CN109182517B

CN109182517B - 一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用

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Publication number: CN109182517B
Application number: CN201811043820.3A
Authority: CN
Inventors: 徐清华; 陈成书; 孙益丰; 陈金影; 王奇峰; 宋凯斌
Original assignee: Canhelp Genomics Co ltd
Current assignee: Canhelp Genomics Co ltd
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: US11312999B2; US20210254179A1; CN109182517A; WO2020048518A1

Abstract

本发明公开了一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，包括如下24个基因：EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因、GABRA5基因、GAD1基因、TNC基因、KCNA1基因、EOMES基因、MAB21L2基因、WIF1基因、DKK2基因、PDLIM3基因、IMPG2基因、KHDRBS2基因。此外，本发明还公开了该基因组在制备用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒和基因芯片中的应用。经验证，本发明能准确区分髓母细胞瘤WNT型、SHH型、Group3型和Group4型，其结果判读客观、准确率高，实验周期短，对患者进行精准治疗具有重要的临床意义。

Description

一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用

技术领域

本发明涉及癌症诊断和分子生物学领域，以及诊断技术在临床上的运用。具体地，本发明涉及一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用，通过髓母细胞瘤分子分型的建立和检测髓母细胞瘤组织中的特异度基因的表达，鉴别髓母细胞瘤亚型，包括WNT型（WNTsubgroup）、SHH型（Sonic Hedgehog Subgroup）、Group3型（Group3）和 Group4型（Group4）。此外，本发明还涉及一种用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒。

背景技术

中国癌症统计数据显示，2015年我国脑及中枢神经系统癌症新病例数达到约10.16万人，被列为十大常见肿瘤的第七位，死亡人数6.1万人，死亡率为60%（Chen W,Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. Ca Cancer JClin, 2016, 66(2):115-132.）。髓母细胞瘤（medulloblastoma）是儿童最常见的恶性脑肿瘤，为主要发生在小脑的原始神经外胚叶肿瘤。大约有85%的髓母细胞瘤发生于18岁以下的儿童，而每5例患有脑肿瘤的儿童中，就有1例髓母细胞瘤。目前的手术治疗结合放化疗的联合治疗策略使患者的总体5年生存率已经达到50%以上。然而，由于大剂量放疗等给患儿带来的智力上的损伤严重影响患儿及其家庭的生活质量，分子靶向治疗和个体化精准治疗已成为髓母细胞瘤研究领域最受关注的方向。

随着分子生物学技术的快速发展，研究人员发现髓母细胞瘤并不是单一的疾病，而是多种不同分子亚型组成的脑肿瘤。目前公认的髓母细胞瘤的分子亚型，主要有4种亚型：WNT型（WNT subgroup）、SHH型（Sonic Hedgehog Subgroup）、Group3型（Group3）和Group4型（Group4）。这些亚型在治疗和预后方面各不相同，对应不同的临床策略。关于髓母细胞瘤分子分型的进一步深入探讨对于髓母细胞瘤发病机制的研究、临床试验的开展、靶向治疗药物的研发以及临床个体化治疗方案的改进都有重要意义，从而最终达到既提高重症患儿的生存率又改善预后好的患者组的生存质量的目的。

表1 髓母细胞瘤亚型及发病率

肿瘤是基因组疾病,基因组变化在肿瘤发生和发展中起着重要作用。近年来，随着分子生物学和生物信息学技术的飞速发展，研究人员采用生物芯片和高通量测序技术，可同时检测肿瘤组织中成千上万个基因的表达水平，从中发现与肿瘤亚型相关的基因及特定的表达模式。国内外相关研究报道，基因表达谱分析对从分子水平阐明肿瘤本质及准确划分肿瘤亚型可起到重要的辅助作用。根据2016年WHO《中速神经系统肿瘤分类》，基因表达谱分析是髓母细胞瘤分子分型的金标准，也是区分4种不同亚型最好的方法( Ellison DW,Dalton J, Kocak M, et al. Medulloblastoma: clinicopathological correlates ofSHH, WNT, and non-SHH/WNT molecular subgroups. Acta neuropathologica. 2011;121(3):381-396. doi:10.1007/s00401-011-0800-8.)。然而，这种方法需要从新鲜冷冻的肿瘤标本中提取较大数量的高质量RNA进行全基因组转录芯片的分析。新鲜组织样本获取困难，实验操作过程复杂并且费用昂贵，在目前的临床环境下并不适用（何以琳, 常青. 髓母细胞瘤分子亚型的研究进展[J]. 中华病理学杂志, 2015, 44(5):357-360.）。在美国，Northcott等人采用NanoString nCounter Technology技术平台开发了一种基于石蜡包埋标本的分子分型检测方法（Northcott PA, Shih DJH, Remke M, et al. Rapid,reliable, and reproducible molecular sub-grouping of clinical medulloblastomasamples. Acta Neuropathologica. 2012;123(4):615-626. doi:10.1007/s00401-011-0899-7.）。在84例石蜡包埋组织样本中，该方法准确区分57例样本的分子亚型，分型准确率仅为68%。由此可见，该方法容易受到石蜡包埋组织样本中RNA降解的干扰。同时，该方法所基于的NanoString nCounter Technology是一个封闭的技术平台，需要采用特定的检测设备和试剂耗材，运行和维护费用极高，实验操作过程复杂，不适合开展大规模临床应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，建立髓母细胞瘤统计分析模型，帮助患者实现个体化治疗。

