CN104968802B - 作为诊断标志物的新miRNA - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于疾病(特别是神经元病症，如阿尔茨海默氏病(AD))的诊断或治疗的新的miRNA标志物。

Description

作为诊断标志物的新miRNA
本发明涉及新的miRNA标志物及其用途。具体地，本发明涉及可用于疾病(特别是神经元病症，如阿尔茨海默氏病(AD))的诊断或治疗的新的miRNA标志物。
发明背景
最近，分子诊断学的重要性已经日趋增加。已发现步入疾病的临床诊断中(尤其是，传染性病原体的检测、基因组的突变的检测、患病细胞的检测和疾病的诱因的风险因子的鉴定)。
尤其是，通过确定组织中的基因表达，核酸分析在疾病的研究和诊断中打开非常有希望的新的可能性。
待检测的感兴趣核酸包括基因组DNA、表达的mRNA和其他RNA诸如微小RNA(简称miRNA)。miRNA是具有多种生物功能的新一类小RNA(A.Keller等人,Nat Methods.20118(10):841-3)。它们是见于真核细胞中的短的(平均具有20-24个核苷酸)核糖核酸(RNA)分子。已在哺乳动物中鉴定了几百个不同种类的微小RNA(即，几百个不同的序列)。它们对于转录后基因调控是重要的，并与靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列相结合，这可导致翻译阻抑或靶物降解和基因沉默。因此，它们还可用作研究、诊断和治疗目的的生物标志物。
定义
除非另外定义，本文所用的技术和科学术语与本发明所属领域技术人员所通常理解的含义相同。
术语“核酸分子”是指具有确定的序列的多核苷酸分子。它包含DNA分子、RNA分子、核苷酸类似物分子以及它们的组合，如掺入了核苷酸类似物的DNA分子或RNA分子。
术语“标志物”或“生物标志物”指可检测其存在或浓度并与已知状况(比如疾病状态)或与临床结果(比如对治疗的应答)相关联的生物分子，例如，核酸、肽、蛋白、激素等。
术语“评估生理和/或病理状况”包括分类患有或有风险形成病理状况的患者的样品，筛选病理状况的存在或形成病理状况的风险，预测形成病理状况的风险，或预测患有或有风险形成病理状况的患者中的病理状况结果。
如本文所用，术语“预测病理状况或疾病的结果”意指包括经历给定治疗的患者的结果预测和未经治疗的患者的预后两者。
本发明的含义中的“结果”是在疾病的进程中获得的限定状况。此疾病结果可以例如是临床状况诸如“疾病的复发”、“疾病的消退”、“对治疗的应答”，疾病阶段或等级或类似状况。
“风险”被理解为受试者或患者发生或达到某种疾病结果的可能性。在本发明的上下文中，术语“风险”并不意在指就患者的健康而言携带任何积极含义或消极含义，而仅指发生或形成既定事件或状况的或然性或可能性。
术语“临床数据”指与患者的健康状况相关的可用数据和信息的总体，包括但不限于年龄、性别、重量、绝经期/激素状况、疾病发生学数据、既往病例(anamnesis)数据、通过体外诊断方法诸如血检或尿检获得的数据、通过成像方法获得的数据，比如x-射线、计算机断层摄影术、MRI、PET、spect、超声、电生理学数据、遗传分析、基因表达分析、活组织检查评估、手术内发现。
如本文所用的，术语患者的“样品的分类”指所述样品与至少两类的至少一种的关联。这些种类可以是例如“高风险”和“低风险”，高、中等和低风险；其中风险是在某个时期中发生某个事件的似然性，例如，疾病的发生、疾病的进程等。它可进一步意为疾病的有利的或不利的临床结果、对给定治疗的反应性或非反应性等的种类。分类可通过利用算法(尤其是判别函数)来进行。算法的简单例子是根据第一定量参数的分类，例如，高于或低于某个阈值的感兴趣核酸的表达水平。患者样品的分类可用于预测疾病的结果或发生疾病的风险。代替利用感兴趣的单一核酸的表达水平，可使用感兴趣的若干核酸的组合评分。此外，可将另外的数据与第一定量参数组合使用。所述另外的数据可以是来自患者的临床数据，比如性别、年龄、患者的重量、疾病分级等。
