CN103620019B - 基于miRNA的通用筛选试验(UST) - Google Patents

基于miRNA的通用筛选试验(UST) Download PDF

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Abstract

记载了通过定量体液中的器官系统‑/器官‑/组织‑/细胞类型‑富集的miRNA来早期无创或微创检测器官系统/器官/组织/细胞的病理变化的方法。

Description

基于miRNA的通用筛选试验(UST)
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年4月18日提交的美国临时申请序列号61/476,591、2011年4月25日提交的美国临时申请序列号61/478,766和2011年10月12日提交的美国临时申请序列号61/546,431的优先权，将所有这些的全部内容引入于此以作参考。
技术领域
本发明记载了通过定量体液中的器官系统/器官/组织/细胞类型富集的miRNA来早期无创或微创检测器官系统、特定器官、组织和/或细胞的病理变化的方法。
背景技术
普遍接受的是，如果尽早诊断出潜在病理，则任何疾病的治疗会更容易且更有效。对于某些疾病，早期诊断(优选在清晰的临床症状出现之前)是极其重要的，这是由于病理转变成更高级的阶段有时是不可逆转的。例如，阿尔茨海默病及其它神经退行性疾病的药物研发和治疗的主要问题之一是由于脑的高补偿潜力而造成它们的晚临床表现和诊断。结果，这些疾病通常在许多神经元已经死亡时才被诊断出，并且目前最好的病例方案是防止病理恶化，而不是真正的恢复。癌症是另一实例，由于疾病的转移阶段的治疗比原发肿瘤的治疗更成问题。还有许多这类其它病理，但同样地，如果诊断较早，则任何疾病的治疗会更有效。
存在几种基础类型的临床试验：(i)辅助预测特定疾病诱因的遗传试验；(ii)筛选试验，应用于大量人群的疾病早期检测，优选在其临床表现之前；(iii)诊断试验，当在一个人具有疾病的临床症状时或者当在已通过筛选试验检测出病理时应用；(iv)分子预测试验，其应预测疾病结果和药物敏感性。
筛选试验对于疾病的早期检测是最重要的。事实上，不仅对于原发性疾病，而且对遗传关联的病理，它们的高得病几率是通过遗传实验来预测的。理想的是，每个人都应进行所有可能威胁生命的疾病和许多其它疾病的常规筛选。为开发早期检测各种疾病的试验而进行了大量尝试，并且目前针对特殊的风险群体进行不同筛选试验。例如，推荐50岁以上的人群进行周期性结肠镜检查，推荐女士进行子宫颈抹片检查，并推荐男士进行PSA试验，从而分别早期检测子宫颈和前列腺癌。这些试验的主要优点在于它们的疾病特异性，但同时这也是它们的明显缺点，因为每个试验仅针对一种特定的病理。然而，人类疾病有几百种，开发针对所有这些病理的这种特定的筛选试验将是难以想象的。此外，即使已开发出针对所有人类疾病的早期检测的特定试验，由于经济因素，也极不可能将此类试验用于筛选目的，特别是用于相对罕见的疾病。因为各特定疾病的筛选试验针对大型群体，因此它们的特异性和阳性预测值(PPY)非常重要。例如，如果相对常见的疾病(1:10,000)的筛选试验为100%灵敏性和99%特异性(这几乎是不能实现的)，并且筛选1百万人口，将正确检测出100例，但约10,000人将收到假阳性结果。很明显，这类结果将引起这些人的情绪忧虑以及另外试验的重要经济后果。
发明内容
如上述背景部分所述，本领域非常需要新的筛选试验。根据目前筛选试验开发及其临床应用的范例，此类试验的主要特征之一应为其高度的疾病特异性。然而，如上所提及的，有几百种疾病，而筛选每种特定疾病是不可能的。本发明提出了一种有意义的范例变革(paradigm shift)：开发和实现一种或小数量的通用筛选试验(UST)，其特异性检测任何特定器官系统、器官、组织和/或细胞类型的病理，而不诊断特定的疾病。任何给定的受试者应在早期、优选在临床无症状阶段周期性进行此类UST，然后更具体的试验可用于更具体的诊断。如本文所述的UST将改善疾病诊断和治疗，并显著降低医疗费用。此外，如本文所述的UST将对罕见疾病更针对性地进行试验，这是由于它们将应用于通过UST预选的更少数人群，因此将更加经济实用。
由于UST将针对大型群体(优选每个人)，因此其第一重要的特征是微创。本发明提出了通过分析可通过无创或微创法获得的，例如血浆/血清、尿液或唾液等体液中的相应生物标记物来记录特定器官、组织和甚至细胞类型中的各种生理和病理过程。其次，UST不能基于疾病的诱发因素或发病机理，因为疾病的诱发因素或发病机理太多。第三，为了广泛使用，UST不应非常昂贵，这特别地意味着其应利用可通过相同技术分析的有限量的生物标记物类型。
用于UST的生物标记物应具有使其适用于此类试验的一组参数：
1.细胞/组织/器官特异性或显著地富集(如，与其它细胞/组织/器官相比浓度高至少5倍)。
2.分泌至细胞外空间并穿过身体的各种屏障的能力。
3.以可检测的量存在于可微创获得的体液中。
4.稳定性。
5.以相对低成本的高灵敏和特异的检测性。
以下分子类型可具有潜在的UST用途：
1.蛋白质。
2.mRNA和mRNA片段。
3.miRNA。
4.DNA片段。
5.DNA甲基化。
6.脂质。
7.糖类。
然而，这些潜在的组织特异性生物标记物中的一些具有严重的缺点，这使得它们的用途不实用或甚至是不可能的。例如，DNA甲基化、脂质和糖类在各种组织和细胞类型之间不具有足以区分的特异性。此外，在细胞外空间和血流中出现的DNA片段主要来自死亡细胞(Lichtenstein等，Ann.New York Acad.Sci.2001、945:239-249)，因此，循环无细胞DNA(circulating cell-free DNA)不能用于检测不伴随细胞死亡的病理阶段。蛋白质和mRNA由于其较高的组织特异性/富集而成为UST的较佳候选物(Diez-Roux等，PLOSBiology.2011、9:el000582)。然而，mRNA是大分子，它们容易被核酸酶降解，并因而仅以其分子的短片段出现在血流中。这不排除它们作为UST生物标记物的用途，但使试验开发更困难。蛋白质是良好的候选物，但目前它们的检测方法的灵敏性显著低于核酸检测技术。另外，许多蛋白质是大分子，并且不能穿过细胞膜及其它屏障。
本发明提出在UST中使用miRNA生物标记物是由于以下原因：miRNA是小分子，它们可出现于细胞外空间、穿越脑、肾脏和胎盘屏障，出现于各种体液中，稳定，并且其现有分析方法非常特异且灵敏。最重要的是，miRNA包括一大类不同分子，其中包括在某种器官系统、器官、组织和/或细胞中富集的至少某种miRNA，因此提供针对身体所有部分的分子标记物。
微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，其终产物(成熟miRNA)为约22nt的功能性RNA分子。它们通过结合至信使转录本的互补区域来抑制它们的翻译或调控降解而在靶基因的调控中起到重要作用(Griffiths-Jones Nucleic Acids Research、2006、34、Databaseissue:D140-D144)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，而一种mRNA可受多种靶向3′UTR的不同区域的miRNA的调控。一旦结合至mRNA，miRNA便可通过影响mRNA翻译和稳定性来调节基因表达和蛋白质产生(例如，Baek等，Nature.2008、455:64；Selbach等，Nature.2008,455:58；Ambros、Nature.2004、431:350-355；Bartel、Cell.2004、116:281-297；Cullen、VirusResearch.2004、102:3-9；He等，Nat.Rev.Genet.2004、5:522-531；和Ying等，Gene.2004、342:25-28)。还有其它类型的特征较少的小RNA(综述于Kim、Mol.Cells、2005、19:1-15)。许多miRNA对某些器官/组织/细胞特异或在其中过表达(参见，例如Hua等，BMCGenomics2009、10:214；Liang等，BMC Genomics.2007、8:166；Landgraf等，Cell.2007、129:1401-1414；Lee等，RNA.2008、14:35-42)。由于它们的尺寸小，miRNA可穿过血脑、肾脏和胎盘屏障进入体液，在此它们足够稳定(Rosenfeld等，Nature Biotech.2008、26:462-469；Mitchell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2008、105:10513-10518；Chen等，Cell Res.2008、18:997-1006；Chim等，Clin.Chem.2008、54:482-490；De Smaele等，Brain Res.2010、1338:100-111；Fichtlscherer等，Circ.Res.2010、107:677-684；Scholer等，Exp.Hematol.2010、38:1126-1130)。已提出将体液中的细胞/组织特异性miRNA的分析用于检测体内细胞死亡(美国专利公布20090081640号；Laterza等，Clin Chem.2009、55:1977-1983)。已在多种研究中表明循环无细胞肝脏富集的miRNA在血流中的浓度增加(Zhang等，Clin Chem.2010、56:1830-1838；Xu等，Mol Carcinogenesis.2011、50:136-142)。例如，肝脏富集的miRNA-122a的水平在肝炎和肝细胞癌的患者的血清中上升，这些作者得出结论，由于该针对特定疾病的非特异性，这些miRNA不能用作HCC的生物标记物(Zhang等，Clin Chem.2010、56:1830-1838；Li等，Cancer Res.2010、70:9798-9807)。相反，本发明表明此类疾病非特异性的器官/组织/细胞富集的miRNA在用作UST开发的生物标记物时是非常有利的。