本发明要解决的技术问题之二是提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因的用途。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒及其用途。

本发明要解决的技术问题之四是提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因在制备用于判断髓母细胞瘤分子亚型的基因芯片中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，包括如下13个基因：EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因。

本文中“EPHA7”的基因ID为2045，在GenBank数据库中登录号为NM_001288629.1。

本文中“OTX2”的基因ID为5015，在GenBank数据库中登录号为NM_001270525.1。

本文中“ROBO1”的基因ID为6091，在GenBank数据库中登录号为NM_001145845.1。

本文中“TTR”的基因ID为7276，在GenBank数据库中登录号为NM_000371.3。

本文中“LGR5”的基因ID为8549，在GenBank数据库中登录号为NM_001277226.1。

本文中“IGF2BP3”的基因ID为10643，在GenBank数据库中登录号为NM_006547.2。

本文中“TBR1”的基因ID为10716，在GenBank数据库中登录号为NM_006593.3。

本文中“ZFPM2”的基因ID为23414，在GenBank数据库中登录号为NM_012082.3。

本文中“TRDC”的基因ID为28526，该基因为融合基因。

本文中“TRAC”的基因ID为28755，该基因为融合基因。

本文中“PEX5L”的基因ID为51555，在GenBank数据库中登录号为NM_001256750.1。

本文中“NKD1”的基因ID为85407，在GenBank数据库中登录号为NM_033119.4。

本文中“RALYL”的基因ID为138046，在GenBank数据库中登录号为NM_001100391.2。

作为本发明优选的技术方案，该组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，还包括如下11个基因：GABRA5基因、GAD1基因、TNC基因、KCNA1基因、EOMES基因、MAB21L2基因、WIF1基因、DKK2基因、PDLIM3基因、IMPG2基因、KHDRBS2基因。

本文中“GABRA5”的基因ID为2558，在GenBank数据库中登录号为NM_001165037.1。

本文中“GAD1”的基因ID为2571，在GenBank数据库中登录号为NM_000817.2。

本文中“TNC”的基因ID为3371，在GenBank数据库中登录号为NM_002160.3。

本文中“KCNA1”的基因ID为3736，在GenBank数据库中登录号为NM_000217.2。

本文中“EOMES”的基因ID为8320，在GenBank数据库中登录号为NM_001278182.1。

本文中“MAB21L2”的基因ID为10586，在GenBank数据库中登录号为NM_006439.4。

本文中“WIF1”的基因ID为11197，在GenBank数据库中登录号为NM_007191.4。

本文中“DKK2”的基因ID为27123，在GenBank数据库中登录号为NM_014421.2。

本文中“PDLIM3”的基因ID为27295，在GenBank数据库中登录号为NM_001114107.4。

本文中“IMPG2”的基因ID为50939，在GenBank数据库中登录号为NM_016247.3。

本文中“KHDRBS2”的基因ID为202559，在GenBank数据库中登录号为NM_001350622.1。

作为本发明优选的技术方案，所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和 Group4型。

作为本发明优选的技术方案，所述基因采用如下方法筛选得到：采用“大数据和算法驱动”的分析技术，选取对于髓母细胞瘤高特异性的基因组合；首先构建髓母细胞瘤基因表达谱数据库，包含人类已知20250个基因、461例样品，近1000万个数据点，将每个样本中人类2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据关联起来，然后通过统计分析方法方差检验来筛选髓母细胞瘤特异基因，即分析每个基因与髓母细胞瘤分子亚型的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因，最终筛选得到24个基因用于构建分类模型。