“判别函数”是用于分类对象或事件的一组变数的函数。因此，判别函数允许根据可从患者、样品或事件可获得的数据或参数将所述患者、样品或事件分类为一个种类或多个种类。该分类是本领域技术人员熟知的统计学分析的标准手段。例如，根据从所述患者、样品或事件中获得的数据可将患者分类为“高风险”或“低风险”、“需要治疗”或“不需要治疗”或其它种类。分类不限于“高对低”，而是可以实施分类成多个种类、分级等。允许分类的判别函数的例子包括但不限于由支持向量机(support vector machine,SVM)、k-最近邻(k-nearest-neighbor,kNN)、(朴素(naive))贝叶斯模型定义的判别函数，或分段定义的函数，诸如例如在子集发现、决策树、数据的逻辑分析(LAD)等中的。
术语“表达水平”指例如感兴趣核酸的确定的水平表达。术语“表达水平的模式(pattern)”指与来自参照核酸(例如来自对照)相比较，或与计算的平均表达值(例如在DNA芯片分析中)相比较的确定的表达水平。模式不限于两种基因的比较，而且还涉及基因与参照基因或样品的多重比较。某个“表达水平的模式”也可作为结果并通过下文公开的感兴趣的若干核酸的比较和测量来确定，并展示出这些转录物彼此的相对丰度。表达水平还可相对于不同组织，患者对健康对照等中的表达来评价。
本发明的含义中的“表达水平的参照模式”应理解为可用于与另一表达水平模式相比较的任何表达水平模式。在本发明的一个优选的实施方案中，表达水平的参照模式是例如在充当参照组的一组健康或患病个体中观察到的平均表达水平模式。
在本发明的上下文中，“样品”或“生物样品”是源自生物学生物体或已同生物学生物体相接触的样品。生物样品的例子是：细胞、组织、体液、活组织检查样本、血液、尿液、唾液、痰液、血浆、血清、细胞培养上清液，和其他。
“探针”是能够与特定生物分子特异性结合或相互作用的分子或物质。术语“引物”、“引物对”或“探针”应具有分子生物学领域技术人员已知的这些术语的常规含义。在本发明的优选的实施方案中，“引物”、“引物对”和“探针”指具有下述序列的寡核苷酸或多核苷酸分子，所述序列与待检测或定量的靶分子或靶序列的区域相同、互补、作为该区域的同源物、或同源，从而引物、引物对或探针可特异性地与靶分子结合，所述靶分子例如，待检测或待定量的靶核酸、RNA、DNA、cDNA、基因、转录物、肽、多肽或蛋白。如本文所理解的，引物可自身发挥探针功能。如本文所理解的，“探针”还可包含例如引物对和内部标记探针的组合，其是许多商品化qPCR方法中所常见的。
“miRNA”是短的、天然存在的RNA分子，并应具有本领域技术人员所理解的一般含义。“源自miRNA的分子”是以化学方法或酶促方法获自miRNA模板的分子，比如cDNA。
术语“阵列”指装置(例如，芯片装置)上可寻址的位置的排列。位置的数目可从几个变化到至少几百或几千个。每个位置代表独立的反应位点。阵列包括但不限于核酸阵列、蛋白阵列和抗体阵列。“核酸阵列”指含有核酸探针(比如寡核苷酸、多核苷酸或基因的较大部分)的阵列。阵列上的核酸优选为单链的。“微阵列”指生物芯片或生物学芯片，即具有至少约100/cm2密度的含固定探针的离散区域的区域阵列。
“基于PCR的方法”指包含聚合酶链式反应PCR的方法。这是通过利用一种、两种或更多种引物在体外酶促复制指数扩增核酸(例如DNA或RNA)的方法。对于RNA扩增，可使用逆转录作为第一步。基于PCR的方法包含动力学或定量PCR(qPCR)，其特别适宜于分析表达水平)。当其实现表达水平的确定时，可例如使用基于PCR的方法以检测给定mRNA的存在，其通过(1)在逆转录酶的协助下将完整的mRNA库(所谓的转录物组)逆转录为cDNA，并(2)在相应的引物的协助下检测给定cDNA的存在进行。该方法通常称作逆转录酶PCR(rtPCR)。术语“基于PCR的方法”包含端点PCR应用及应用特别的荧光团或嵌入染料的动力学/实时PCR技术，所述荧光团或嵌入染料发射荧光信号作为扩增的靶标的函数，并允许进行靶标的监测和定量。定量方法可以根据外部标准曲线是绝对的或相对于比较性内部标准品。
术语“下一代测序”或“高通量测序”指使测序方法平行化，一次产生几千个或几百万个序列的高通量测序技术。例子包括大规模平行标签测序(Massively ParallelSignature Sequencing,MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序。
发明目的