miRNA的表达和浓度受各种生理和病理信号的调控。一些miRNA是特定病理如低氧(Loscalzo、J.Clin.Invest.2010、120:3815-3817；Pocock、Pflugers Arch.2011、461:307-315)、炎症(Tili等，Int.Rev.Immunol.2009、28:264-284；Davidson-Moncada等，Ann.NYAcad.Sci.2010、1183:183-194；Roy和Sen、Physiol.Genomics.2011、43:557-565)或癌变(Budhu等，J.Hematol.0ncol.2010、3:37；Zen和Zhang、Med.Res.Rev.2012、32:326-348)所特有的。该现象使得有理由将此类miRNA作为生物标记物包括在本发明的UST中。体液中这些miRNA浓度的增加将指示身体中存在相应的一般性病理，而没有将其定位到特定的器官、组织或细胞类型。一般而言，对于器官/组织富集的miRNA，这将与如上所提出的方法相同：器官/组织富集的miRNA将帮助检测特定器官或组织中的病理；另一方面，特定一般性病理的miRNA特征将帮助检测该种病理存在于身体的某个部位，而不指示所参与的特定器官/组织。在器官系统、器官、组织和/或细胞类型中富集的miRNA生物标记物和特定一般性病理所特有的miRNA生物标记物的组合使用将提供更精确的诊断，即在特定器官或组织或细胞类型中特定病理的存在。例如，血浆中低氧所特有的miRNA的浓度增加，结合以心脏中富集的miRNA的浓度增加，将提供通过UST获得的心脏缺血的更具体的诊断。
因此，在一个方面，本发明提供一种用于检测受试者的任何器官系统中的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述各种器官系统中富集的miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量预选的标准物(normalizer)miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的在所述器官系统中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有特定器官系统的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的在所述器官系统中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有特定器官系统的病理。
本发明还提供一种用于检测受试者中的器官系统的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述器官系统中富集的至少一种miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有所述器官系统的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有所述器官系统的病理。
用于上述两种方法的标准物miRNA可为例如遍在miRNA、在许多器官中表达但在所述器官系统中表达不足的miRNA或实验选择的在所述器官系统中富集的miRNA。
用于上述两种方法的miRNA的水平的对照比可为预定标准(如，使用各自的器官系统未患有病理的对照受试者群体[例如，与诊断受试者年龄相称]确定)或为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同mRNA的水平比。
在一个实施方案中，上述两种方法包括测定两种或更多种miRNA比。
在上述方法的一个实施方案中，在器官系统中富集的miRNA选自下表2所列的miRNA。
在上述方法的另一实施方案中，器官系统为中枢神经系统，和miRNA/标准物对选自下表4中所列的那些。
在上述方法的再一实施方案中，器官系统为呼吸系统，和miRNA/标准物对选自下表5中所列的那些。
在上述方法的进一步的实施方案中，器官系统为胃肠(GI)系统，和miRNA/标准物对选自下表7中所列的那些。
在另一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的任何器官的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述各种器官中富集的miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量预选的标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的在所述器官中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有特定器官的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的在所述器官中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有特定器官的病理。
本发明还提供一种用于检测受试者中的器官的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述器官中富集的至少一种miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有所述器官的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有所述器官的病理。
用于上述两种方法的标准物miRNA可为例如遍在miRNA、在许多器官中表达但在所述器官中表达不足的miRNA或实验选择的在所述器官中富集的miRNA。
用于上述两种方法的miRNA的水平的对照比可为预定标准(如，使用各自的器官未患有病理的对照受试者群体[例如，与诊断受试者年龄相称]确定)或为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同mRNA的水平比。
在一个实施方案中，上述两种方法包括测定两种或更多种miRNA比。
在上述两种方法的一个实施方案中，在器官中富集的miRNA选自下表1和2所列的miRNA。
在上述两种方法的另一实施方案中，器官为胃肠(GI)器官，和miRNA/标准物对选自下表9中所列的那些。
在另一方面，本发明提供一种用于检测受试者的任何组织的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述各种组织中富集的miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的在所述组织中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有特定组织的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的在所述组织中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有特定组织的病理。
本发明还提供一种用于检测受试者中的组织的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述组织中富集的至少一种miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有所述组织的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有所述组织的病理。
用于上述两种方法的标准物miRNA可为例如遍在miRNA、在许多组织中表达但在所述组织中表达不足的miRNA或实验选择的在所述组织中富集的miRNA。
用于上述两种方法的miRNA的水平的对照比可为预定标准(如，使用各自的组织未患有病理的对照受试者群体[例如，与诊断受试者年龄相称]确定)或为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同mRNA的水平比。
在一个实施方案中，上述两种方法包括测定两种或更多种miRNA比。
在上述两种方法的一个实施方案中，在组织中富集的miRNA选自下表1和2所列的miRNA。