本发明通过基因检测、标志物组合及数据挖掘算法的联合应用来建立基因标志物组合模型，利用多基因预测模型区分髓母细胞瘤四种亚型，包括WNT型、 SHH型、 Group3型和 Group4型。主要包括以下步骤：

（1）首先构建髓母细胞瘤基因表达谱数据库，包含人类已知20250个基因、461例样品，约一千万个数据点；将每个样本中2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据进行关联匹配；

（2）通过统计分析方法方差检验来筛选髓母细胞瘤分型特异基因，即分析每个基因与髓母细胞瘤每种分子亚型的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因，筛选得到24个与髓母细胞瘤各亚型密切相关的基因，分别为EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因、GABRA5基因、GAD1基因、TNC基因、KCNA1基因、EOMES基因、MAB21L2基因、WIF1基因、DKK2基因、PDLIM3基因、IMPG2基因、KHDRBS2基因。

（3）检测上述24个基因的表达水平，采用支持向量机算法，建立统计分析模型用于髓母细胞瘤分子分型。对于每一例待测样本，计算该样本24基因表达模式与数据库中髓母细胞瘤各个亚型的相似度分数（Similarity Score）。根据相似度分数最高的判定规则，判定样本所属分子亚型。

本发明提供了一种用于判断髓母细胞瘤亚型的检测方法，包括以下步骤：

（1）将取自髓母细胞瘤患者的生物学样品与生物标志物接触，所述生物标志物包括上述24个基因；所述生物学样本是取自所述对象的离体肿瘤组织，可以是新鲜的样本或者福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）样本。

在此基础上，进一步进行髓母细胞瘤亚型判断：

（2）检测该生物学样本中24个基因的表达模式和表达水平，基于24个基因的表达水平来判断该生物学样品的亚型。采用数据分析方法，计算该生物学样品与髓母细胞瘤各亚型的相似度分数（Similarity Score）。根据相似度分数最高的判定规则，判定所属亚型。所述检测包括从所述样本制备RNA，所述RNA用于聚合酶链式反应（PCR），所述PCR是逆转录PCR（RT-PCR），可选实时RT-PCR或者基因芯片或者高通量测序技术。

在本发明的另一方面，提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因在制备用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物选自上述一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因中的任意一种或多种。