本发明根据的技术问题的根本是提供新的生物标志物及其用途。
发明概述
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的方法的过程步骤的特定的组分部分，因为这样的方法可能变化。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并不意在进行限制。必须注意的是，除非文中另外清楚地指明，如本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一(a/an)”、“该”包括单数和/或复数指代物。还应理解的是，除非文中另外清楚指明，复数形式包括单数和/或复数指代物。更应理解的是，在给出由数值划定的参数范围的情况下，视为该范围包括这些限值。
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含
(a)核苷酸序列，其选自：具有根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：365的序列的核苷酸序列，
(b)作为其互补物的核苷酸序列，或
(c)核苷酸序列，其与(a)或(b)的序列具有至少90％的同一性。
根据本发明的一个方面，核酸分子选自RNA、DNA或核酸类似物分子。
根据本发明的一个方面，核酸分子包含至少一个经修饰的核苷酸类似物。
根据本发明的一个方面，核酸分子是表达载体。
本发明还提供在本发明的至少一种核酸分子用于评估受试者的生理和/或病理状况的用途。
根据本发明的一个方面，用途可进一步包括在所述受试者的所述样品中测定所述核酸分子的表达水平的步骤。
根据本发明的一个方面，样品可以是血液样品。
根据本发明的一个方面，评估生理和/或病理状态包括分类患有或有风险形成病理状况的患者的样品，预测形成病理状况的风险，或预测患有或有风险形成病理状况的患者中的病理状况结果。
根据本发明的一个方面，用途还可以包括将表达水平或表达水平的模式与一个或几个表达水平参照模式比较以及从比较结果评估生理和/或病理状况的步骤。
本发明还提供包含本发明的至少一种核酸分子的药物组合物。
本发明还提供了本发明的组合物用于诊断和/或治疗应用的用途。例如，可以在生物样品，例如在组织切片，血液样品，血清样品或其他中检测miRNA，以便确定和分类某些细胞类型或组织类型或以miRNA分子或miRNA分子模式的差异表达为特征的miRNA相关病原性病症。此外，可以通过测定短暂表达的miRNA分子对细胞的发育阶段分类。
此外，所要求保护的核酸分子适合于治疗应用。例如，可将核酸分子用作发育过程或与发育功能障碍有关的病症，例如癌代谢疾病、变性性疾病等的调节剂或靶标。
一般地，可将所要求保护的核酸分子用作基因表达的调节剂，所述基因至少部分地与所述核酸互补。此外，miRNA分子的作用可以为治疗筛选程序的靶标，即抑制或激活miRNA分子可以调节细胞分化过程，例如细胞凋亡。
本发明还提供试剂盒，其包括用于测定本发明的至少一种核酸分子的存在和/或表达水平的量的手段(means)。
发明详述
本发明的目的的其他细节，特征和优点进一步公开于下面的说明书和各个实施例的附图中，所述实施例以示例性方式显示了本发明优选的实施方案。然而，这些实施例绝不应当理解为限制本发明的范围。
本发明提供了血细胞中存在的非常罕见的miRNA变体。已经在无偏方法(unbiasedapproach)中与健康对照比较阿尔茨海默症患者和患有其它神经元疾病的患者的样品中miRNA的丰度。这种方法涉及对来自样品的miRNA测序的巨大努力，因而开启了在现有技术中尚未描述过的新标志物的发现。
在附图中
图1显示了本发明的新的核酸分子miRNA标志物对血液中已知的miRNA标志物的分布；和
图2显示了在具有不同神经元病症的患者和对照的不同样品中，本发明的第一示例性新的核酸分子miRNA标志物的delta CT值。
图3显示了在具有不同神经元病症的患者和对照的不同样品中，本发明另外的示例性新的核酸分子miRNA标志物的delta CT值。
材料和方法
患者分组(cohort)