在另一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的任何细胞类型的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述各种细胞类型中富集的miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的在所述细胞类型中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有特定细胞类型的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的在所述细胞类型中富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有特定细胞类型的病理。
本发明还提供一种用于检测受试者中的细胞类型的病理的方法，所述方法包括：
a.测量在所述细胞类型中富集的至少一种miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有所述细胞类型的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有所述细胞类型的病理。
用于上述两种方法的标准物miRNA可为例如遍在miRNA、在许多细胞类型中表达但在所述细胞类型中表达不足的miRNA或实验选择的在所述细胞类型中富集的miRNA。
用于上述两种方法的miRNA的水平的对照比可为预定标准(如，使用各自的细胞类型未患有病理的对照受试者群体[例如，与诊断受试者年龄相称]确定)或为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同mRNA的水平比。
在一个实施方案中，上述两种方法包括测定两种或多种miRNA比。
在上述两种方法的一个实施方案中，在细胞类型中富集的miRNA选自下表1和2所列的miRNA。
可组合上述方法。例如，检测器官系统的病理之后，可测定受影响的器官和/或组织和/或细胞类型等。
上述任一种方法还可进一步包括鉴定所述病理是否为癌症或炎症，所述方法包括：
a.测量与癌症相关的至少一种miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量与炎症相关的至少一种miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.测量在所涉及的器官系统、器官、组织或细胞类型中富集的至少一种miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
d.测量至少一种标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
e.计算在步骤(a)、(b)、(c)和(d)中测量的miRNA的成对水平比(例如，a/b、a/c、a/d、b/c、b/d和c/d之比)；
f.比较步骤(e)中计算的miRNA的水平比与相应的癌症和炎症特有的预定比，和
g.(i)当在步骤(e)中计算的miRNA的水平比在癌症特有的预定范围内时，将该病理鉴定为癌症，或(ii)当在步骤(e)中计算的miRNA的水平比在炎症特有的预定范围内时，将该病理鉴定为炎症。
在上述方法的一个实施方案中，与癌症和炎症相关的miRNA选自下表3所列的miRNA。
在上述方法的一个实施方案中，该病理涉及肺，和miRNA对选自下表6所列的那些。
在上述方法的一个实施方案中，该病理涉及胃肠(GI)系统，和miRNA对选自下表8所列的那些。
在上述方法的一个实施方案中，该病理涉及呼吸系统或胃肠(GI)系统，和miRNA对选自下表11所列的那些。
类似的方法可应用于从低氧来区分癌症或炎症。
上述任一种方法之后，可向受试者施以疾病特异性诊断试验。
上述任一种方法之后，可向已诊断为患有所述病理的受试者施以治疗处理。
上述任一种方法之后，可招募临床试验受试者(这可应用于诊断为患有病理的受试者和未患有病理的受试者二者)。
本发明的上述方法可应用于检测任何受试者的病理，所述受试者包括没有指示所述器官系统或器官或组织或细胞类型的病理的临床症状的受试者。
在单独的方面，本发明提供用于减缓器官系统或器官或组织或细胞类型的病理的进程或治疗器官系统或器官或组织或细胞类型的病理的化合物的鉴定方法，所述方法包括：
a.测量在所述器官系统或器官或组织或细胞类型中富集的至少一种miRNA在从患有所述器官系统或器官或组织或细胞类型的所述病理的受试者采集的一种或多种体液样品中的水平，其中所述体液样品在试验化合物给药前采集；
b.测量标准物miRNA在从试验化合物给药前的受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的在试验化合物给药前从受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
d.测量与步骤(a)相同的miRNA在从试验化合物给药后的受试者采集的一种或多种体液样品中的水平；
e.测量与步骤(b)相同的标准物miRNA在从试验化合物给药后的受试者采集的相同体液样品中的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的在试验化合物给药后从受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则将该试验化合物鉴定为对减缓所述器官系统或器官或组织或细胞类型的所述病理的进程或治疗所述器官系统或器官或组织或细胞类型的所述病理有用；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则将该试验化合物鉴定为对减缓所述器官系统或器官或组织或细胞类型的所述病理的进程或治疗所述器官系统或器官或组织或细胞类型的所述病理无用。
在上述方法的一个实施方案中，该病理为癌症或炎症或低氧，和miRNA选自下表3所列的miRNA。
在另一方面，本发明提供用于确定化合物(如，在临床试验中测试的化合物)或环境因素(如，变应原、吸烟、UV、辐射、石棉等)对没有器官系统或器官或组织或细胞类型的病理的受试者的所述器官系统或器官或组织或细胞类型的毒性的方法，所述方法包括：
a.测量在所述器官系统或器官或组织或细胞类型中富集的至少一种miRNA在受试者已暴露于化合物或环境因素之前在从受试者采集的一种或多种体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在受试者已暴露于化合物或环境因素之前在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的在受试者已暴露于化合物或环境因素之前在从受试者采集的各体液样品中的miRNA的水平比；
d.测量在所述器官系统或器官或组织或细胞类型中富集的相同miRNA在受试者已暴露于化合物或环境因素之后在从受试者采集的一种或多种体液样品中的水平；
e.测量相同标准物miRNA在受试者已暴露于化合物或环境因素之后在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的各体液样品中的miRNA的水平比；
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不高于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该化合物或环境因素对所述器官系统或器官或组织或细胞类型没有毒性；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比高于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该化合物或环境因素对所述器官系统或器官或组织或细胞类型有毒性。
在一个实施方案中，上述两种方法包括测定两种或更多种miRNA比。
在上述两种方法的一个实施方案中，在器官系统或器官或组织或细胞类型中富集的miRNA选自下表1和2所列的miRNA。
在上述两种方法的一个实施方案中，器官系统为中枢神经系统，和miRNA/标准物对选自下表4中所列的那些。
在上述两种方法的一个实施方案中，器官系统为呼吸系统，和miRNA/标准物对选自下表5中所列的那些。
在上述两种方法的一个实施方案中，器官系统为胃肠(GI)系统，和miRNA/标准物对选自下表7中所列的那些。
上述方法中的各测量步骤不必以上述所列的特定顺序进行。
用于本发明方法的受试者包括，例如人、兽医用动物和疾病的实验动物模型。例如在下表1-11中提供用于本发明的上述方法的生物标记物miRNA和标准物miRNA的非限制性实例。
可用于本发明方法的体液样品的非限制性实例包括，例如尿液、血浆和血清。如果使用尿液，则优选已在膀胱内保留小于4小时的尿液样品。
用于测定本发明方法中的miRNA水平的方法的非限制性实例包括例如杂交、RT-PCR和直接测序。
在一些实施方案中，本发明的方法包括(例如，作为初始步骤)从受试者采集体液样品的步骤。
在一个实施方案中(适用于本发明上述方法的任一种)，该方法还包括减少或消除miRNA降解的步骤。用于减少或消除miRNA降解的有用方法的非限制性实例包括，例如添加RNase抑制剂、用氯化胍处理、用异硫氰酸胍处理、用N-月桂酰肌氨酸处理、用十二烷基硫酸钠(SDS)处理及其组合。
