CN101403010B - 一种用于检测骨髓增殖性疾病mplw515k突变的试剂盒及其专用引物与探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒及其专用引物与探针。本发明所提供的试剂盒，包括引物和TaqMan-MGB探针；所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515K突变进行检测，不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供MPLW515K突变基因与野生MPL基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒及其专用引物与探针。
背景技术
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders，MPDs)是一组造血干细胞肿瘤增生性疾病，在骨髓细胞普遍增生的基础上有一个系列细胞尤其突出，呈持续不断的过度增殖。临床上根据增生为主细胞系列的不同分为4种：①以红细胞系增生为主者，称真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)；②以粒细胞系增生为主者，称慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)；③以巨核细胞系增生为主者，称原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)；④以原纤维细胞增生为主者，称原发性骨髓纤维化症(idiopathicmyelofibrosis，IMF)。其中，95％的CML患者存在BCR/ABL融合基因，PCR-BCR/ABL检测已成为用于CML诊断的常规项目，而其余三种MPDs分别是影响红细胞、巨核细胞、血小板及骨髓微环境的恶性肿瘤，长期以来，未发现特异的分子诊断标志。
近年来，有关MPDs发病机理研究的主要进展是发现部分PV、IMF和ET患者具有JAK2V617F突变，该突变是后天获得性的髓系细胞中JAK2激酶自氨基末端第617位氨基酸残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F)，造成JAK2激酶活性增加，细胞生长信号系统获得活化，进而导致细胞异常增殖。这一发现，不仅使快速、可靠、准确诊断MPDs成为可能，而且可针对JAK2V617F突变开发出与格列卫类似的新的靶向疗法(格列卫目前正在被用来治疗慢性髓性白血病)，将为治疗MPDs提供一种新的治疗方法。目前，已发现74-97％以上的PV、23-57％的ET以及35-95％的IMF患者中JAK2V617F突变的检测结果呈阳性。在慢性髓性单核细胞白血病(CMML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)和急性髓性白血病(AML，尤其是M2、M6、M7型)患者中，该突变的检测阳性率可达13-18％(其中CNL、CMML已被世界卫生组织新的分型归为MPD及MPD/MDS)；而在急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病及继发性红细胞增多症等疾病患者中，该突变的检测结果为阴性，JAK2V617F突变的检测已广泛用于白血病的鉴别和诊断中。但在MPDs病人中，仍然有相当一部分病人JAK2V617F突变是阴性的，缺乏特异的分子诊断标志。
近一年来，MPDs研究出现了重要的进展，在JAK2V617F突变阴性的患者中发现存在MPL(myeloproliferative leukemia virus oncogene homology，MPL)突变(包括MPLW515L突变和MPLW515K突变)。MPL突变在JAKV617F突变阴性的MF和ET患者中约占5-10％。MPLW515K突变是MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸编码的密码子由TGG突变为AAG，导致MPL编码的氨基酸在该处由色氨酸(密码子TGG)突变为赖氨酸(密码子AAG)。与JAK2V617F突变检测一样，MPLW515K突变的检测也为明确MPDs诊断提供了可靠依据，还有可能作为治疗MPDs的一个药物靶标，用来治疗这一类疾病。
目前，国际上已报道的用于检测MPL突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan-MGB探针(TaqManMinor Groove Binder Probe，TaqMan-MGB探针)，TaqMan-MGB探针是带有一个小沟结合物基团的寡核苷酸探针，工作原理与TaqMan探针相同，报告荧光基团连接在探针的5＇端(如FAM、HEX、VIC等)，3＇端标记有淬灭基团，不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3可折叠进由探针末端5-6bp核苷酸形成的小沟内。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值—而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高，一个15bp的MGB探针的信噪比大于6，优于理想状态下的25bp的普通TaqMan探针(信噪比约为1.5)。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。与传统的TaqMan探针比较，TaqMan-MGB探针有以下优势：MGB增加了探针熔点温度(Tm)，这样可使探针较短，尤其适合富含A/T的序列，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，可进行更多重的PCR；提高信噪比，由于在探针的3＇端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验的结果更精确，分辨率更高；且实验步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。
但是，目前尚没有专门用于检测基因组DNA上的MPLW515K突变的合适的引物和特异性的TaqMan-MGB荧光探针。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒，包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的引物和TaqMan-MGB探针。
所述用于对骨髓增殖性疾病MPLW515K突变进行定性、定量检测的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。其中，序列表中的SEQ ID NO.1由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列，SEQ ID NO.2由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587534-43587554位碱基，扩增片段长度为91bp。
所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述探针为经过荧光标记的，5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭基团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)。
所述报告荧光基团可为FAM、HEX或VIC等，不发光的淬灭基团可为NFQ(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)等。
将具有序列表中SEQ ID NO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt-MGB-Probe，序列表中的SEQ ID NO.3由16个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列，针对43587595位的碱基T及43587596位的碱基G。
将具有序列表中SEQ ID NO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515K-MGB-Probe，序列表中的SEQ ID NO.4由17个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587585-43587601位碱基的反向互补序列，针对43587595位及43587596位的2个突变碱基AA。
上述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照；