通过NGS或qRT-PCR或该二者确定了总共219位患者和健康对照的外周血中的miRNA的表达。从患有阿尔茨海默氏病(AD)的患者(n＝106)、患有轻度认知障碍(MildCognitive Impairment,MCI)的患者(n＝21)、患有多发性硬化(临床孤立综合征(CIS))的患者(n＝17)、患有帕金森氏病(PD)的患者(n＝9)、患有轻度抑郁(DEP)的患者(n＝15)、患有双相型障碍(bipolar disorder,DEP)的患者(n＝15)、以及健康对照(n＝22)中获得了血液。
首先，通过下一代测序分析了来自AD患者(n＝48)、MCI患者(n＝20)和健康对照(n＝22)的样品。为了验证的目的，若可获得足够的RNA，利用qRT-PCR在与NGS所用相同的样品中分析了单一miRNA的表达。通过来自患有AD、CIS、PD、DEP、BD和Schiz的患者的进一步样品进一步扩大了样品的数目，产生通过qRT-PCR分析的总共205个样品。详细地，分析了来自AD患者的总共95个样品、来自MCI患者的19个样品、来自CIS患者的17个样品、来自PD患者的9个样品、来自DEP患者的15个样品、来自BD患者的15个样品、来自Schiz患者的14个样品和来自健康对照的21个样品。
RNA分离
利用PAXgene血液miRNA试剂盒(Qiagen)按照制造商的推荐分离了包含miRNA的总RNA。将分离的RNA于-80℃贮存。利用Bioanalyzer 2100(Agilent)分析RNA完整性并利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测量浓度和纯度。总共4个样品(三个对照和一个RRMS)不符合质量标准，并且排除在研究之外。
文库制备和下一代测序
为进行文库制备，每样品使用了200ng的总RNA，如在生物分析仪(Bioanalyzer)2100(Agilent)上利用RNA 6000Nano Chip所确定的。按照TruSeq Small RNA Sample PrepKit(Illumina)的方案进行制备。在生物分析仪上利用DNA 1000芯片测量了制备好的文库的浓度。然后将文库以相等的量合并于6个样品的批次中，并利用cBot(Illumina)将以9pmol的浓度聚簇于单独的读取流动池(flowcell)的各一道中。在HiSeq 2000(Illumina)上进行50个循环的测序。利用CASAVA v.1.8.2进行原始测序数据的多路分解(demultiplexing)和fastq文件的生成。
NGS数据分析
利用来自FASTX-Toolkit的程序fastx_clipper(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)通过切割3’接头序列首先预处理原始illumina读段。消除剪取后短于18nt的读段。将剩余的读段简化成独特读段(unique read)和每份样品的其频率以使得定位(mapping)步骤更具时效性。对于剩余的步骤，我们使用了miRDeep2管线(pipeline)。这些步骤由以下组成：相对于基因组(hg19)定位读段，相对于来自mirbase v18版的miRNA前体序列定位读段，将样品的计数相加，并预测新颖的miRNA。由于miRDeep2管线预测了每份样品的新颖miRNA，随后按如下合并miRNA：首先，提取每份样品具有大于10的信噪比的新颖miRNA。随后，仅合并位于相同染色体上的那些新颖的miRNA，且它们成熟的形式都共享至少11个核苷酸的重叠。
生物信息学分析
首先利用标准的分位数标准化将读段计数标准化。将具有少于50个读段计数的所有miRNA从进一步考虑中排除。然后，我们对每个miRNA计算了接受者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve)下面积(AUC)、倍数变化，和利用t-检验的显著性值(p值)。利用Benjamini Hochberg方法调节所有显著性值以进行多重测试。利用免费可得的工具R已进行生物信息学分析。此外，我们利用TAM工具(http://202.38.126.151/hmdd/tools/tam.html)进行了miRNA富集分析。
结果
使用高通量测序筛选
