ES2734678T3 - Firmas específicas en enfermedad de alzheimer por perfiles de miarn multicéntricos - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende: crear un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra de sangre proporcionada de un paciente, y comparar el nivel de expresión de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de esa secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Description

DESCRIPCIÓN
Firmas específicas en enfermedad de alzheimer por perfiles de miarn multicéntricos
La invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (AD, Alzheimer's Disease) en un paciente, en el que se determina el perfil de expresión de miARN en una muestra de sangre y una comparación del nivel de expresión de miARN definidos con una muestra de referencia, y el uso de estos miARN definidos como marcador para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer generalmente se diagnostica clínicamente a partir del historial del paciente, de la anamnesis media de los parientes y las observaciones clínicas basadas en la presencia de características neurológicas y neuropsicológicas características y la ausencia de condiciones alternativas como otras enfermedades o condiciones transitorias como la alcoholización (procedimiento de exclusión). Además se pueden utilizar las imágenes médicas modernas con tomografía computarizada (CT), tomografía de resonancia magnética (MRI, magnetic resonance imaging), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT, single photon emission computed tomography) y/o tomografía por emisión de positrones (PET, positron emission tomography), para excluir otros síntomas cerebrales o subespecies de demencia. Además, se puede predecir la transición de las fases prodrómicas (deterioro cognitivo leve, MCI (mild cognitive impairment)) a la enfermedad de Alzheimer. Cuando están disponibles como herramienta de diagnóstico se utilizan la neuroimagen por SPECT y PET para confirmar el diagnóstico de Alzheimer junto con las evaluaciones que involucran la evaluación del estado mental. En una persona que ya tiene demencia, la SPECT parece ser mejor para diferenciar entre el Alzheimer y otras causas potenciales en comparación con los enfoques habituales que utilizan pruebas psicológicas y un análisis de anamnesis.
Los avances han llevado a propuestas de nuevos criterios diagnósticos. Se pudo desarrollar una nueva técnica, conocida como PiB PET, para mapear directa y claramente los depósitos de beta-amiloide in vivo usando un trazador que se une selectivamente a los depósitos de A-beta. El compuesto PiB-PET utiliza la exploración PET con carbono-11. Estudios recientes sugieren que PiB-PET es preciso en un 86% en cuanto a la predicción de qué pacientes con deterioro cognitivo leve desarrollarán Alzheimer dentro de dos años, y este procedimiento es aproximadamente 92% preciso en cuanto a la exclusión de la probabilidad de desarrollar Alzheimer. Se ha sugerido que la tomografía amiloide probablemente se usará en conjunto con otras marcas en el futuro, y no como alternativa. Estudios recientes han demostrado que los pacientes con AD presentan valores de glutamato (Glu) reducidos como también relaciones reducidas de Glu/creatina (Cr), Glu/Myo-inositol (mI), Glu/N-acetilaspartato (NAA) y NAA/Cr en comparación con las personas sin AD. Tanto la relación reducida de NAA/Cr como también el nivel de Glu reducido en el hipocampo pueden ser una indicación temprana de la enfermedad de Alzheimer. También se ha encontrado que el control de las desviaciones de la dehidroepiandrosterona (DHEA) en la sangre en respuesta al estrés oxidativo puede ser una prueba útil: Los pacientes con MCI no mostraron ningún cambio en la DHEA, mientras que los controles sanos sí lo hicieron. Recientemente, se ha propuesto una prueba de diagnóstico de miARN (microARN) del suero (H. Geekiyanage, GA Jicha, P.T. Nelson, und C. Chan; Blood serum miRNA: Noninvasive biomarkers for Alzheimer's disease, Exp Neurol. 2012 235 2 491-496. doi: 10.1016 / j.expneurol.2011.11.026).
Hui Dong et al .; Los perfiles de microARN en suero sirven como nuevos biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, marcadores de enfermedad 2015, 14 (1): 27, http://dx.doi.org/10.1155/2015/625659, describe la identificación y validación del potencial de los miARN circulantes como biomarcador para la enfermedad de Alzheimer.