连同上述诊断和筛选方法，本发明还提供包括对检测靶miRNA特异的一种或多种引物和/或探针组(probe sets)的各种试剂盒。此类试剂盒可进一步包括对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针组。试剂盒中引物或探针的组合的非限制性实例如下：
1.对选自由miR-1、22、30a-3p、30e-3p、133a、133b、197、208a、208b、221、222、302a、302c、367、378、499-5p和30e*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
2.对选自由miR-1、22、95、133a、133b、140和206组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
3.对选自由miR-15b、18b、21、34b、126、135b、142-3p、142-5p、146、146b-5p、155、199b-5p、200c、205、211、223、224、302b、375、449a、449b、450b-5p、486、492、522、566、574-3p、620、650、766和886-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
4.对选自由miR-34b、135b、146、146b、147b、155、199b-5p、200b、200c、205、219-5p、223、302b和375组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
5.对选自由miR-30e-3p、122a、130b、136、148a、194、376c、455-3p、518b、616、801、885-5p、17*、30d*和194*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
6.对选自由miR-10a、10b、30a-3p、30c、107、135a、135b、184、187、190、194、196b、200a、204、211、324-5p、489、500、501-5p、502-3p、502-5p、503、506、508-3p、508-5p、509-3p、509-5p、510、532-5p、768-3p、886-3p、886-5p、891a、10b*、30a*、30c-2*、30e*、200a*、200b*、424*和500*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
7.对选自由miR-Let-7g、18、23b、26a、26b、27b、28、106b、143、145、152、218、221、223、296、374、422b和451组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
6.对选自由miR-10b、30、99a、139-3p、139-5p、193a-5p、196a、224、335、365、378/378*、422b、494、518d-3p、642a-3p、708、10b*和335*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
7.对选自由miR-let-7a、10b、26a、30a-3p、30a-5p、125b、126、145、146、195、196a-2、196b、206、335、339-5p、378、516-5p、517c、519c、520g、520h、525和1246组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
8.对选自由miR-Let-7a、let-7b、let-7c、10b、17-3p、26a、100、125a、125b、127、195、199a-5p、202、214、298、382、503、672、741、742、883-3p、199a*和202*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
9.对选自由miR-10a、10b、31、34b、34c、135a、135b、424和449组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
10.对选自由miR-Let-7c、10b、26a、99a、100、125a-5p、125b、130a、140、143、145、195、196b、199b、204、214、222、939和199*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
11.对选自由miR-Let-7a、let-7c、let-7g、10b、100、101、125a-5p、125b、130a、134、140、143、145、186、195、196b、197、199a、199b、204、214、218、222、320、424、497、154*和199a*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
12.对选自由miR-Let-7c、1、23b、24、27b、28、34a、99a、100、125b、130a、143、145、147b、187、188-3p、199b-5p、205、214、222、328、373、410、455-5p和490-3p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
13.对选自由miR-15b、34a、34b、34c、127、134、135a、135b、187、202、204、370、372、376a、382、424、449、465a-5p、465b-5p、506、508、509、510、514、517a、517c、871-5p、871-3p、888、202*和888*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
14.对选自由miR-Let-7家族、10a、17、18a、19a、19b、20a、92、21、22、23a、24、27a、27b、29a、31、34a、98、100、106a、126、130a、133a、143、145、146a、199a-3p、210、221、222、345、365、382、409-3p、431、484、495、532-5p、939、27a*、30a*、30e*、93*、126*、130b*和222*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
15.对选自由miR-15a、15b、126、139、142-3p、142-5p、146、150、155、181a、181b、181d、223、302b和342组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
16.对选自由miR-15a、15b、17-5p、20b、106a、106b、142-3p、142-5p、146、149、150、155、181a、181b、181c、182、183、205、213和342组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
17.对选自由miR-Let-7g、15a、20b、21、106b、140、142-3p、146、146b、150、181b、181d、342和431组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
18.对选自由miR-Let-7g、9、15a、15b、17、19b、20a、31、106a、124a、124b、128a、137、142-3p、146b-5p、150、186、191、197、222、223、328、342-3p、423、431、454、484、766、27*和223*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
19.对选自由miR-142-3p、146a、155、181a、205、223和424组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
20.对选自由miR-142、150和342组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
21.对选自由miR-Let-7i、1、7、135a、135b、206和345组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
22.对选自由miR-Let-7g、7、15a、26b、27a、99b、124、127、132、134、137、139、152、181a、187、195、192、202、299、302b、323、324-3p、324-5p、328、330-3p、331、335、340、365、369-3p、375、379、382、409-5p、429、431、432、455-5p、483-5p、514、126*、182*和202*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