本发明提供了存在于血液细胞中的非常罕见的miRNA变体。虽然常见的变体已经被发现并且与从组织活检发现的miRNA重度重叠，但是预期仍然未知miRNA的实质部分。此处，表征了患有神经学病症，包括轻度认知障碍、阿尔茨海默症或多发性硬化的患者以及未受影响的对照。产生了来自患者和对照样品的约20亿个序列，其中大约14亿与已知的或预测的新的miRNA匹配。如图1中详述的，这些序列中的绝大多数匹配已知的miRNA(99.9％)，而只有约0.1％匹配预测的新的miRNA，这指出了为什么必须使用巨大的测序能力。已经发现可以将这些新的miRNA用作指示疾病状况，如神经元疾病，例如阿尔茨海默症的诊断标志物。
最丰富的miRNA是具有对该miRNA定位的13,886,676的平均读段计数和总共12亿个读段的hsa-miR-486-5p，具有对该miRNA定位的平均575,359个读段和总共5200万个读段的hsa-miR-92a-3p，和具有对该miRNA定位的平均135,012个读段和总共1200万个读段的miR-451a。
另外，检测到先前不存在于Sanger miRBase中的365个新的成熟miRNA候选者。然而，这些miRNA候选者一般与已知的人类miRNA相比较丰度已经是少得多的。检测到最丰富的，表示为脑-miR-314，平均每份样品具有3,587个读段和总共322,868个读段。第二位高的表达miRNA脑-miR-247以平均3,112个读段且总共为280,115个读段存在，第三位丰富的miRNA脑-miR-12以平均2,630个读段和总共236,728个读段存在。在所列全部中，新颖的且已知的miRNA脑-miR-314将排在37位，即36个已知的人类miRNA将比最丰富的新颖的miRNA更丰富。虽然总共14亿个读段定位于已知的miRNA，但是仅230万个定位于新颖的miRNA候选者。此关联显示了需要极高的测序容量来实现灵敏性以在人类血液样品中检测罕见的新颖miRNA变体。
图1中的条形图在对数尺度上显示了大约14亿个读段对新的及已知的miRNA的分布。如该图概述，大致99.9％属于已知的miRNA，这强调了a)选择正确的生物来源，即血液细胞和b)对于发现新标志物，超高的灵敏度是关键的。
值得注意的是，成熟的miRNA源于约120个碱基长度的miRNA前体分子。存在几个实例，其中miRNA前体彼此不同，而属于成熟miRNA的大约20个碱基的亚类是相同的。因此，新的成熟miRNA可以具有相同的序列但不同的SEQ ID NO标识符。
表1：新的miRNA标志物
这365个miRNA标志物具有在所附序列表中的对应序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:365。在具有阿尔茨海默症(AD)的受试者和健康对照中比较了这些新的miRNA标志物。
为检测潜在的生物标志物候选者，例如比较了阿尔茨海默症患者和对照的表达水平，计算双尾t-检验和利用Benjamini Hochberg校正来校正的多重测试的显著值(Todetect potential biomarker candidates two-tailed t-tests and adjusted thesignificance values for multiple testing using Benjamini Hochberg adjustmentwere computed)。认为具有小于0.05的校正显著值的所有标志物是统计学显著的。另外，计算了接受者操作者特征曲线下面积(AUC)以理解miRNA用于阿尔茨海默氏病诊断的特异性和灵敏性。总之，检测出58个显著失调的miRNA，48个标志物在阿尔茨海默氏病中显著上调，而10个是显著下调的。相应标志物的列表呈现于表2和3中。
表2：上调的标志物
表3：下调的标志物
除了单一标志物，多种标志物的组合已经证明改善诊断准确性的潜力。
通过q-RT-PCR对标记(signature)的验证
为了将标记转移至临床常规背景，必要的是可以在合理的时间利用标准设备将所提出的体外诊断检验应用于分子诊断学实验室。为此目的，qRT-PCR代表了适宜的方案以利用该方法重复并验证标记。除了测量仅对照、AD和MCI患者之外，还包括了许多其他神经学疾患。
首先，通过下一代测序比较和分析了初始筛查分组的倍数商，并通过qRT-PCR将其与相同miRNA的表现相比较。对于下一代测序筛查方法，对于验证qRT-PCR分组计算了AUC值。最佳的单独miRNA是脑-miR 112，具有87.5％的AUC。