El documento EP 2 733 220 A1 se refiere a marcadores de miARN que son particularmente útiles para el diagnóstico de enfermedades neuronales tales como la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO 2013/003350 A2 describe un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, en el que se determina el nivel de al menos un miARN en una muestra de un paciente.
Además, el documento WO 2009/009457 A1 describe procedimientos para diagnosticar y/o pronosticar la enfermedad de Alzheimer en pacientes mediante la medición de la cantidad de uno o más micro-ARN en una muestra biológica.
El documento WO 2011/057003 A2 describe procedimientos para la detección de patologías neuronales utilizando un análisis cuantitativo en fluidos corporales de ARN sináptico y/o neurítico y el uso de los mismos para el diagnóstico temprano y el monitoreo de enfermedades neurodegenerativas.
Michel J. Weber, New human and mouse microRNA genes found by homology search, FEBS Journal 2005, 272(1), páginas 59-73 dan a conocer la determinación de miARN mediante la determinación sistemática de inter-especies ortólogas de precursores de miARN.
El documento WO 2013/118066 A1 se refiere al uso del perfil de expresión de miARN y los genes diana regulados de este modo para el diagnóstico, pronóstico y el uso de inhibidores de miR-199a-5p para el tratamiento de enfermedades fibroproliferativas.
Sin embargo, el diagnóstico precoz y seguro de la enfermedad de Alzheimer (AD) basado en biomarcadores moleculares no invasivos sigue siendo un desafío. Para lograr el objetivo de la presente invención, los inventores proponen la creación de un perfil de expresión de una combinación de micro-ARN no codificantes (miARN) para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer a partir de muestras de sangre, en particular células sanguíneas. Los inventores han encontrado que un cambio en el perfil de expresión de ciertos miARN en comparación con pacientes sanos hace posible diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.
Según un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende: proporcionar una muestra de sangre de un paciente, creando un perfil de expresión de miARN a partir de la muestra de sangre y comparar el nivel de expresión de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p y/o que comprende una secuencia de los mismos, que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de una enfermedad con Alzheimer.
Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, como marcadores para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
Otros aspectos de la presente invención se pueden encontrar en las reivindicaciones dependientes y en la descripción detallada.
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica.
Los micro-ARN o miARN o los ácidos micro-ribonucleicos son una clase de ARN cortos no codificantes, por ejemplo, desempeñan un papel en la expresión génica. Un miARN es aquí un polinucleótido que tiene un número fijo de bases, por ejemplo, menos de 500, menos de 200, menos de 100, menos de 50 o menos de 30, pero por ejemplo más de 5, 10 o 14 bases, y una secuencia definida. Por ejemplo, también se puede obtener ADNc a partir de él, de modo que también se pueden preparar ADNc a partir de los miARN en el procedimiento de acuerdo con la invención, que luego se pueden comparar de manera similar con los niveles de ADNc que se obtienen a partir de miARN de pacientes que no tienen MS, en particular sin RRMS.
En lo sucesivo como también previamente, las referencias a ciertos miARN se refieren a las secuencias como se pueden encontrar en la base de datos Mirbase (http://mirbase.org/), en particular Mirbase20, es decir, la versión 20 de Mirbase.
Además, las secuencias también se muestran en la Tabla 1 a continuación. La Tabla 1 muestra los miARN en la forma madura (mature Form), que puede diferir de la forma de horquilla (stem loop form).
Tabla 1: Secuencias de miARN
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La presente invención en un primer aspecto se refiere a un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende:
proporcionar una muestra de sangre de un paciente,
crear un perfil de expresión de miARN a partir de la muestra de sangre, y
comparar el nivel de expresión de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
Se describe un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un paciente que comprende:
proporcionar una muestra de sangre de un paciente,
crear un perfil de expresión de miARN a partir de la muestra de sangre, y
comparar el nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817 3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-361 -5p, y hsa-miR-3157-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
El perfil de expresión aquí es un perfil de la expresión de los miARN, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19. 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más miARN, en la muestra, según ciertas realizaciones en forma cuantitativa, mientras que el nivel de expresión indica la cantidad respectiva de un miARN expresado.