作为本发明优选的技术方案，所述生物标志物是核酸、或寡核酸链、或PCR引物组。

作为本发明优选的技术方案，所述PCR引物组包括：

EPHA7基因：正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；

OTX2基因：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；

ROBO1基因：正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；

TTR基因：正向引物如SEQ ID NO.7所示，反向引物如SEQ ID NO.8所示；

LGR5基因：正向引物如SEQ ID NO.9所示，反向引物如SEQ ID NO.10所示；

IGF2BP3基因：正向引物如SEQ ID NO.11所示，反向引物如SEQ ID NO.12所示；

TBR1基因：正向引物如SEQ ID NO.13所示，反向引物如SEQ ID NO.14所示；

ZFPM2基因：正向引物如SEQ ID NO.15所示，反向引物如SEQ ID NO.16所示；

TRDC基因：正向引物如SEQ ID NO.17所示，反向引物如SEQ ID NO.18所示；

TRAC基因：正向引物如SEQ ID NO.19所示，反向引物如SEQ ID NO.20所示；

PEX5L基因：正向引物如SEQ ID NO.21所示，反向引物如SEQ ID NO.22所示；

NKD1基因：正向引物如SEQ ID NO.23所示，反向引物如SEQ ID NO.24所示；

RALYL基因：正向引物如SEQ ID NO.25所示，反向引物如SEQ ID NO.26所示；

作为本发明优选的技术方案，所述PCR引物组还包括：

GABRA5基因：正向引物如SEQ ID NO.27所示，反向引物如SEQ ID NO.28所示；

GAD1基因：正向引物如SEQ ID NO.29所示，反向引物如SEQ ID NO.30所示；

TNC基因：正向引物如SEQ ID NO.31所示，反向引物如SEQ ID NO.32所示；

KCNA1基因：正向引物如SEQ ID NO.33所示，反向引物如SEQ ID NO.34所示；

EOMES基因：正向引物如SEQ ID NO.35所示，反向引物如SEQ ID NO.36所示；

MAB21L2基因：正向引物如SEQ ID NO.37所示，反向引物如SEQ ID NO.38所示；

WIF1基因：正向引物如SEQ ID NO.39所示，反向引物如SEQ ID NO.40所示；

DKK2基因：正向引物如SEQ ID NO.41所示，反向引物如SEQ ID NO.42所示；

PDLIM3基因：正向引物如SEQ ID NO.43所示，反向引物如SEQ ID NO.44所示；

IMPG2基因：正向引物如SEQ ID NO.45所示，反向引物如SEQ ID NO.46所示；

KHDRBS2基因：正向引物如SEQ ID NO.47所示，反向引物如SEQ ID NO.48所示。

上述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）将包含肿瘤组织的生物学样品与生物标志物接触；

（2）测定所述标志物在该生物学样品中的表达水平；

（3）检测生物学样品中基因的表达模式，并将其与髓母细胞瘤基因表达谱数据库进行比对。

所述试剂盒检测的表达可以通过实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），或者基因芯片，或者高通量测序技术。

所述的试剂盒检测的表达水平是mRNA表达水平。

仅作为本发明上述补助的例子，针对石蜡包埋髓母细胞瘤组织，利用实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），区分髓母细胞瘤亚型的方法，包含以下步骤：

（1）获取髓母细胞瘤组织的石蜡包埋组织；

（2）以实时定量逆转录聚合酶链式反应检测该样品中24个基因的表达；

（3）检测该样品中24个基因的表达模式，并将其与髓母细胞瘤基因表达谱数据进行比对，区分髓母细胞瘤亚型。

在本发明另一方面，提供所述的试剂盒在制备判断髓母细胞瘤亚型的制剂中的用途。

在本发明另一方面，提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因在制备用于判断髓母细胞瘤亚型的基因芯片中的应用，所述基因芯片包括固相载体和探针，所述探针与待测13个基因序列和/或其互补序列进行杂交，待测13个基因为：EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因。所述探针分别是SEQ ID NO.49 ～ SEQ ID NO.61所示序列。

在本发明另一方面，提供一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因在制备用于判断髓母细胞瘤亚型的基因芯片中的应用，所述基因芯片包括固相载体和探针，所述探针与待测24个基因序列和/或其互补序列进行杂交，待测24个基因为：EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因、GABRA5基因、GAD1基因、TNC基因、KCNA1基因、EOMES基因、MAB21L2基因、WIF1基因、DKK2基因、PDLIM3基因、IMPG2基因、KHDRBS2基因。所述探针分别是SEQ IDNO.49 ～ SEQ ID NO.72所示序列。

本发明构建髓母细胞瘤分子分型标志物，通过检测24个与髓母细胞瘤相关的基因，区分髓母细胞瘤亚型，即WNT型（WNT subgroup）、SHH型（Sonic Hedgehog Subgroup）、Group3型（Group3）和 Group4型（Group4）。辅助医生进行临床决策，实现精准医疗，以提高髓母细胞瘤患者的治疗效果和生存质量。经临床验证，本发明所提供的试剂盒能准确区分髓母细胞瘤亚型，即WNT型（WNT subgroup）、SHH型（Sonic Hedgehog Subgroup）、Group3型（Group3）和 Group4型（Group4），其适用范围广、准确率高，实验周期短，对患者进行精准治疗具有重要的临床意义。

与现有技术（基因芯片和NanoString两组方法）相比，本发明的有益效果在于：

本发明采用“大数据和算法驱动”的分析技术，选取对于髓母细胞瘤分子亚型高特异性的基因组合。发明人构建了髓母细胞瘤基因表达谱数据库，包含人类已知20250个基因、461例样品，约一千万个数据点。将每个样本中人类2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据关联起来，然后通过统计分析方法方差检验来筛选髓母细胞瘤特异基因，即分析每个基因与髓母细胞瘤分子亚型的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因。最终筛选得到24个基因用于构建分类模型。根据机器学习的一般性原理，24个基因组合是人类已知的2万多个基因中与髓母细胞瘤发生关系最密切的基因，因此具有良好的特异性。