虽然对照值达到0.087的平均值和0.72的标准偏差，对于MCI患者达到了0.22的平均值和0.74的标准偏差，但是AD患者在0.64的标准偏差时达到了高得多的得分0.63。
其他神经学病症的得分
对于2个不同的miRNA(脑-mir-161和脑-mir-112)，证明了这些miRNA具有区分阿尔茨海默症和对照(P<0.05)，以及区分大部分其他神经学病症的显著信息量，提供了它们作为一般疾病标志物的的证据(图2和图3)。
因此，显示了本发明的核酸分子可用于评估受试者的生理和/或病理状况。
此外，本发明的核酸分子可用于制备药物组合物。
这种组合物可用于诊断和/或治疗应用中，例如来诊断或监测疾病，或调节基因表达。
此外，本发明的核酸分子可以用于试剂盒，其包含用于确定本发明的至少一种核酸分子的存在和/或表达水平的量的手段。这样的试剂盒可包含用于检测和/或定量本发明的至少一种核酸分子的探针或一组探针，例如作为用于PCR检测的一组引物/探针的一部分，作为基于阵列的检测或基于杂交的检测的探针。

Claims (14)

1.分离的核酸分子组合，其包含
(a)根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或
(b)作为其互补物的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的核酸分子组合，其进一步包含
(a)核苷酸序列，其选自下组中的一个或多个：
SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:243,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:174,SEQID NO:54,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:35,SEQID NO:170,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:235,SEQ ID NO:127,SEQ IDNO:130,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:112,SEQID NO:53；
(b)作为其互补物的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2的核酸分子组合，其是RNA。
4.根据权利要求1或2的核酸分子组合，其包含至少一个经修饰的核苷酸类似物。
5.根据权利要求1或2的核酸分子组合，其是表达载体。
6.根据权利要求1至5中任一项的核酸分子组合在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于评估受试者中的阿尔茨海默氏病。
7.根据权利要求6的用途，其中评估阿尔茨海默氏病包括在所述受试者的所述样品中测定所述核酸分子组合的表达水平的步骤。
8.根据权利要求7的用途，其中所述样品是血液样品。
9.根据权利要求6至8中任一项的用途，其中评估阿尔茨海默氏病包括将患有或有风险形成阿尔茨海默氏病的患者的样品分类，预测形成阿尔茨海默氏病的风险，或预测患有或有风险形成阿尔茨海默氏病的患者中的阿尔茨海默氏病的结果。
10.根据权利要求7至8中任一项的用途，其中评估阿尔茨海默氏病包括将表达水平或表达水平的模式与一个或几个表达水平参照模式比较以及从比较结果评估阿尔茨海默氏病的步骤。
11.根据权利要求9的用途，其中评估阿尔茨海默氏病包括将表达水平或表达水平的模式与一个或几个表达水平参照模式比较以及从比较结果评估阿尔茨海默氏病的步骤。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项的核酸分子组合。
13.权利要求12的药物组合物在制备组合物中的用途，所述组合物用于阿尔茨海默氏病的诊断应用。
14.试剂盒，其包含用于测定根据权利要求1至5中任一项的核酸分子组合的存在和/或表达水平的量的手段。
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