确定p.Pro189Ala位点的基因型。
S3.若Pro189Ala位点的编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感型。
所述荧光定量PCR反应体系为：DNA模板2μL，10μM特异性引物各0.3μL，5μM荧光探针各0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.05μL，20mM dNTP 0.1μL，25mM MgCl2 0.5μL，5×荧光定量PCR反应缓冲液2.5μL，去离子水4.0μL，共10μL。
所述荧光定量PCR反应体系为：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共50个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的p.Pro189Ala位点基因型检测引物特异性强，扩增效率高。所述检测方法可检测人群p.Pro189Ala位点基因型，评估携带不同基因型的人群肺癌发生的易感性；检测方法简单易行、高效，可用于肺癌高危人群的疾病预防指导。
附图说明
图1为本发明肺癌易感性检测流程图。
图2为本发明实施例各引物组的PCR扩增曲线和荧光信号图。A位组别1引物组的PCR扩增曲线和荧光信号图；B为组别2引物组的PCR扩增曲线和荧光信号图；C为组别3引物组的PCR扩增曲线和荧光信号图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1AHR基因编码区p.Pro189Ala位点引物设计
1、引物设计
本实施通过比对AHRR基因编码区序列，根据AHR基因上的p.Pro189Ala SNP位点的上下游序列，通过大量研究，设计了如表1所示的扩增引物及Taqman-MGB探针。
表1
2、荧光定量PCR检测
(1)将步骤1设计的3对引物，按照以下荧光定量PCR反应体系进行反应。总体积为10μL，包括DNA模板(20ng/μL)2μL，10μM特异性引物对(两条)各0.25μL，5μM特异性探针对(两条)各0.1μL，(5unit/μL)Taq DNA聚合酶0.03μL，20mM dNTP混合液0.1μL，25mM MgCl2溶液0.5μL，5×荧光定量PCR反应缓冲液2.37μL，去离子水4.3μL。
(2)在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪是进行反应，反应条件为50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45个循环。反应结束后在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪读取荧光量。
(3)采用ABI 7900HT型荧光定量PCR仪自带软件SDS(Sequence DetectionSystems)V2.3判读基因型。
3、结果
结果如图2所示，组别1的引物和探针设计良好，能扩增出PCR目的产物，可读取荧光信号值。而组别2和3的引物探针扩增不出目的片段，无荧光信号。
实施例2p.Pro189Ala位点检测方法在肺癌易感性检测中的应用
1、DNA的提取
对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷表。常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。
2、基因分型检测
使用实施例1的检测方法，对被检测者DNA的AHRR基因编码区p.Pro189Ala多态位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。
3、指导人们主动预防肺癌
通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的高低以及患病概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测这肺癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防肺癌的健康知识。
4、结果
本发明通过病例-对照研究分析AHRR基因p.Pro189Ala位点与肺癌易感性的关系，结果发现p.Pro189Ala位点与肺癌发病显著相关。表2为此次研究中肺癌和正常对照人群的基本资料，结果显示吸烟、吸烟量和饮酒在病例组和对照组中的比较，差异有统计学意义；而其他因素如年龄、性别、肿瘤家族史等变量在两组间无显著性差异。表3结果显示，与Pro/Pro野生型基因型相比，携带Ala/Pro或Ala/Ala变异基因型的个体发生肺癌的风险显著增加。表明Pro189Ala位点是肺癌发病的遗传易感标记物。
表2肺癌和对照人口学特征及主要因素的分布
Pa值是双侧的χ2检验。
表3p.Pro189Ala位点的基因型频率分布及与肺癌发病风险的关系
a对照组中，所选取位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)；b在logistic回归模型中的校正因素包括年龄、性别、吸烟、饮酒和家族癌症史。
实施例3肺癌易感性检测试剂盒
1、一种肺癌易感性检测试剂盒，所述试剂盒包含以下组分：p.Pro189Ala位点特异性扩增引物，突变型和野生型荧光探针，Taq DNA聚合酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
引物序列如下：
特异性引物F：5’-ACACCCACCTGTCTCCAAGG-3’(SEQ ID NO：1)
特异性引物R：5’-GCACCAGAACATTTATGACTAC-3’(SEQ ID NO：2)
野生型荧光探针：FAM-CGGGGCCTGCCCAAACA-MGB(SEQ ID NO：3)
突变型荧光探针：HEX-CGGGGGCTGCCCAAACACC-MGB(SEQ ID NO：4)
2、所述试剂盒的使用方法
S1.提取待测样本DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，用权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测，确定p.Pro189Ala位点的基因型。
S3.若p.Pro189Ala位点编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感型。
所述荧光定量PCR反应体系为：10μM特异性引物各0.25μL，5μM荧光探针各0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.03μL，20mM dNTP混合液0.1μL，25mMMgCl2 0.5μL，5×荧光定量PCR反应缓冲液2.37μL，去离子水4.3μL，共10μL。
所述荧光定量PCR反应体系为：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45个循环。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学
<120> 一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acacccacct gtctccaagg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaccagaac atttatgact ac 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggggcctgc ccaaaca 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgggggctgc ccaaacacc 19

Claims (10)

1. AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala在个体肺癌易感性评估中的应用或在作为个体肺癌易感性评估的靶点方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为首先提取样本基因组DNA，再通过SNP基因分型技术测定p.Pro189Ala位点的基因型，若p.Pro189Ala位点编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感性。
3. 一种检测AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala基因型的引物组，其特征在于，所述引物组包括一对特异性引物及两条野生型和突变型荧光探针，其序列依次如SEQ IDNO：1～4所示。
4.权利要求1所述引物组在肺癌易感性检测和/或在制备肺癌易感性检测试剂盒中的应用。
5.一种AHRR基因编码区多态性位点p.Pro189Ala基因型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样本基因组DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行荧光定量PCR检测，确定p.Pro189Ala位点的基因型。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述荧光定量PCR反应体系为：DNA模板2μL，10μM特异性引物各0.3μL，5μM荧光探针各0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.05μL，20mM dNTP 0.1μL，25 mM MgCl2 0.5μL，5×荧光定量PCR反应缓冲液2.5μL，去离子水4.0μL，共10μL。
7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述荧光定量PCR反应体系为：50℃ 2min，95℃ 10min；92℃ 15 s，60℃ 1 min，共50个循环。
8.权利要求5～7任一项所述的检测方法在肺癌易感性检测和/或在制备肺癌易感性检测试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体为利用权利要求5～7任一项所述的检测方法对样本p.Pro189Ala位点进行基因型检测，若p.Pro189Ala位点编码的氨基酸为Ala，则样本为肺癌易感型。
10.一种肺癌易感性检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物组。
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