CN103757100A - 检测mpl基因515位点突变类型的方法和引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测MPL基因515位点突变类型的引物和方法：提取出样本中的基因组DNA后，利用一对扩增引物MPL-F和MPL-R扩增待检MPL515位点区段，获得PCR扩增产物，随后对PCR扩增产物进行纯化获得单链核苷酸模板，最后利用一条测序引物MPL-S进行焦磷酸测序，并将测序结果与预先确定的标准比对序列进行比对，从而确定MPL515位点突变类型。该方法将常规PCR扩增技术和焦磷酸测序技术相结合，可快速准确高通量地检测MPL515位点突变类型，最低能够检出约1%的突变，适于临床筛查。

Description

检测MPL基因515位点突变类型的方法和引物
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测MPL基因515位点突变类型的方法和引物。该方法将常规PCR扩增技术和焦磷酸测序技术相结合起来，方便快捷，灵敏度高，通量大，适于临床筛查。
背景技术
骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一种惰性肿瘤，是由造血前体细胞生长激活基因改变导致的多细胞系过度增殖而引起的。虽然对造血细胞的成熟影响较少，但是所有MPN都可通过不同的频率转化成急性白血病。由于在MPN中，一系列的染色体重排及突变激活了酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)及其下游信号转导通路，使得肿瘤克隆性的增殖大大超越了正常造血细胞。因此涉及PTKs的分子异常已经广泛地应用于临床参考、分类、微小残留病灶的监测等，MPL基因即是其中一种。
MPL基因（myeloproliferative leukemia gene），编码血小板生成素受体，促进细胞的生长、增殖及分化。该受体参与调控巨核细胞的增殖和血小板的生成；此外研究还表明其对造血干细胞的维护、更新和调节也起着重要的作用。2006年，Daniela Pietra等在骨髓纤维化伴骨髓性化生的患者中检测到了MPL515位点发生突变，突变结果为MPL W515L。而后的MPL515位点突变筛查中发现，原发性血小板增多症（ET）及原发性骨髓纤维化（PMF）患者的MPL515位点突变发生率分别为1%和5%。
研究发现伴MPL W515L/K的ET患者比MPL未突变患者具有年龄高、血小板计数高以及随访期间动脉血栓发生率显著增高的特点。而高龄、高白细胞计数、高血红蛋白水平及过往的血栓形成史都预示着ET生存期较差。因此，MPL的突变状态不失为引起医生了解和关注患者病情的一个分子信号。
目前用于MPL515位点突变检测或筛查的方法主要有：Sanger测序和高灵敏度溶解曲线法（High Resolution Melt，HRM）。Sanger测序法目前是临床应用于检测基因突变极其普遍的一种手段，测序检测结果堪称金标准，但是其灵敏度不高，只能检出突变比例大于20%的突变样本。而HRM是广泛用于筛查基因突变的一种新方法，其灵敏度高，能检出小于1%甚至0.1%的突变，但是无法区分待检区段的突变类型。只要在引物设计区段内，哪怕不是待鉴定位置发生缺失、插入还是点突变都会错误地显示出突变的结果。因此，人们需要一种灵敏度和准确度高，同时能明确检测突变类型的筛查方法。
发明内容
鉴于目前筛查检测基因MPL515位点突变方法的不足，本发明提供了用于检测样本中基因MPL515位点突变类型的引物，所述引物包括用于扩增待检MPL515位点区段的一对扩增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列为：
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。
进一步地，所述引物还包括一条用于焦磷酸测序的测序引物MPL-S，其核苷酸序列为：
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
进一步地，依据所述测序引物能获得MPL515位点野生型和各种突变型的测序结果序列：
MPL W515野生型：TGGCAGTTT
MPL W515L纯合突变型：TTGCAGTTT
MPL W515K纯合突变型：AAGCAGTTT
MPL W515A纯合突变型：GCGCAGTTT
MPL W515R纯合突变型：CGGCAGTTT
MPL W515S纯合突变型：TCGCAGTTT
MPL515W/L杂合突变型：TGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/K杂合突变型：TGGACGACGATTTG
MPL515W/R杂合突变型：CTGGGGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/S杂合突变型：TGGCGACGATTTG
MPL515W/A杂合突变型：TGCGACGATTTG。