La provisión de la muestra de sangre no está particularmente limitada en este caso, pero es en particular no invasiva, sino que se usa una muestra de sangre ya tomada. Según ciertas realizaciones, también se puede incluir la extracción y/o preparación de una muestra de sangre. Aquí, una muestra de sangre comprende una muestra de sangre completa, así como fracciones de muestras de sangre, como el plasma, suero, etc., o también células en la muestra de sangre como las células mononucleares de sangre periférica. Según ciertas realizaciones, la muestra de sangre comprende células sanguíneas o consiste en células sanguíneas.
El paciente del que se proporciona la muestra de sangre tampoco está particularmente limitado, y puede incluir, por ejemplo, vertebrados, particularmente mamíferos, pero según ciertas realizaciones es un ser humano. En particular, de acuerdo con ciertas realizaciones, el presente procedimiento se aplica a pacientes, por ejemplo, personas sospechosas de tener la enfermedad de Alzheimer y/o que fueron diagnosticadas con deterioro cognitivo leve (MCI).
Las secuencias que se usan en el procedimiento según la invención se pueden usar aquí de forma particular en el caso de un cambio en el nivel de expresión de uno o más de los miARN, que comprenden una secuencia correspondiente.
Además, el procedimiento para crear un perfil de expresión de miARN no está particularmente limitado y puede incluir, por ejemplo, procedimientos microbiológicos comunes para la determinación de ácidos nucleicos, en cuyo caso se usa un procedimiento semicuantitativo o cuantitativo, en particular cuantitativo para la comparación con el nivel de referencia según ciertas realizaciones. Según ciertas realizaciones, el establecimiento del perfil de expresión de los miARN comprende al menos un procedimiento seleccionado del grupo que comprende una hibridación de ácido nucleico, una amplificación de ácido nucleico, una extensión de polimerasa, una secuenciación, una espectrometría de masas y cualquier combinación de las mismas.
En este caso, una hibridación de ácidos nucleicos puede incluir el uso de matrices, por ejemplo, micromatrices y/o hibridación in situ. Por ejemplo, una matriz puede incluir el uso de secuencias complementarias a las secuencias particulares, es decir, miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR Hsa-miR-3617-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, y adicionalmente, según ciertas realizaciones miARN adicionales que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28-3p, hsamiR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, que por ejemplo puede aplicarse adecuadamente a un soporte. Para la cuantificación es posible, por ejemplo, realizar un marcado los miARN de la muestra con marcadores como marcadores de fluorescencia o marcadores de radionucleótidos.
Alternativa o adicionalmente también se puede llevar a cabo de una manera adecuada una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente una PCR cuantitativa (qPCR), en particular una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real).
También se pueden concebir procedimientos de secuenciación, como la secuenciación de próxima generación y/o la espectrometría de masas, en particular la espectrometría de masas cuantitativa.
La comparación con un nivel de referencia en el procedimiento según la invención no está particularmente limitada y puede comprender en particular una comparación con la muestra de un individuo sano y/o un individuo con un diagnóstico de MCI en el que no se diagnostica la enfermedad de Alzheimer. Así, el procedimiento no solo permite un diagnóstico, sino también una determinación de estadios (Staging). Mediante tal comparación, por ejemplo, se puede hacer posible el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, una comparación puede basarse en enfoques matemáticos tales como correlaciones, procedimientos estadísticos, teorías de probabilidad, enfoques de teoría de la información o combinaciones de los mismos.
