CN110387415A - 一种检测脑缺血再灌注损伤的环状rna标志物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物circRNA 0002086，本发明首次利用circRNA分子标志物诊断模型对脑缺血再灌注损伤进行诊断，具有较佳的诊断效能，本发明通过实时荧光定量PCR技术对脑缺血再灌注损伤的血清水平circRNA的检测,定量准确,方便可靠。本发明提供的circRNA可用于脑缺血再灌注损伤的临床诊断，本发明提供的circRNA 0002086诊断的特异度达87％。本发明为临床医生快速准确掌握脑缺血再灌注损伤患者病情,为提高临床治疗效果奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助，具有较好的应用价值和前景。

Description

一种检测脑缺血再灌注损伤的环状RNA标志物及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测脑缺血再灌注损伤的环状RNA标志物。
背景技术
脑缺血再灌注损伤(CIR)是指各种原因导致脑组织血流中断闭塞的脑血管再通后缺血性损伤却进一步加重的现象,是一个由多因素参与的复杂病理生理过程。目前CIR的发生机制主要包括细胞凋亡学说、炎症反应学说、兴奋性氨基酸学说以及自由基学说等"。炎症反应和细胞凋亡是诱导CIR后神经细胞损伤的主要因素。目前尚无理想的脑缺血再灌注损伤检测分子标志物。由于脑缺血再灌注损伤发病机制复杂,影响因素较多,并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定,因此,非常适合利用高通量的基因组从众多复杂的基因中筛选出一组(数十或数百个)特异性分子标志物,才能更准确进行早期诊断和疾病进展程度判断。全血、血清或血浆是最广泛使用的临床途径样品源,寻找到提供早期诊断信息的临床生物标记物,可极大地帮助诊断和处理疾病,为该病的临床早期诊断、疾病分型、严重程度判断等提供有效依据,进而为精准治疗以及新药研发提供依据。
环状RNA(circular RNA，circRNA)呈闭合环状,是一类不具有5'末端帽子和3'末端尾巴的特殊内源性非编码RNA,主要由外显子转录产物组成，少数来源于内含子或内含子片段，是目前RNA研究领域的新热点。circRNA存在于多种真核生物中，在同种生物的不同组织中也广泛存在；多数circRNA具有高度保守序列，仅有少数在进化上不保守；大多数定位于细胞质中,少数定位于细胞核内。而且，部分circRNA具有miRNAsponge功能,与miRNA相互作用,，调控靶基因的表达；大多数circRNA能在转录或转录后水平发挥调控作用，少数能在转录水平发挥作用。前人的一些研究发现，circRNA在动脉粥样硬化、神经系统紊乱、阮病毒感染性疾病、糖尿病、肿瘤等疾病发生过程中发挥着重要的生物学作用。因此，对circRNA进行研究具有重要的临床意义。circRNA的组织特异性和稳定性有可能使其成为良好的生物标记物。环状RNA是一类内源性非编码RNA分子，具有封闭的环形结构，主要由外显子和(或)内含子构成,在真核细胞中普遍存在。血液中circRNAs是一种新型生物标志物,区别于传统生物标志物,稳定、微创且定量精确,有组织特异性和良好的稳定性,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于脑缺血再灌注损伤的辅助诊断,为其他疾病生物标志物的研发提供借鉴。
本发明旨在为CIR筛查诊断提供新的标志分子circRNA,其检测结果为CIR的早期发现和临床预判提供更多更准确的实验证据。本发明用于CIR检测的circRNA未见国内外有文献报道和相关的专利申请。
发明内容
本发明提供了一种脑缺血再灌注损伤检测的分子标志物,及其作为检测试剂的应用及使用方法,其目的在于解决脑缺血再灌注损伤发病机制复杂,影响因素较多,并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定的问题。
本发明采用以下技术方案：
一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物，所述分子标志物为circRNA 0002086，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述环状RNA分子标志物用于检测脑缺血再灌注损伤的发生。
一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。
一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物在制备用于检测脑缺血再灌注损伤的试剂盒或基因芯片中的用途。
所述试剂盒至少包括：用来扩增特异性识别circRNA 0002086的核酸序列的正向引物和反向引物。
所述正向引物为：5’GGTTTATTTCTGTTGGCTTCAGTGCAGT3’
反向引物为：5’CCCAGGATACATTGACCCGGATTCTTTG3’
所述基因芯片至少包括circRNA 0002086的核酸序列杂交的探针。
所述试剂通过RT-qPCR检测血液中的circRNA 0002086表达水平来诊断脑缺血再灌注损伤,高通量检测结果显示circRNA 0002086在脑缺血再灌注损伤组表达较健康组显著上调。
脑缺血再灌注损伤检测的生物标志物试剂的使用方法,该方法使用训练的算法来比较生物样品和对照样品之间的circRNA的差异,确定脑缺血再灌注损伤分子标志物最佳诊断模型。
所述生物样品为被检测对象的全血标本，对照样品为健康人群的全血标本。
本发明的有益效果为：本发明首次利用circRNA分子标志物诊断模型对脑缺血再灌注损伤进行诊断，具有较佳的诊断效能，本发明通过实时荧光定量PCR技术对脑缺血再灌注损伤的血清水平circRNA的检测,定量准确,方便可靠。本发明提供的circRNA可用于脑缺血再灌注损伤的临床诊断，本发明提供的circRNA 0002086诊断的特异度达87％。本发明为临床医生快速准确掌握脑缺血再灌注损伤患者病情,为提高临床治疗效果奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助，具有较好的应用价值和前景。
附图说明
图1为大鼠线栓法MCAO/R脑缺血再灌注损伤模型与正常组circRNA表达的对比图；
图2为人脑缺血再灌注损伤患者血液与正常组circRNA表达的对比图；
图3为circRNA 0002086在健康人群及脑缺血再灌注损伤的表达水平ROC曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1总RNA提取、circRNA测序及筛选
制备大鼠线栓法MCAO/R脑缺血再灌注损伤模型，采取外周血，选取3组外周血样品送检，以正常大鼠外周血样品作为对照，进行RNA抽提、测序；
具体方法如下：1.按照说明书，采用Thermo Fisher公司的TRIZOL试剂从每个样品中提取5μg Total RNA，再用Epicentre Ribozero rRNA Removal Kit去rRNA试剂盒去除rRNA,用RNase R将其中的线性RNA消化掉，采用Illumina公司的定向文库制备试剂盒生成序列库，簇生成后，通过高通量4000测序平台进行测序，生成150-bp两头测序的reads，以上测序以及circRNA/mRNA analysis分析均由诺禾致源公司进行。
2.RT-qPCR验证
用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒对提取的2μg总RNA反转录成cDNA，采用标准方法qPCR由通过包括特异性引物的20-μl反应液进行，引物如表1所示，每份样品用GAPDH，β-actin和U6作为内参。
表1 RT-qPCR引物
结果
(1)CircRNAs的鉴定：从样品中获得10G clean data，在对照组和空白组中发现了1016种同时存在的circRNAs，这些circRNAs均匀的分布在染色体上。
(2)差异表达CircRNAs的验证
采用RT-qPCR检测样品中的circRNAs的表达水平变化，根据FC值，最终验证得出如下5个表达上调circRNA，如图1所示：circRNA 0000456、circRNA 0003760、circRNA0002086、circRNA 0001606和circRNA 0002023，其中circRNA 0002086、circRNA 0001606和circRNA 0002023表达明显上升。
因此，对circRNA 0002086、circRNA 0001606和circRNA 0002023进行进一步研究.
具体实施例2对人脑缺血再灌注血液中的3个对应环状circRNA 0002086、circRNA0001606和circRNA 0002023进行鉴定和检测。
方法：本实施例收集脑缺血再灌注损伤患者外周血样品28例，正常人样品28例，检测circRNA 0002086、circRNA 0001606和circRNA 0002023的水平及特异性。
结果发现，如图2-3所示，患者样品中的circRNA 0002086的表达水平明显高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.001),circRNA 0002086作为脑缺血再灌注损伤的特异性为87％。
结果显示在人脑缺血再灌注损伤患者血液中，其中circRNA 0002086表达水平也显著高于健康人群,因此，circRNA 0002086可作为脑缺血再灌注损伤的诊断生物标志物并可制成相应的诊断产品如试剂盒、芯片等。产品中包括特异性识别circRNA 0002086的引物对,包括上游引物和下游引物,上游引物的核苷酸序列为5’GGTTTATTTCTGTTGGCTTCAGTGCAGT3’，上游引物的核苷酸序列为5’CCCAGGATACATTGACCCGGATTCTTTG3’。