进一步地，依据所述测序引物在基因MPL515中的结合位置和所述测序结果序列，确定标准比对序列，所述标准比对序列核苷酸序列如下：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A2GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
本发明还提供了一种检测基因MPL515位点突变类型的方法，包括以下步骤：
(1)提取血液样本中的DNA；
(2)利用一对扩增引物MPL-F和MPL-R对(1)中的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)对(2)中的扩增产物进行纯化，得到单链核苷酸模板；
(4)利用测序引物MPL-S对(3)中的单链核苷酸模板进行焦磷酸测序，获得焦磷酸测序结果；
(5)将(4)中的焦磷酸测序结果与标准比对序列进行比对，确定基因MPL515位点的突变类型，其中，
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
进一步地，对所述步骤(5)所述的比对过程如下：
(1)先忽略峰高比例通读测序图中的序列，找出符合的标准比对序列，若只有一条符合，则该标准比对序列对应的突变类型即为所测到的突变类型；
(2)若有多条符合，再根据标准比对序列中大写字母表示的碱基对应的峰高比例，找出峰高比例相符的序列，其对应的突变类型即为所测到的突变类型。
进一步地，所述标准比对序列为：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A2GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
进一步地，步骤(2)中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min；98℃变性10s，56℃退火25s，68℃延伸30s，40个循环。
本发明还提供了一种检测基因MPL515位点突变类型的试剂盒，其包括样本DNA提取试剂、PCR扩增体系、单链核苷酸模板纯化系统和焦磷酸测序体系，所述PCR扩增体系包括用于扩增待检MPL515位点区段的一对扩增引物MPL-F和MPL-R，所述焦磷酸测序体系包括一条用于焦磷酸测序的测序引物MPL-S，其中，
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
进一步地，所述PCR扩增体系还包括2×KOD Buffer、KOD酶、dNTP和去离子水。
进一步地，所述红细胞裂解液由NH4Cl、NaHCO3、EDTA-Na2和ddH2O配置而成。
进一步地，所述试剂盒还提供判别MPL515位点焦磷酸测序结果为野生型、纯合突变型和杂合突变型的标准比对序列：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A2GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
本发明的有益效果是，该方法将常规PCR扩增技术和焦磷酸测序技术相结合起来，灵敏度高，最低能够检出约1%的突变，同时能明确被检测样本的MPL515突变类型，适于临床筛查。
附图说明
图1第一个待检血液样本进行筛查的焦磷酸测序图（MPL515W/A杂合突变型）及用Sanger测序法验证的测序图
图2第二个待检血液样本进行筛查的焦磷酸测序图（MPL515W/L杂合突变型）及用Sanger测序法验证的测序图
图3第三个待检血液样本进行筛查的焦磷酸测序图（MPL515W/K杂合突变型）及用Sanger测序法验证的测序图
图4第四个待检血液样本进行筛查的焦磷酸测序图（MPL W515野生型）及用Sanger测序法验证的测序图
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：检测基因MPL515位点突变类型的引物和试剂盒
用于检测样本中基因MPL515位点突变类型的引物，所述引物包括用于扩增待检MPL515位点区段的一对扩增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列为：
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。
优选地，所述引物还包括一条用于焦磷酸测序的测序引物MPL-S，其核苷酸序列为：
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
优选地，所述测序引物能获得MPL515位点野生型和各种突变型的测序结果序列：
MPL W515野生型：TGGCAGTTT
MPL W515L纯合突变型：TTGCAGTTT
MPL W515K纯合突变型：AAGCAGTTT
MPL W515A纯合突变型：GCGCAGTTT
MPL W515R纯合突变型：CGGCAGTTT
MPL W515S纯合突变型：TCGCAGTTT
MPL515W/L杂合突变型：TGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/K杂合突变型：TGGACGACGATTTG