Para una declaración mejorada, es ventajosa una comparación estadística con un gran número de muestras de pacientes sanos que padecen Alzheimer, por lo que dichos datos también pueden tomarse, por ejemplo, de una base de datos adecuada y/o determinarse utilizando una función matemática o un algoritmo desarrollado a partir de ellos. El procedimiento estadístico no está particularmente limitado en este caso y se puede llevar a cabo, por ejemplo, asistido por computadora. Por ejemplo, se puede usar una prueba t, una prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, la determinación del área bajo la curva (AUC), etc.
Según ciertas realizaciones el nivel de referencia se obtiene a partir de una pluralidad de muestras de pacientes a los que un primer grupo ha sido diagnosticado con AD, y un segundo grupo no tiene un diagnóstico de AD, que es saludable a este respecto, preferiblemente los grupos de edad y sexo y el nivel de referencia se determina a partir del grupo de pacientes sanos. Para una declaración más extensa según ciertas realizaciones, también es posible considerar grupos de control con un diagnóstico de MCI y/o MS. Según ciertas realizaciones, en este caso se determina un nivel de referencia del mismo tipo de muestra que la muestra que se va a determinar.
Como desviación de la secuencia aquí debe entenderse como una variación en la secuencia, por ejemplo, una adición, una inserción, una eliminación o un intercambio de una base en la secuencia en comparación con la secuencia original, que se proporciona por ejemplo en la Tabla 1, en particular una supresión y/o un intercambio de una única base. Así, por ejemplo, una supresión de 1 o 2 bases puede tener lugar en uno y/o ambos extremos de la secuencia, en donde se suprimen un máximo de 3 bases, preferiblemente un máximo de 2 bases, más preferiblemente 1 base y en particular no se elimina ninguna base. También adicionalmente o alternativamente, es posible un cambio de 1 o más bases dentro de la secuencia, nuevamente con un cambio máximo de 3 bases, preferiblemente 2 bases, más preferiblemente 1 base, y lo más preferiblemente no base en comparación con las secuencias de hsa-miR 345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsamiR-3157-3p y hsa-miR-44823p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, y/o hsa-miR-28-3p, hsa miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a.
Por lo tanto según ciertas realizaciones tiene lugar una comparación del nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p con un nivel de referencia.
Se describe una comparación del nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, con un nivel de referencia.
Tiene lugar al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-345-5p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia, es decir, de la secuencia de miARN, hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-5006-3p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-7848-3p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-6817-3p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-361-5p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-3157-3p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-4482-3p y/o una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base.
Según ciertas realizaciones, tiene lugar al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-345-5p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-5006-3p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-7848-3p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-6817-3p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-361-5p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-3157-3p. Se describe al menos una comparación con una secuencia que comprende el miARN hsa-miR-4482-3p.
Además, según ciertas realizaciones, se compara el nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa -miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, hsa-miR-4482-3p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR -532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de una enfermedad con Alzheimer.
Además, según ciertas realizaciones, el nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa -miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se compara con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de una enfermedad con Alzheimer.
Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345 -5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsamiR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, hsa-miR-4482-3p , hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, observando un cambio en el nivel de expresión comparado con un nivel de referencia, en donde en un miARN que comprende una secuencia que se selecciona de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, observándose un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia. Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345 -5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, hsa-miR-4482-3p , hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, en donde en un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia.
Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, en donde en un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, observándose un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia. Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, observándose en un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia.
En el caso de un cambio en el nivel de expresión de más de un miARN, el nivel de importancia para un diagnóstico con enfermedad de Alzheimer puede aumentar considerablemente.
El miARN se selecciona del grupo que consiste en hsa-miR-345, y/o que tiene una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. En ciertas realizaciones el miARN es hsa-miR-345. Según ciertas realizaciones el otro miARN que también está determinado al miARN que es hsa-miR-345-5p y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa-miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157, hsa -miR-4482, hsamiR-28, hsa-miR-151a, hsa-miR-1468, hsa-miR-532, hsa-miR-17, y hsa-miR-30a, y/o con una secuencia que difiere de esta secuencia hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Según ciertas realizaciones, el otro miARN que también está determinado al miARN que es hsa-miR-345-5p y/o comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa-miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157, hsa -miR-4482, hsa-miR-28, hsa-miR-151a, hsa-miR-1468, hsa-miR-532, hsa-miR-17 y hsa-miR-30a. Según ciertas realizaciones también se determina adicionalmente el nivel de expresión de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa-miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR. 3157, hsa-miR-4482, hsa-miR-28, hsa-miR-151a, hsa-miR-1468, hsa-miR-532, hsa-miR-17 y hsa-miR-30a.