23.对选自由miR-7、18a、21、29a、34a、103、127-3p、129-3p、130b、134、135a、135b、136、141、148a、182、183、184、192、193a-3p、193a-5p、195、199a-3p、199a-5p、200b、200c、204、216a、216b、217、224、340、365、367、374a、374b、375、376a、376c、379、382、383、429、432、451、455-5p、485-5p、487b、497、539、543、642、758、939、130b*、136*、183*、200b*和493*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
24.对选自由miR-7、9、21、127-3p、130b、184、195、216a、216b、217、376a、376c、497、939和493*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
25.对选自由miR-31、141、143、145、147b、192、194、200a、200b、200bN、200c、200cN、215、219-2-3p、321、375、378、422a、429、450b-5p、487a、490-3p、492、504、565、574-3p、622、650、801、143*和200b*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
26.对选自由miR-31、141、143、192、194、200a、200b、200bN、200c、200cN、215、321、375和429组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
27.对选自由miR-31、106a、106b、143、145、148a、203、205、210、211和221组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
28.对选自由miR-7、26a、26b、29c、31、106a、106b、124b、130b、141、145、148a、182、188、192、197、203、375和650组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
29.对选自由miR-Let-7a、7、9、96、98、99a、103、107、124a、125a、125b、127、128a、132、134、135a、137、138、149、153、154、181a、181b、181c、182、183、184、204、211、212、213、218、219、221、222、299-3p、299-5p、323-3p、324-5p、328、329、330、331、335、337、338、342、346、369-3p、369-5p、370、379、381、382、383、409-3p、411、425、432、433-5p、485-3p、485-5p、487b、488、491-5p、494、495、496、504、539、541、543、584、656、668、758、874、889、935、939、1193、1197和9*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
30.对选自由miR-7、9、98、124a、125a、125b、128a、132、134、135a、137、138、154、182、183、213、218、323-3p、329、337、369-3p、369-5p、370、381、382、409-3p、425、433-5p、483-3p、485-5p、487b、494、495、496、541、543、656、668、874、889、935、939和9*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
31.对选自由miR-9、124a、125a、125b、128a、132、134、181c、212、213、222、330-3p、338-5p、342、381、382、425、433和491-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
32.对选自由miR-9、96、99a、103、124a、125b、128a、132、134、137、138、181a、181b、212、219、221、222、324-5p、328、330、331、335-5p、338、369-3p、381、382、383、425、433-5p、485-5p和491-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
33.对选自由miR-7、124a、128a、132和212组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
34.对选自由miR-9、103、124a、125b、128、132、134、137、138、181a、181b、181c、204、212、213、218、338、381、382、425、432和489组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
35.对选自由miR-103、134、138、182、183、222、323-3p、369、381和382组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
36.对选自由miR-218、219、338、451和486组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
37.对选自由miR-7、132、212、213和328组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
38.对选自由miR-34b、135b、146、146b-5p、155、199b-5p、200c、205、223、302b和375组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
39.对选自由miR-15b、18b、21、126、142-3p、142-5p、224、449a、449b、450b-5p、486、492、522、566、574-3p、650、766和886-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
40.对选自由miR-147b、200b和219-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
41.对选自由miR-31、130b、136、141、143、145、148a、192、203、215、375、376c、429、455-5p和650组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
42.对选自由miR-106a、106b、205、210和221组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
43.对选自由miR-7、26a、26b、26c、106a、106b、124b、182、188和197组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
44.对选自由miR-194、200a、200b、200c和321组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
45.对选自由miR-147b、194、200a、200b、200c、219-3p、378、450-5p、487a、490-3p、492、504、565、574-3p、622、801、143*和200b*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
46.对选自由miR-122a、194、518b、616、801、885-5p、17*、30d*和194*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
47.对选自由miR-7、18a、21、29a、34a、103、127-3p、129-3p、134、135a、135b、182、183、184、193a-3p、193a-5p、195、199a-3p、199a-5p、200b、200c、204、216a、216b、217、224、340、365、367、374a、374b、376a、379、382、383、432、451、485-5p、487b、497、539、543、642、758、939、130b*、136*、183*、200b*和493*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针.