由于本发明提供的24基因组合具有良好的特异性，因此可通过石蜡包埋组织中非常微量的肿瘤细胞检测到髓母细胞瘤特异基因的表达，并且很好地克服石蜡组织中RNA降解的干扰，通过经典的两步法PCR（逆转录+扩增）即可完成检测。本发明所提供的方法无需采用新鲜手术样本以及实验过程繁琐、检测费用昂贵的基因芯片和NanoString nCounterTechnology等检测平台，适用范围广、准确率高，检测成本低，可充分满足在我国大规模临床推广的要求，达到了现有方法所预料不到的技术效果。

经验证，本发明能准确区分髓母细胞瘤WNT型、SHH型、Group3型和Group4型，其结果判读客观、准确率高，实验周期短，对患者进行精准治疗具有重要的临床意义。

综上所述，发明人通过创造性劳动，提供了一组髓母细胞瘤分子分型的基因组合及检测试剂盒，该系统具有特异性好、检测准确率高、适用范围广和检测成本低的优势，能够较好地满足临床对于髓母细胞瘤分子分型的迫切需求。

附图说明

图1是本发明实施例6中24基因髓母细胞瘤诊断的判别结果示意图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明书发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范作用。

实施例1.

训练集样本收集及处理：

本发明首先分析了103例的髓母细胞瘤患者临床数据及其生物学样品基因芯片检测数据，其中包括8例WNT型、33例SHH型、27例Group3型和35例 Group4型患者的相关临床资料和20250个基因的表达丰度数据，构建髓母细胞瘤基因表达数据库。

13个特异性基因的筛选：

根据基因表达丰度的测量值，发明人采用统计分析方法方差分析从20250个基因中刷选出13个与髓母细胞瘤分型密切相关的基因。这些基因在髓母细胞瘤各亚型中存在差异性表达，具有统计学意义（P值＜0.0001），见表2。

表2：13基因集合

13基因基于统计分析模型的构建：

基于13个特异基因在103例髓母细胞瘤样本中的表达模式，发明人采用支持向量机（Support Vector Machines）算法，建立统计分析模型用于判别髓母细胞瘤亚型。对于每一例待测样本，模型计算该样品基因表达模式与数据库中WNT型、SHH型、Group3型和Group4型的相似度分数，并根据相似度分数最大原则判别该样本的肿瘤亚型。自1992年发明以来，支持向量机算法已被广泛地应用于解决各类识别问题，包括金融数据分析、语音识别和生物数据分析。本领域的技术人员可通过开源免费的分析软件，例如：R、Rapidminer和WEKA使用支持向量机算法。不仅仅局限于支持向量机算法，其他告知的数据挖掘方法都可采用，例如加权投票（Weighted Voting）、K-最邻近值（K-nearest Neighbors）、随机森林（Random Forest）、相关性系数（Correlation Coefficients）等。

实施例2.

高通量测序数据验证：

本实施例中，发明人分析了包含73例髓母细胞瘤的高通量测序数据，其中有8例WNT型、10例SHH型、16例Group3型和39例Group4型。通过13基因统计分析模型对每个样品进行亚型的判别，并与临床诊断结果比较，诊断符合率为75.3%。以SHH型为参照，分型的灵敏度为100.0%，特异度为93.7%，详见表3和表4。

表3：13基因模型在73例高通量测序数据中的分类结果

表4：13基因模型在73例高通量测序数据中的性能指标

实施例3.

本实施例中，发明人对285例髓母细胞瘤石蜡组织样本进行分子分型实验，其中SHH型51例、Group3型46例和 Group4型188例。实验人员用手工刮片的方式从福尔马林固定石蜡包埋的组织块上收集髓母细胞瘤富集区，并提取总RNA；用DNase处理以确保完全去除基因组DNA的污染；经逆转录后获得cDNA，进行13基因的实时定量聚合酶链反应(real-timequantitative polymerase chain reaction，RTQ-PCR)检测石蜡包埋肿瘤组织中基因的表达水平，分析模型计算该样本与髓母细胞瘤亚型的相似度分数。

通过13基因统计分析模型对每个样品亚型的判别，并与临床诊断结果相比较，诊断符合率为78.2%。以SHH型为参照，预测的灵敏度为98.0%，特异度为99.6%，见表5和表6。

表5：13基因模型在285例QPCR实验数据集中的分类结果和性能指标

表6：13基因模型在285例QPCR实验数据集中的性能指标

实施例4.