Estas realizaciones del miARN corresponden aquí a la forma de tallo-bucle o a la forma en horquilla que se correlaciona con la forma madura detectada como se muestra en la Tabla 2 (tanto para los miARN de uso según la invención como para los otros miARN que pueden usarse en el procedimiento según la invención), y por ejemplo, en las muestras se pueden incluir como tales. En consecuencia, la comparación se puede hacer en lugar de con la forma madura correspondiente también con la forma tallo-bucle correspondiente.
Tabla 2: Correlación entre la forma del tallo-bucle y la forma madura
Figure imgf000007_0001
Las secuencias de ácido nucleico de las formas de tallo-bucle según la Tabla 2 son las siguientes:
14
acccaaaccc uaggucugcu gacuccuagu ccagggcucg ugauggcugg
ugggcccuga acgagggguc uggaggccug gguuugaaua ucgacagc
15
aaccauuagg gggcuguggu uugccagggc aggaggugga agggagcccc
auuuacagug guaacuuccu uucccuuucc auccuggcag gcuucagaga
acuuuaccag
16
gcuggggcug ggugggugug gcaggcccac cuuggguaug caaagcucug
acaguguuuc acuugcuacc cucggucugc uuaccacacu cccaguucug c
17
aggauucugc cauaggaagc uuggagugga acugaccugc ccccuuucuc
ucugacucca uggcag
18
ggagcuuauc agaaucucca gggguacuuu auaauuucaa aaaguccccc
aggugugauu cugauuugcu uc
19
gggaagggcu ucagccaggc uagugcaguc ugcuuugugc caacacuggg
gugaugacug cccuagucua gcugaagcuu uuccc
20
agugagcaac ccagugggcu auggaaaugu guggaagaug gcauuucuau
uucucagugg ggcucuuacc
21
gguccuugcc cucaaggagc ucacagucua uugaguuacc uuucugacuu uccca
cuaga uugugagcuc cuggagggca ggcacu
22
uuuccugccc ucgaggagcu cacagucuag uaugucucau ccccuacuag a
cugaagcuc cuugaggaca gggaugguca uacucaccuc
23
gguggguggu uucuccguuu gccuguuucg cugaugugca uucaacucau
ucucagcaaa auaagcaaau ggaaaauucg uccauc
24
cgacuugcuu ucucuccucc augccuugag uguaggaccg uuggcaucuu
aauuacccuc ccacacccaa ggcuugcaga agagcgagcc u
25
gucagaauaa ugucaaagug cuuacagugc agguagugau augugcaucu
acugcaguga aggcacuugu agcauuaugg ugac
26
gcgacuguaa acauccucga cuggaagcug ugaagccaca gaugggcuuu
cagucggaug uuugcagcug c
Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7, miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR -7848, hsa-miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, en donde en un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia, que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia. Según ciertas realizaciones, en al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7, miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR Hsa-miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, en donde en un miARN, que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia.
Según un aspecto adicional la invención se relaciona con el uso de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, como marcador para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
Se describe el uso de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR Hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR 361-5p, y hsa-miR-3157-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, como marcador para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. En ciertas realizaciones se utiliza un miARN que comprende una secuencia que consiste en hsa-miR-345-5p. Se describe el uso de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR Hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsamiR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR 361-5p, y hsa-miR-3157-3p.
Aquí se describe que el miARN es al menos uno que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa-miR-6817, hsa -miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, preferiblemente hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-361, y hsa-miR-3157, y/o que presenta una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base. Aquí se describe que el miARN es al menos uno que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa-miR-6817, hsa -miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, preferiblemente hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-361, y hsa-miR-3157.