48.对选自由miR-1、22、95、133a、133b、140和206组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
49.对选自由miR-Let-7a、7、9、124a、125a、125b、128a、132、134、135a、137、138、181a、181c、182、184、211、212、213、218、219、222、323-3p、338-5p、369、381、382、425、433-5p、485-5p、491-5p、539、541、543、656、874、935和9*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
50.对选自由miR-7、9、98、124a、125a、125b、128a、132、134、135a、137、138、154、182、183、213、218、323-3p、329、337、369-3p、369-5p、370、381、382、409-3p、425、433-5p、483-3p、485-5p、487b、494、495、496、541、543、656、668、874、889、935、939和9*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
51.对miR-330-3p和miR-342特异的引物或探针。
52.对选自由miR-96、99a、103、181b、221、324-5p、328、330、331、335-5p和383组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
53.对选自由miR-103、181b、204、432和489组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
54.对miR-103和miR-183特异的引物或探针。
55.对miR-451和miR-486特异的引物或探针。
56.对选自由miR-22、133a、221、222和30e*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
57.对选自由miR-1、30a-3p、30e-3p、133b、197、208a、208b、302a、302c、367、378和499-5p组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
58.对选自由miR-Let-7、10a、17、18a、19a、19b、20a、21、23a、24、27a、27b、29a、31、34a、92、98、100、106a、126、130a、143、145、146a、199a-3p、210、345、365、382、409-3p、431、484、495、532-5p、939、27a*、30a*、93*、126*、130b*和222*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
59.对选自由miR-Let-7a、Let-7c、10b、26a、100、125a、125b、130a、140、143、145、195、196b、199a、199b、204、214、222、424、517c和199a*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
60.对选自由miR-10a、31、34b、34c、135a、135b和449组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
61.对选自由miR-Let-7b、127、202、298、382、503、672、741、742、883-3p和202*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
62.对miR-99a和miR-939特异的引物或探针。
63.对选自由miR-Let-7g、101、134、186、197、218、320、497和154*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
64.对选自由miR-126、146、205、206、335、339-5p、378、516-5p、519c、520g、520h、525和1246组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
65.对选自由miR-7、127和493*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
66.对选自由miR-Let-7i、1、135a、135b、206和345组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
67.对选自由miR-Let-7g、15a、26b、27a、99b、124、132、134、137、139、152、181a、187、195、192、202、299、302b、323、324-3p、324-5p、328、330-3p、331、335、340、365、369-3p、375、379、382、409-5p、429、431、432、455-5p、483-5p、514、126*、182*和202*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
68.对选自由miR-9、21、130b、184、195、216a、216b、217、376a、376c、497和939组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
69.对选自由miR-15a、15b、142-3p、142-5p、146、150、181a、181b、181d、205、342和423组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
70.对选自由miR-126、139、155、223和302b组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针.
71.对选自由miR-17-5p、20b、106a、106b、149、155、181c、182、183和213组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
72.对选自由miR-Let-7g、20b、21、106b、140、146b和431组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
73.对选自由miR-Let-7g、9、17、19b、20a、31、106a、124a、124b、128a、137、186、191、197、222、223、328、431、454、484、766、27*和223*组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
74.对选自由miR-155、223和424组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
75.对选自由miR-Let-7家族、10b、17-92家族、21、29a、31、34a、106a,b、126、146a,b、155、184、195、200/141家族、210、373、375、423-5p、451和486组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
76.对选自由miR-21、31、34a、125-5p、125b、126、146a,b、150、155、221、222和223组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
77.对选自由miR-270、373和424组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针。
78.(i)对选自由miR-128、miR-132和miR-874组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针，和(ii)对选自由miR-9、miR-18la、miR-491-5p和miR-141组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