MPL515W/R杂合突变型：CTGGGGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/S杂合突变型：TGGCGACGATTTG
MPL515W/A杂合突变型：TGCGACGATTTG。
一种检测基因MPL515位点突变类型的试剂盒，其包括样本DNA提取试剂、PCR扩增体系、单链核苷酸模板纯化系统和焦磷酸测序体系，所述PCR扩增体系包括用于扩增待检MPL515位点区段的一对扩增引物MPL-F和MPL-R，所述焦磷酸测序体系包括一条用于焦磷酸测序的测序引物MPL-S，其序列为：
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
优选地，PCR扩增体系还包括2×KOD Buffer、KOD酶、dNTP和去离子水。
优选地，红细胞裂解液由NH4Cl、NaHCO3、EDTA-Na2和ddH2O配置而成。
优选地，该试剂盒还提供判别MPL515位点焦磷酸测序结果为野生型、纯合突变型和杂合突变型的标准比对序列，如下所示：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A2GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
标准比对序列确定过程如下所示：
(1)根据测序引物MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’在MPL基因序列（序列NG007525)中所在的位置，及焦磷酸测序时使用的SQA测序模式及设置的程序4（CTGA），推断出MPL515位点野生型和各种纯合突变型的测序结果序列，其碱基序列为：
MPL W515野生型：TGGCAGTTT
MPL W515L纯合突变型：TTGCAGTTT
MPL W515K纯合突变型：AAGCAGTTT
MPL W515A纯合突变型：GCGCAGTTT
MPL W515R纯合突变型：CGGCAGTTT
MPL W515S纯合突变型：TCGCAGTTT。
(2)根据(1)中的MPL515位点野生型和各种突变型的测序结果序列，结合焦磷酸测序的原理及焦磷酸测序时使用的SQA测序模式及设置的程序4（CTGA），推断分析出杂合突变型的测序结果序列为：
MPL515W/L杂合突变型：TGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/K杂合突变型：TGGACGACGATTTG
MPL515W/R杂合突变型：CTGGGGCCAAGGTTTTTT
MPL515W/S杂合突变型：TGGCGACGATTTG
MPL515W/A杂合突变型：TGCGACGATTTG
(3)根据焦磷酸测序原理及峰图特征，结合(1)中的MPL基因野生型和各种突变型的测序结果序列，以及(2)中的杂合突变型的测序结果序列，推断分析MPL基因515位点焦磷酸测序图谱的特征，编制标准比对序列。
实施例2：样本DNA的提取
使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）。取300μl待检全血样本加入1.5ml离心管中，加入900ul红细胞裂解液颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清；加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。再加200μl无水乙醇，混匀，将溶液加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，弃废液；向CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液；向CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液；重复一次。再将CB3放回收集管中，12000rpm空离心2min；并将CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，所得即为样本DNA。
10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。
实施例3：PCR扩增
按如下试剂及试剂量配置PCR扩增体系，其中引物MPL-F（10μM）和MPL-R（10μM）各1ul；2×KOD Buffer20ul，KOD酶（1U/ul）0.8ul，dNTP（2mM）6ul（东洋纺（上海）生物科技有限公司）；加去离子水9.2ul；最后加DNA模板2ul。其扩增程序如下：94℃5min；98℃10s，58℃20s，68℃30s，共40个循环；68℃2min。
实施例4：单链核苷酸模板的制备