所述阳性对照为MPLW515K突变阳性病人细胞的DNA；所述野生型对照为正常人细胞的DNA；所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
本发明的另一个目的是提供一种检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的方法。
本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的方法，包括以下步骤：
1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA；
2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，用上述试剂盒对上述步骤1)提取到的基因组DNA进行PCR扩增；
3)对步骤2)的扩增产物进行MPL激酶基因的等位基因鉴别分析，若用于标记SEQ ID NO：3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQ ID NO：4的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型；反之，表示MPLW515K纯合突变基因型；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示MPLW515K杂合突变基因型；
4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有MPLW515K纯合突变基因型或MPLW515K杂合突变基因型的受试者的MPLW515K突变检测结果为阳性。
在上述检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中的MPLW515K突变的方法中，为了便于对检测结果进行分析，还可在步骤2)中添加MPLW515K突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照，其中，MPLW515K突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515K突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6引物对进行PCR扩增后的产物，扩增产物经纯化后，分别被克隆进入pMD18-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后，提取DNA分别得到MPLW515K突变及野生型质粒标准品，通过测定吸光度值计算出拷贝数，分别制备十倍梯度稀释(107，106，105，104，103，102个拷贝)样品，用于制作MPLW515K突变及野生型的标准曲线；MPLW515K杂合突变基因型可为来自MPLW515K质粒和野生型质粒的不同比例的混合物，并以MPLW515K突变/MPL总与△Ct(CtMPLW515K突变-CtMPL野生)做标准曲线。测试样本的平均△Ct分别代入标准曲线计算MPLW515K突变基因占MPL总基因型(MPLW515K突变/MPL总)的百分比值。阴性对照可为不含DNA的PCR扩增体系。
此外，根据步骤3)的分析结果，测试样本为MPLW515K杂合突变基因型的，可根据标准曲线计算MPLW515K突变基因占MPL总基因型(JMPLW515K突变/MPL总)的百分比值。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的引物。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的TaqMan-MGB探针。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
所述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
所述报告荧光基团为FAM或HEX，所述不发光的淬灭基团为NFQ。
通过提取待测样品的基因组DNA，再将本发明的引物和TaqMan-MGB探针结合实时荧光定量PCR检测技术，通过检测人MPL激酶自氨基末端第515位的氨基酸，可达到检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的目的。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515K突变进行检测，不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供MPLW515K突变基因与野生MPL基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为十倍梯度稀释MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线
图2为十倍梯度稀释MPLW515K突变质粒标准品进行扩增的标准曲线
图3为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为野生型的扩增曲线
图4为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为W515K杂合型的扩增曲线
图5为测序验证部分样品的MPLW515K突变的结果
图6为计算MPLW515K突变基因占MPL总基因型的百分比值的标准曲线
图7为本发明的MPLW515K突变检测方法的稳定性及灵敏度测定结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、TaqMan-MGB探针的合成及序列测定工作均由上海基康生物技术有限公司完成。
实施例1、用于对骨髓增殖性疾病MPLW515K突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计
根据MPL激酶基因(1号染色体GeneLoc map region，41,576,062-45,592,722bp，GeneLoc location for GC01P043576)及其反向互补序列用Primer ExpressSoftware2.0软件设计一对PCR引物，同时根据野生型MPL激酶基因及MPL激酶MPLW515K突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针，将2条TaqMan-MGB探针的5’端分别依次标记报告荧光基团HEX和FAM，3’端标记不发光的淬灭基团，并连接DPI3，引物、TaqMan-MGB探针序列如表1所示：
表1 检测MPLW515K突变的引物、探针序列
序列表中的SEQ ID NO.1由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列，SEQ ID NO.2由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587534-43587554位碱基，扩增片段长度为91bp。
将具有序列表中SEQ ID NO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt-MGB-Probe，序列表中的SEQ ID NO.3由16个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列，针对第43587595位及第43587596位的碱基T和G。将具有序列表中SEQ ID NO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515K-MGB-Probe，序列表中的SEQ ID NO.4由17个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587585-43587601位碱基的反向互补序列，针对第43587595位及第43587596位的2个突变碱基AA。
实施例2、骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的检测
一、用根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针进行骨髓增殖性疾病MPLW515K突变检测
用实施例1中根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针对MPDs患者，包括ET、MF、未归类的MPDs，及CML等骨髓或外周血标本(来自人民医院)进行骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的检测，同时以正常供者的离体骨髓(NDM)为对照，具体方法如下：