79.(i)对选自由miR-134、miR-323-3p和miR-382组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针，和(ii)对选自由mir-127和miR-370组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
80.(i)对选自由miR-34b、miR-486-5p和miR-192组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针，和(ii)对选自由miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155、miR-223和miR-409-3p组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
81.对miR-34b和miR-155特异的引物或探针。
82.对miR-146b-5p以及对miR-486b-5p和miR-192的至少之一特异的引物或探针。
83.(i)对选自由miR-192、miR-194、miR-203和miR-215组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针，和(ii)对选自由miR-30e-3p、miR-145和miR-148a组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
84.(i)对miR-215特异的引物或探针和(ii)对选自由miR-30e-3p、miR-194和miR-203组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
85.(i)对miR-203特异的引物或探针和(ii)对miR-148a和miR-192的至少之一特异的引物或探针。
86.对miR-194特异的引物或探针和(ii)对miR-148a和miR192的至少之一特异的引物或探针。
87.对选自由miR-194/miR-145、miR-194/miR148a、miR-194/miR-30e-3p、miR-215/miR-203、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR148a、miR-192/miR-145、miR-192/miR148a和miR-192/miR-30e-3p组成的组的至少一种miRNA对特异的引物或探针。
88.对选自由miR-192/miR-126、miR-155/miR-126、miR-145/miR-126、miR-155/miR-30e-3p、miR-192/miR-30e-3p、miR-155/miR-409-3p、miR-486-5p/miR-17-5p、miR-155/miR-17-5p、miR-192/miR-17-5p、miR-146b-5p/miR-31、miR-155/miR-31、miR-192/miR-31、miR-486-5p/miR-155、miR-192/miR-155、miR-145/miR-155、miR-146b-5p/miR-155、miR-486-5p/miR-203、miR-192/miR-203、miR-145/miR-203、miR-192/miR-215和miR-155/miR-215组成的组的至少一种miRNA对特异的引物或探针。
89.对选自由miR-17-5p/miR-155、miR-192/miR-155、miR-215/miR-155、miR-192/miR-30e-3p、miR-155/miR-30e-3p、and miR-146b-5p/miR-30e-3p组成的组的至少一种miRNA对特异的引物或探针。
本发明的试剂盒可进一步包括miRNA分离或纯化手段。
本发明的试剂盒可进一步包括使用说明。
附图说明
图1A-C为示出比较MCI(MCI)和AD患者(AD)以及年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA浓度的图。miR-7(A)、miR-132(B)、miR-874(C)的浓度相对于miR-141归一化(normalization)。这里及其它盒须图(box and whisker plots)中，盒表示结果的50%的分布，盒上下的棒表示结果的80%。点表示位于80%数据以外的分析值。分析的中值由盒内部的线表示。归一化miRNA浓度以相对单位(对数标尺)示于纵轴。
图2A-E为示出比较MCI和AD患者(AD)以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度的图。miR-7(A)、miR-128(B)、miR-132(C)、miR382(D)、miR-874(E)的浓度相对于miR-9归一化。
图3A-E为示出比较MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度的图。miR-132(A)、miR-134(B)、miR-323-3p(C)、miR-382(D)和miR-874(E)的浓度相对于miR-127-3p归一化。
图4A-G为示出比较MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度的图。miR-7(A)、miR-128(B)、miR-132(C)、miR-134(D)、miR323-3p(E)、miR-382(F)和miR-874(G)的浓度相对于miR-181a归一化。
图5A-H为示出比较MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度的图。miR-7(A)、miR-125(B)、miR-128(C)、miR-132(D)、miR-134(E)、miR323-3p(F)、miR-382(G)和miR-874(H)的浓度相对于miR-370归一化。
图6A-H为示出比较MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度的图。miR-7(A)、miR-125(B)、miR-128(C)、miR-132(D)、miR-134(E)、miR323-3p(F)、miR-382(G)和miR-874(H)的浓度相对于miR-491-5p归一化。
图7A-C呈现利用相对于miR-491-5p归一化的miR-128(A)、miR-132(B)和miR-874(C)获得的MCI患者(MCI)与年龄相称的对照(AMC)之间差异的受试者操作特征(Receiver-Operating Characteristic,ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性计算“截流(cutoff)”点(表示为各图上的点)；截流点为生物标记物/标准物比，此处样品属于AMC或MCI组的可能性相等。
图8A-C呈现利用相对于miR-370归一化的miR-134(A)、miR-323-3p(B)和miR-382(C)获得的MCI患者(MCI)与年龄相称的对照(AMC)之间差异的受试者操作特征(ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性，计算“截流(cutoff)”点(表示为各图上的点)；截流点为生物标记物/标准物比，此处样品属于AMC或MCI组的可能性相等。
图9A-F呈现miR128和miR-132(A)、miR-128和miR-874(B)、miR-132和miR-874(C)、miR-134和miR-323-3p(D)、miR-134和miR-382(E)以及miR-382和miR-323-3p(F)之间的关联分析。比较各种生物标记物对的Ct值，并计算斯皮尔曼等级相关系数(Spearman′s rankcorrelation coefficient)r以及95%置信区间(MIN&MAX)。
图10A-D为示出在哮喘和肺炎患者vs非吸烟对照肺(A和B)的血浆中以及在COPD和NSCLC患者vs吸烟对照(C和D)的血浆中肺富集的生物标记物miR-34b和miR-486-5p的浓度的比较的图。生物标记物miRNA的浓度相对于在许多器官中表达但在肺中表达不足的miR-409-3p归一化。
图11A-H为示出在哮喘和肺炎(PNA)患者vs非吸烟对照的血浆中肺富集的生物标记物miR-34b和miR-486-5p的浓度的比较的图。miRNA生物标记物的浓度相对于其它肺富集的miRNA归一化：A,B-miR-155；C,D-miR-146b-5p；E,F-miR-223；G,H-miR-142-5p。