先将Streptavidin Sepharose High Performance（GE Healthcare Life Sciences）和Bindingbuffer（Qiagen）以3：47混匀。再在PCR产物中加入上述混合液40ul。混匀后，用纯化系统（Vacuum prep workstation）对其进行纯化，得到的即为5'端用生物素(biotin)标记的单链核苷酸模板；并将纯化的单链核苷酸模板收集在包含2ul MPL-S（10μM）测序引物的总体系为45ul的Annealing buffer（Qiagen）中。
实施例5：焦磷酸测序体系
将实施例4中制备好的溶液放置于焦磷酸设备中，开启PyroMark ID Systems设备（Qiagen），打开测序软件PyroMarkTM ID，选择SQA模式，设置程序为：4（CTGA），这样测序软件会根据程序中dNTP加样顺序及形成的峰型确定测序结果，即峰图。
将测序结果与标准比对序列进行比对，比对判断标准为：①先忽略峰高比例通读测序图中的序列，找出符合的标准比对序列，若只有一条符合，则该标准比对序列对应的突变类型即为所测到的突变类型；②若有多条符合，再根据标准比对序列中大写字母表示的碱基对应的峰高比例，找出峰高比例相符的序列，其对应的突变类型即为所测到的突变类型。
检测系统根据程序设定，以C→T→G→A的顺利加入不同的dNTP，循环加样4次。检测系统自动监测并收集信号峰，得到测序峰图。
实施例6：第一个待检全血样本检测
对第一个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA提取、PCR扩增和单链模板制备及焦磷酸测序检测，得到的测序峰图如图1-A，得到的测序结果序列为：tgcgacgatg。
依据第一个待检全血样本的检测结果和比对判断标准，先忽略峰高比例通读序列，找出符合的DNA碱基比对序列有两条：tG2cgAcGaT3g（MPL515W/S）和TgcgAcGaT3g（MPL515W/A）。再根据比对序列大写字母表示的碱基对应的峰高比例，tG2cgAcGaT3g第2位的G和倒数第3位的T，峰高比例应为2：3，待检样本的序列峰图接近1：1，明显不符，排除为MPL515W/S突变的可能；而TgcgAcGaT3g第1位的T和倒数第2位的T，峰高比例应为1：3，第一个待检全血样本的序列峰图接近1：3，故为MPL515W/A杂合突变型。经Sanger测序法检测验证，确实为MPL515W/A杂合突变型，见图1-B。
实施例7：第二个待检全血样本检测
对第二个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA的提取，PCR扩增，单链模板的制备及焦磷酸测序检测，得到的测序峰图如图2-A，得到的测序结果序列为：tgcagt。根据比对判断标准，先忽略峰高比例通读序列，找出符合的DNA碱基比对序列有三条：TG2CAGT3（MPLW515野生型）、T2GCAGT3（MPL W515L）和tgC2A2G2T6（MPL515W/L）。再根据比对序列大写字母表示的碱基对应的峰高比例，TG2CAGT3第1位的T和第2位的G，峰高比例应为1：2，T2GCAGT3第1位的T和第2位的G，峰高比例应为2：1，待检样本的序列峰图接近1：1，明显不符，排除为MPL W515野生型和MPL W515L突变的可能；而tgC2A2G2T6第3位的C、第4位的A和倒数1位的T，峰高比例应为2：2：6即1：1：3，待检样本的序列峰图接近1：1：3，故为MPL515W/L杂合突变型。经Sanger测序法检测验证，确实为MPL515W/L杂合突变型，见图2-B。
实施例8：第三个待检全血样本检测
对第三个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA的提取，PCR扩增，单链模板的制备及焦磷酸测序检测，得到的测序峰图如图3-A，得到的测序结果序列为：tgacgacgatg。根据比对判断标准，先忽略峰高比例通读序列，找出符合的DNA碱基比对序列只有一条：TG2aCgAcGaT3g（MPL515W/K）。故待检样本即为MPL515W/K杂合突变型。经Sanger测序法检测验证，确实为MPL515W/K杂合突变型，见图3-B。
实施例9：第四个待检全血样本检测
对第四个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA的提取，PCR扩增，单链模板的制备及焦磷酸测序检测，得到的测序峰图如图4-A，得到的测序结果序列为：tgcagt。根据结果判断标准，先忽略峰高比例通读序列，找出符合的DNA碱基比对序列有三条：TG2CAGT3（MPLW515野生型）、T2GCAGT3（MPL W515L）和tgC2A2G2T6（MPL515W/L）。再根据比对序列大写字母表示的碱基对应的峰高比例，TG2CAGT3第1位的T和第2位的G，峰高比例应为1：2，待检样本的序列峰图也接近1：2，故为MPL W515野生型。而T2GCAGT3第1位的T和第2位的G，峰高比例应为2：1；tgC2A2G2T6第3位的C、第4位的A和倒数1位的T，峰高比例应为2：2：6，均与待检样本峰图不符。经Sanger测序法检测验证，确实为MPL W515野生型，见图4-B。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  郑州艾迪康医学检验所（普通合伙）
 