También se describe un kit para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en una muestra de sangre de un paciente, que comprende:
sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p , hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p , hsamiR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base.
El kit puede comprender sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR Hsa-miR-3617-5p, hsa-miR-3157-3p, y hsa-miR-4482-3p, preferiblemente hsa-miR-345-5p, hsa-miR 5006-3p, hsa-miR-361-5p, y hsa-miR-3157-3p.
El kit puede comprender sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que presente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, preferiblemente hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-361, y hsamiR-3157, y/o que presenta una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base.
El kit puede comprender sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que presente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-7848, hsa miR-6817, hsa-miR-361, hsa-miR-3157 y hsa-miR-4482, preferiblemente hsa-miR-345, hsa-miR-5006, hsa-miR-361, y hsamiR-3157.
El kit puede comprender además sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, preferiblemente sondas y/o cebadores para la detección de al menos una secuencia de miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28-3p, hsa miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsamiR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p. En particular el kit puede comprender además sondas y/o cebadores para detectar al menos una secuencia de miARN que presente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28, hsa-miR-151a, hsa-miR-1468 , hsa-miR-532, hsa-miR-17 y hsa-miR-30a, y/o que presente una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, preferiblemente sondas y/o cebadores para la detección de al menos una secuencia de miARN que presente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-28, hsa-miR-151a, hsa-miR-1468, hsa-miR 532, hsa-miR-17 y hsa-miR-30a.
El kit puede comprender sondas y/o cebadores para detectar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 de las secuencias anteriores.
Las sondas y/o cebadores no están particularmente limitados en este caso y pueden comprender, por ejemplo, oligómeros que presentan una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, también una secuencia de ADNc que es complementaria de la secuencia a detectar.
Además, también se pueden proporcionar otras sondas y/o cebadores como controles, por ejemplo, de otros miARN en los que no se producen cambios en el perfil de expresión en comparación con los pacientes sin enfermedad AD. También se pueden proporcionar controles para la unión no específica y/o la hibridación.
Los cebadores y/o sondas así como, dado el caso, los controles pueden aplicarse a un sustrato adecuado.
El kit puede incluir además enzimas y/o reactivos para llevar a cabo una RT-PCR, en particular qRT-PCR, aunque estos no están particularmente limitados. Los reactivos también pueden incluir, por ejemplo, marcadores, por ejemplo para marcado de fluorescencia y/o marcado con radionucleótidos. El kit también puede comprender reactivos para la síntesis de ADNc a partir de los miARN antes de la PCR, preferiblemente qPCR y/o RT-PCR, en particular qRT-PCR.
Las realizaciones, configuraciones y perfeccionamientos anteriores pueden, si es apropiado, combinarse entre sí según se desee. Otras posibles configuraciones, perfeccionamientos e implementaciones de la invención también incluyen combinaciones de características de la invención que no se han mencionado explícitamente anteriormente o se describen a continuación en relación a los ejemplos de realización. En particular, el experto en la materia también añadirá aspectos individuales como mejoras o adiciones a la forma básica respectiva de la presente invención.
La invención se aclarará adicionalmente a continuación por medio de realizaciones ejemplo que, sin embargo, no limitan la invención.
Ejemplo 1
En el ejemplo, se examinaron muestras de individuos mediante secuenciación de alto rendimiento (high throughput sequencing) como una tecnología imparcial. Se realizó un estudio multicéntrico de casos y controles a ciegas (multi-centric case-control study) con 294 individuos, incluidos 107 pacientes con AD, 20 pacientes con MCI, 90 pacientes con MS y 77 controles de edad y sexo. Se examinaron los miRNomes -es decir unidades completas de microARN- de todos los individuos de manera convencional utilizando la secuenciación de próxima generación (NGS). Los pacientes con AD y los controles se dividieron a este respecto en una primera cohorte de 54 pacientes con AD y 22 controles de los Estados Unidos, que fueron revisados inicialmente, y una segunda cohorte de replicación con 53 pacientes con AD y 55 controles de un hospital universitario alemán.