24个特异性基因的筛选：

发明人将F检验的筛选标准放宽至P值小于0.001，进一步得到额外的11个基因。这些基因在髓母细胞瘤各亚型中存在差异性表达，差异具有统计学意义，详细见表7。将这11个基因与实施例1中的13个基因合并，组成24基因集合。

表7：11基因集合

24基因基于统计分析模型的构建：

基于24个特异基因在103例髓母细胞瘤样本中的表达模式，发明人采用支持向量机（Support Vector Machines）算法，建立统计分析模型用于判别髓母细胞瘤亚型。对于每一例待测样本，模型计算该样品基因表达模式与数据库中WNT型、SHH型、Group3型和Group4型的相似度分数，并根据相似度分数最大原则判别该样本的肿瘤亚型。

实施例5.

高通量测序数据验证：

本实施例中，发明人分析了包含73例髓母细胞瘤的高通量测序数据，其中有8例WNT型、10例SHH型、16例Group3型和39例Group4型。通过24基因统计分析模型对每个样品进行亚型的判别，并与临床诊断结果比较，诊断符合率为91.8%。相比于实施例2的13基因模型的诊断符合率为75.3%，24基因的诊断符合率有显著提升，该诊断符合率从75.3%显著提升到91.8%是本领域技术人员无法预期的，达到了预料不到的技术效果。以SHH型为参照，分型的灵敏度为100.0%，特异度为100.0%，详见表8和表9。

表8：24基因模型在73例高通量测序数据中的分类结果

表9：24基因模型在73例高通量测序数据中的性能指标

实施例6.

本实施例中，发明人对285例髓母细胞瘤石蜡组织样本进行分子分型实验，其中SHH型51例、Group3型46例和 Group4型188例。实验人员用手工刮片的方式从福尔马林固定石蜡包埋的组织块上收集髓母细胞瘤富集区，并提取总RNA；用DNase处理以确保完全去除基因组DNA的污染；经逆转录后获得cDNA，进行24基因的实时定量聚合酶链反应(real-timequantitative polymerase chain reaction，RTQ-PCR)检测石蜡包埋肿瘤组织中基因的表达水平，分析模型计算该样本与髓母细胞瘤亚型的相似度分数。

通过24基因统计分析模型对每个样品亚型的判别，并与临床诊断结果相比较，诊断符合率为96.5%。相比于实施例3的13基因模型78.2%的诊断符合率，24基因的诊断符合率有显著提升，该诊断符合率从78.2%显著提升到96.5%是本领域技术人员无法预期的，达到了预料不到的技术效果。以SHH型为参照，预测的灵敏度为100.0%，特异度为98.7%，见表10和表11。

表10：24基因模型在285例QPCR实验数据集中的分类结果和性能指标

表11：24基因模型在285例QPCR实验数据集中的性能指标

设计24个基因的PCR引物组分别如下：

24个基因的探针序列分别如下表12所示：

表12

结果如图1所示，SHH型、WNT型、Group 3型、 Group4型的相似度分数分别为91.2、5.0、2.0、1.8。由于SHH型最高，因此该样本被判定为SHH型，与临床诊断结果相符。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110>杭州可帮基因科技有限公司

<120>一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用

<130> WH-NP-18-100013

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

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tctagggata actgctcatg attactccca 30

Claims

1.一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，其特征在于，为如下13个基因：EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因采用如下方法筛选得到：采用“大数据和算法驱动”的分析技术，选取对于髓母细胞瘤高特异性的基因组合；首先构建髓母细胞瘤基因表达谱数据库，包含人类已知20250个基因、461例样品，近1000万个数据点，将每个样本中人类2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据关联起来，然后通过统计分析方法方差检验来筛选髓母细胞瘤特异基因，即分析每个基因与髓母细胞瘤分子亚型的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因，最终筛选得到13个基因用于构建分类模型。

3.一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因，其特征在于，为如下24个基因：GABRA5基因、GAD1基因、TNC基因、KCNA1基因、EOMES基因、MAB21L2基因、WIF1基因、DKK2基因、PDLIM3基因、IMPG2基因、KHDRBS2基因、EPHA7基因、OTX2基因、ROBO1基因、TTR基因、LGR5基因、IGF2BP3基因、TBR1基因、ZFPM2基因、TRDC基因、TRAC基因、PEX5L基因、NKD1基因、RALYL基因；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因采用如下方法筛选得到：采用“大数据和算法驱动”的分析技术，选取对于髓母细胞瘤高特异性的基因组合；首先构建髓母细胞瘤基因表达谱数据库，包含人类已知20250个基因、461例样品，近1000万个数据点，将每个样本中人类2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据关联起来，然后通过统计分析方法方差检验来筛选髓母细胞瘤特异基因，即分析每个基因与髓母细胞瘤分子亚型的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因，最终筛选得到24个基因用于构建分类模型。