Claims (7)

1.一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为circRNA 0002086，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物，其特征在于，所述分子标志物用于检测脑缺血再灌注损伤的发生。
3.一种检测脑缺血再灌注损伤检测的环状RNA分子标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。
4.一种检测脑缺血再灌注损伤检测的分子标志物在制备用于检测脑缺血再灌注损伤的试剂盒或基因芯片中的用途。
5.根据权利要求4所述的一种检测脑缺血再灌注损伤检测的分子标志物在制备用于检测脑缺血再灌注损伤的试剂盒或基因芯片中的用途，其特征在于，所述试剂盒至少包括：用来扩增特异性识别circRNA 0002086的核酸序列的正向引物和反向引物。
6.根据权利要求5所述的一种检测脑缺血再灌注损伤检测的分子标志物在制备用于检测脑缺血再灌注损伤的试剂盒或基因芯片中的用途，其特征在于，所述正向引物为：
5’GGTTTATTTCTGTTGGCTTCAGTGCAGT3’，
反向引物为：5’CCCAGGATACATTGACCCGGATTCTTTG3’。
7.根据权利要求4所述的一种检测脑缺血再灌注损伤检测的分子标志物在制备用于检测脑缺血再灌注损伤的试剂盒或基因芯片中的用途，其特征在于，所述基因芯片至包括circRNA 0002086的核酸序列杂交的探针。
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