Al llevar a cabo la NGS con los 294 individuos, se generaron aproximadamente 6 mil millones de secuencias cortas de ARN como valores leídos (reads). A partir de los datos de EE.UU. Y de Alemania se perfilaron un grupo de AD y un grupo de control. Se encontraron un total de 586 miARN en la sangre. En la cohorte de los EE.UU. se modificaron 210 miARN en la expresión entre las muestras de AD y de control, y en la cohorte alemana de 135 miARN. En ambos estudios se encontró una superposición significativa (p <0,00001) de 69 miARN. De estos el 96% de la dirección de expresión fue consistente en ambas cohortes y los valores del área bajo la curva (AUC, area under curve) mostraron una correlación altamente significativa (p <10'16 ) de 0,92 (95% intervalo de confianza (IC)). desde 0,87-0,95).
Los miARN estadísticamente significativos encontrados aquí que pueden usarse para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer se dan en la Tabla 3.
Los miARN en la firma parecen estar involucrados en la disfunción mitocondrial por los posibles genes objetivos / objetivo PARL (p = 0,004) y SLC25A5 (p = 0,002).
Tabla 3: miARN con niveles de expresión significativamente diferentes en pacientes con AD en comparación con el grupo control.
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Se muestran en la Tabla 4 otras secuencias de miARN maduras relevantes encontradas para las dos cohortes estudiadas, determinadas a partir de una prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, con los valores encontrados de cada prueba realizada de la cohorte Wilcoxon-Mann-Whitney.
Tabla 4: miARN con diferentes niveles de expresión en pacientes con AD en comparación con el grupo de control según los resultados de las pruebas de Wilcoxon-Mann-Whitney para la primera y la segunda cohorte
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 2
Para evaluar la especificidad de los miARN para la enfermedad de Alzheimer encontrada en el Ejemplo 1, se compararon sus niveles de expresión aún más con los de pacientes con MCI y esclerosis múltiple (MS) obtenidos como en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: miARN con niveles de expresión significativamente diferentes en pacientes con AD en comparación con pacientes con MCI y MS.
Figure imgf000013_0001
Mientras que los miARN de AD más significativos del panel del Ejemplo 1 también fueron desregulados entre la MS y la a D, los pacientes con MCI fueron más similares a los pacientes con AD.
Dado que el mismo panel de miARN puede distinguir entre MCI, MS y AD, se puede concluir que los miARN en la firma encontrada son específicos para enfermedad de Alzheimer y se pueden usar en consecuencia para la detección o el diagnóstico temprano de la enfermedad.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende:
crear un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra de sangre proporcionada de un paciente, y comparar el nivel de expresión de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de esa secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde además se compara el nivel de expresión de al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p , hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, hsa-miR-4482-3p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p, y hsa-miR-30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, con un nivel de referencia, permitiendo la comparación el diagnóstico de una enfermedad con Alzheimer.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el paciente es un ser humano.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 miARN que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en hsa -miR-345-5p, hsa-miR-5006-3p, hsa-miR-7848-3p, hsa-miR-6817-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-3157-3p, hsa-miR -4482-3p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-17-3p y hsa-miR 30a-3p, y/o que comprende una secuencia que difiere de estas secuencias respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia, en donde en al menos un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con un nivel de referencia.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la creación del perfil de expresión comprende una hibridación de ácido nucleico, una amplificación de ácido nucleico, una extensión de polimerasa, una secuenciación, una espectrometría de masas, o cualquier combinación de los mismos.
6. Uso de un miARN que comprende una secuencia seleccionada de hsa-miR-345-5p, y/o que comprende una secuencia que difiere de esta secuencia respectivamente hasta en 3 bases, preferiblemente hasta 2 bases, más preferiblemente 1 base, como marcador para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
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