1)待测样品基因组DNA的提取
按DNA zol试剂盒(购自美国Gibco公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取MPDs患者及正常骨髓移植供者(见表1)的骨髓标本的基因组DNA，方法为：用EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤2次后，加入600μl DNAzol试剂，轻轻混合吹打后加入600μl无水冷乙醇，4℃、12000rpm离心1分钟，弃上清，将沉淀用80％的冷乙醇洗涤一次，室温干燥，用适量的灭菌注射用水溶解沉淀，最后用DNA/RNA紫外检测仪测定DNA含量及纯度，结果A260/A280>1.8，表明所提取的DNA纯度较高。
2)PCR扩增
以步骤1)提取的DNA为模板，在实施例1中所述引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的TaqMan-MGB探针的引导下，用ABI7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，PCR反应体系为：1×Taq通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公司)，引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各400nM，荧光标记的W515wt-MGB-Probe100nM，W515K-MGB-Probe300nM，150-500ng DNA。PCR反应条件为：先50℃2分钟；然后95℃10分钟；最后95℃15秒，60℃1分钟，共45个循环。
为了便于对检测结果进行分析，同时设置MPLW515K突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照，其中，MPLW515K突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515K突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6引物对进行PCR扩增后的产物，扩增产物经纯化后，分别克隆入pMD18-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后，提取DNA分别得到MPLW515K突变及野生型质粒标准品，通过测定吸光度值计算出拷贝数，分别制备十倍梯度稀释(107，106，105，104，103，102个拷贝)样品，用于制作MPLW515K突变及野生型的标准曲线。十倍梯度稀释的MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线如图1所示，十倍梯度稀释的MPLW515K突变质粒标准品进行扩增的标准曲线如图2所示。阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
3)PCR扩增曲线鉴别分析
对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析，若用于标记TaqMan-MGB SEQ IDNO.3的荧光染料HEX发出的绿色荧光强度呈S型增长，同时用于标记TaqMan-MGBSEQ ID NO.4的荧光染料FAM发出的蓝色荧光强度无增长，表示野生型基因型，扩增曲线见图3(箭头指示的曲线表示荧光强度变化)；反之，表示纯合突变基因型；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型，扩增曲线见图4(箭头指示的曲线分别表示荧光强度变化，在图4中分别表示MPLW515K突变基因型和野生型基因型)。
4)结果判断
根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有杂合突变基因型或纯合突变基因型的待测样品的MPLW515K突变检测结果为阳性，受试者为骨髓增殖性疾病患者，检测结果如表1所示。对其中5例标本(阳性3例，阴性2例)用测序的方法进行了验证，其中3例标本的测序检测结果如图5所示，与以上方法的检测结果一致。表明用本发明的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对MPLW515K突变进行检测，检测结果准确。
表1 MPLW515K突变在JAK2V617F阴性的MPDs中的检出情况
5)同时对阳性对照突变基因型MPLW515K的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为80％、40％、20％、10％、5％的比例，每梯度重复3-5管进行扩增，以MPLW515k突变/MPL总与其相应的平均△Ct(CtMPLW515K突变-CtMPL野生)做标准曲线为y＝-0.0699x+0.185，检测MPLW515K突变，相关系数r＝0.99，其中Y代表不同的突变基因百分比，X代表平均△Ct(CtMPLW515K突变-CtMPL野生)，测试样本的平均△Ct代入上述标准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比(MPLW515K突变/MPL总)。对上述阳性的MPDs患者的结果根据DNA标准曲线(见图6)计算其突变基因百分比(MPLW515K突变/MPL总)，结果平均值为39.92±23.18％。
二、本发明骨髓增殖性疾病MPLW515K突变检测方法的灵敏度测定
将阳性对照突变基因型MPLW515K的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为60％、40％、20％、10％、5％(突变基因型/(突变基因型+野生基因型)的比例，按上述相同方法进行检测，结果在5％梯度均可检出MPLW515K突变扩增曲线，表明本发明方法的检测灵敏度可达5％(见图7)。
序列表
<160>6
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
Claims (7)
1.一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变的试剂盒，包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的引物和TaqMan-MGB探针；
所述用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述TaqMan-MGB探针的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM或HEX，所述不发光的淬灭基团为NFQ。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照；
所述阳性对照为MPLW515K突变阳性病人细胞的DNA；
所述野生型对照为正常人细胞的DNA；
所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
5.用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515K突变的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
所述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
6.根据权利要求5所述的TaqMan-MGB探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM或HEX，所述不发光的淬灭基团为NFQ。
7.权利要求1-4中任一所述的试剂盒、权利要求5或6所述的探针在检测骨髓增殖性疾病MPLW515K突变中的应用。
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-
2008
- 2008-11-13 CN CN2008102265124A patent/CN101403010B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 阮国瑞.TaqMan—MGB探针检测骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变.《中华医学杂志》.2007, * |
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| Publication number | Publication date |
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