5.检测如权利要求1-4任一项所述的一组用于检测髓母细胞瘤分子分型的基因的试剂在制备用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒中的应用。

6.一种用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含检测如下生物标志物的PCR引物组，所述生物标志物选自权利要求1-2任一项所述的一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型；所述PCR引物组为：

RALYL基因：正向引物如SEQ ID NO.25所示，反向引物如SEQ ID NO.26所示。

7.一种用于髓母细胞瘤分子分型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含检测如下生物标志物的PCR引物组，所述生物标志物选自权利要求3-4任一项所述的一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型；所述PCR引物组为：

8.如权利要求6-7任一项所述的试剂盒在制备判断髓母细胞瘤亚型的制剂中的用途。

9.检测如权利要求1所述的一组用于检测髓母细胞瘤分子分型的基因的探针在制备用于判断髓母细胞瘤亚型的基因芯片中的应用，所述基因芯片包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测13个基因序列和/或其互补序列进行杂交，EPHA7基因对应的探针是SEQ ID NO.49所示序列；OTX2基因对应的探针是SEQ ID NO.50所示序列；ROBO1基因对应的探针是SEQ ID NO.51所示序列、TTR基因对应的探针是SEQ ID NO.52所示序列、LGR5基因对应的探针是SEQ ID NO.53所示序列、IGF2BP3基因对应的探针是SEQ ID NO.54所示序列、TBR1基因对应的探针是SEQ ID NO.55所示序列、ZFPM2基因对应的探针是SEQ ID NO.56所示序列、TRDC基因对应的探针是SEQ ID NO.57所示序列、TRAC基因对应的探针是SEQ IDNO.58所示序列、PEX5L基因对应的探针是SEQ ID NO.59所示序列、NKD1基因对应的探针是SEQ ID NO.60所示序列、RALYL基因对应的探针是SEQ ID NO.61所示序列；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型。

10.检测如权利要求3所述的一组用于检测髓母细胞瘤分子分型的基因的探针在制备用于判断髓母细胞瘤亚型的基因芯片中的应用，所述基因芯片包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测24个基因序列和/或其互补序列进行杂交，EPHA7基因对应的探针是SEQ ID NO.49所示序列；OTX2基因对应的探针是SEQ ID NO.50所示序列；ROBO1基因对应的探针是SEQ ID NO.51所示序列、TTR基因对应的探针是SEQ ID NO.52所示序列、LGR5基因对应的探针是SEQ ID NO.53所示序列、IGF2BP3基因对应的探针是SEQ ID NO.54所示序列、TBR1基因对应的探针是SEQ ID NO.55所示序列、ZFPM2基因对应的探针是SEQ ID NO.56所示序列、TRDC基因对应的探针是SEQ ID NO.57所示序列、TRAC基因对应的探针是SEQ IDNO.58所示序列、PEX5L基因对应的探针是SEQ ID NO.59所示序列、NKD1基因对应的探针是SEQ ID NO.60所示序列、RALYL基因对应的探针是SEQ ID NO.61所示序列；GABRA5基因对应的探针是SEQ ID NO.62所示序列；GAD1基因对应的探针是SEQ ID NO.63所示序列；TNC基因对应的探针是SEQ ID NO.64所示序列；KCNA1基因对应的探针是SEQ ID NO.65所示序列；EOMES基因对应的探针是SEQ ID NO.66所示序列；MAB21L2基因对应的探针是SEQ ID NO.67所示序列；WIF1基因对应的探针是SEQ ID NO.68所示序列；DKK2基因对应的探针是SEQ IDNO.69所示序列；PDLIM3基因对应的探针是SEQ ID NO.70所示序列；IMPG2基因对应的探针是SEQ ID NO.71所示序列；KHDRBS2基因对应的探针是SEQ ID NO.72所示序列；所述髓母细胞瘤分子分型为WNT型、SHH型、Group3型和Group4型。