<120>  检测MPL基因515位点突变类型的方法和引物
 
<130> 
 
<160>  14   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cgaagtctga ccctttttgt ct                                              22
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
agcgaaccaa gaatgcctgt                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gtcctgggcc tgctgctgct gagg                                            24
 
 
<210>  4
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515野生型
 
<400>  4
tggcagttt                                                              9
 
 
<210>  5
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515L纯合突变型
 
<400>  5
ttgcagttt                                                              9
 
 
<210>  6
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515K纯合突变型
 
<400>  6
aagcagttt                                                              9
 
 
<210>  7
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515A
 
<400>  7
gcgcagttt                                                              9
 
 
<210>  8
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515R
 
<400>  8
cggcagttt                                                              9
 
 
<210>  9
<211>  9
<212>  DNA
<213>  MPL W515S
 
<400>  9
tcgcagttt                                                              9
 
 
<210>  10
<211>  14
<212>  DNA
<213>  MPL 515W/L
 
<400>  10
tgccaaggtt tttt                                                       14
 
 
<210>  11
<211>  14
<212>  DNA
<213>  MPL 515W/K
 
<400>  11
tggacgacga tttg                                                       14
 
 
<210>  12
<211>  18
<212>  DNA
<213>  MPL 515W/R
 
<400>  12
ctggggccaa ggtttttt                                                   18
 
 
<210>  13
<211>  13
<212>  DNA
<213>  MPL 515W/S
 
<400>  13
tggcgacgat ttg                                                        13
 
 
<210>  14
<211>  12
<212>  DNA
<213>  MPL 515W/A
 
<400>  14
tgcgacgatt tg                                                         12

Claims (8)

1.用于检测样本中基因MPL 515位点突变类型的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增待检MPL 515位点区段的一对扩增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列为：
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括一条用于焦磷酸测序的测序引物MPL-S，其核苷酸序列为：
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，依据所述测序引物能获得MPL515位点野生型和各种突变型的测序结果序列：
MPL W515野生型：TGGCAGTTT
MPL W515L纯合突变型：TTGCAGTTT
MPL W515K纯合突变型：AAGCAGTTT
MPL W515A纯合突变型：GCGCAGTTT
MPL W515R纯合突变型：CGGCAGTTT
MPL W515S纯合突变型：TCGCAGTTT
MPL 515W/L杂合突变型：TGCCAAGGTTTTTT
MPL 515W/K杂合突变型：TGGACGACGATTTG
MPL 515W/R杂合突变型：CTGGGGCCAAGGTTTTTT
MPL 515W/S杂合突变型：TGGCGACGATTTG
MPL 515W/A杂合突变型：TGCGACGATTTG。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，依据所述测序引物在基因MPL 515中的结合位置和所述测序结果序列，确定标准比对序列，所述标准比对序列核苷酸序列如下：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A 2 GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL 515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL 515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL 515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL 515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL 515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
5.一种检测基因MPL 515位点突变类型的方法，包括以下步骤：
(1)提取血液样本中的DNA；
(2)利用一对扩增引物MPL-F和MPL-R对(1)中的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)对(2)中的扩增产物进行纯化，得到单链核苷酸模板；
(4)利用测序引物MPL-S对(3)中的单链核苷酸模板进行焦磷酸测序，获得焦磷酸测序结果；
(5)将(4)中的焦磷酸测序结果与标准比对序列进行比对，确定基因MPL 515位点的突变类型，其特征在于，
MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述步骤(5)所述的比对过程如下：
(1)先忽略峰高比例通读测序图中的序列，找出符合的标准比对序列，若只有一条符合，则该标准比对序列对应的突变类型即为所测到的突变类型；
(2)若有多条符合，再根据标准比对序列中大写字母表示的碱基对应的峰高比例，找出峰高比例相符的序列，其对应的突变类型即为所测到的突变类型。
7.如权利要求所述5的方法，其特征在于，所述标准比对序列为：
MPL W515野生型：TG2CAGT3
MPL W515L纯合突变型：T2GCAGT3
MPL W515K纯合突变型：A 2 GCAG
MPL W515A纯合突变型：GCGCAG
MPL W515R纯合突变型：CG2CAGT3
MPL W515S纯合突变型：TCGCAG
MPL 515W/L杂合突变型：tgC2A2G2T6
MPL 515W/K杂合突变型：TG2aCgAcGaT3g
MPL 515W/R杂合突变型：ctG4C2A2G2T6
MPL 515W/S杂合突变型：tG2cgAcGaT3g
MPL 515W/A杂合突变型：TgcgAcGaT3g
其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4种碱基；碱基右下角数字代表峰高比例。
8.如权利要求所述5的方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min；98℃变性10s，56℃退火25s，68℃延伸30s，40个循环。
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