图12A-H为示出在COPD和NSCLC患者vs吸烟对照的血浆中肺富集的生物标记物miR-34b和miR-486-5p的浓度的比较的图。miRNA生物标记物的浓度相对于miR-409-3p或肺富集的miRNA归一化：A,B-miR-155；C,D-miR-146b-5p；E,F-miR-223；G,H-miR-142-5p；I,J-miR-409-3p。
图13A-J为示出在哮喘和肺炎(PNA)患者vs非吸烟对照(A-E)的血浆中和在COPD和NSCLC患者vs吸烟对照(F-J)的血浆中miR-192的浓度的比较的图。miRNA生物标记物的浓度相对于在许多器官中表达但在肺中表达不足的miR-409-3p，或相对于肺富集的miRNA归一化：A,F-miR-409-3p；B,G-miR-155；C,H-miR-146b-5p；D,I-miR-223；E,J-miR-142-5p。
图14A-C为示出在哮喘、肺炎(PNA)、COPD和NSCLC患者vs组合的(非吸烟和吸烟)对照的血浆中的生物标记物miR-34b(A)、miR-486-5p(B)和miR-192(C)的浓度的图。miRNA生物标记物的浓度相对于miR-409-3p(A)或相对于肺富集的miR-223(B)和miR-146b-5p(C)归一化。
图15A-C为示出在患有炎性肺病(哮喘、肺炎和COPD)的所有患者vs患有NSCLC的患者的血浆中生物标记物miR-34b、miR-486-5p和miR-192的浓度的图。miRNA生物标记物的浓度相对于各种肺富集的miRNA归一化：A-miR-155；B,C-miR-146b-5p。
图16A-M为示出在胃肠(GI)系统的器官中、在患有食管(EC)、胃(GC)和结直肠(CRC)癌以及克罗恩氏病(CD)的患者vs对照的血浆中富集的miR-192(A,E,I)、miR-194(B,F,J)、miR-203(C,G,K)和miR-215(D,H,L)的浓度的比较的图。miRNA生物标记物的浓度相对于遍在miR-30e-3p或相对于其它Gl富集的miRNA归一化：A-D-miR-30e-3p；E-H-miR-148a；I-L-miR-145。A-L：患有指示疾病的患者vs对照；M：示出患有所研究的所有GI病理研究(病理)的患者vs对照的血浆中miR-203和miR-192的浓度的比较的图。所有浓度相对于遍在miR-30e-3p归一化并以相对单位(对数标尺)表示。
图17A-G为示出在所有癌症患者(食管、胃和结直肠癌)vs患有克罗恩氏病的患者的血浆中各种miRNA浓度比的比较的图。A：miR-215/miR-30e-3p；B：miR-203/miR-148a；C：miR-194/miR-148a；D：miR-192/miR-203；E：miR-215/miR-203；F：miR-215/miR-194；G：miR-194/miR-192。
图18A-I为示出在患有特定胃肠器官癌症的患者的血浆中各种miRNA浓度比的比较的图。A-C：食管癌(EC)vs胃癌(GC)；D-F：胃癌(GC)vs结直肠癌(CRC)；G-I：食管癌(EC)vs结直肠癌(CRC)。A：miR-194/miR-145；B：miR-194/miR-148a；C：miR-194/miR-30e-3p；D：miR-215/miR-203；E：miR-203/miR-30e-3p；F：miR-203/miR-148a；G：miR-192/miR-145；H：miR-192/miR-148a；I：miR-192/miR-30e-3p。
图19A-W为示出胃肠(GI)系统疾病(克罗恩氏病以及食管、胃和结直肠癌)的所有患者vs患有肺系统疾病(哮喘、肺炎、COPD、NSCLC)的患者的血浆中各种miRNA浓度比的比较的图。A-U：一种生物标记物/标准物miRNA对(A-miR-192/miR-126；B-miR-155/miR-126；C-miR-145/miR-126；D-miR-155/miR-30e-3p；E-miR-192/miR-30e-3p；F-miR-155/miR-409-3p；G-miR-486-5p/miR-17-5p；H-miR-155/miR-17-5p；I-miR-192/miR-17-5p；J-miR-146b-5p/miR-31；K-miR-155/miR-31；L-miR-192/miR-31；M-miR-486-5p/miR-155；N-miR-192/miR-155；O-miR-145/miR-155；P-miR-146b-5p/miR-155；Q-miR-486-5p/miR-203；R-miR-192/miR-203；S-miR-145/miR-203；T-miR-192/miR-215；U-miR-155/miR-215)。V：示出在患有所有GI病理vs所有肺疾病的患者的血浆中miR-486-5p/miR-155和miR-145/miR-155的比的比较的图。W：使用示于图V的miRNA对的患有GI和肺疾病的患者之间差异的受试者操作特征(ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性计算作为生物标记物/标准物比的“截流(cutoff)”点，此处样品属于GI或肺组的可能性相等。
图20A-H为示出在患有炎性疾病(哮喘、肺炎、COPD和克罗恩氏病)的所有患者vs癌症患者(食管、胃、结直肠和非小细胞肺癌)的血浆中各种miRNA浓度比的比较的图。A-F：一种生物标记物/标准物miRNA对(A-miR-17-5p/miR-155；B-miR-192/miR-155；C-miR-215/miR-155；D-miR-192/miR-30e-3p；E-miR-155/miR-30e-3p；F-miR-146b-5p/miR-30e-3p。G：示出在患有所有炎性疾病vs所有癌症患者的血浆中miR-146b-5p/miR-155和miR-146b-5p/miR-30e-3p的比的比较的图。H：使用示于图G的miRNA对的患有癌症和炎性疾病的患者之间差异的受试者操作特征(ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性计算作为生物标记物/标准物比的“截流(cutoff)”点，此处样品属于炎性疾病或癌症患者组的可能性相等。
图21A-B为示出病理的生物标记物训练(training)(A)和分类(B)步骤(procedures)的流程图。
具体实施方式
本发明基于在临床筛选和诊断领域由疾病特异性筛选试验向通用筛选试验(UST)理念的变革，这将检测特定器官系统如胃肠、神经、血液等或特定器官或组织或细胞类型的病理，但将会是疾病非特异性的。另外，此类试验将能够区分某些广泛类型的病理过程，例如炎性疾病和肿瘤。在检测病理后，疾病特异性试验可应用于更具体的诊断。这样的试验还可用于药物筛选以及用于评价各种化合物和环境因素(例如，在药物开发或临床试验期间)的毒性。本发明基于使用在体液中的器官系统-、器官-、组织-和/或细胞类型-富集的miRNA作为器官和/或组织和/或细胞病理的生物标记物，记载了此类miRNA选择的基础，和UST解释的方法。本发明的UST还可包括用于某些一般性病理过程，诸如低氧、炎症、癌变等的miRNA生物标记物。
本发明提供一种新的无创或微创方法用于早期(优选在临床表现之前)检测受试者中的器官系统中或在特定的器官/组织/细胞类型中的病理变化(而不限定具体疾病)，所述方法包括测定器官系统/器官/组织-富集的miRNA在所述受试者的体液(如，血浆、血清、尿液、唾液或其它体液)中与对照相比的水平。具体地，该方法包括：
a.测量在各种器官系统/器官/组织/细胞类型中富集的miRNA在从受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量预选的标准物miRNA在从受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的在所述器官系统富集的miRNA与它们各自的miRNA标准物的水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有特定器官系统/器官/组织/细胞类型的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的在所述器官系统富集的miRNA与其各自的miRNA标准物的水平比不高于相应的对照比时，将受试者鉴定为未患有特定器官系统/器官/组织/细胞类型的病理。
如果对于病理是阳性的，则此类UST应接着进行对通过UST鉴定的器官系统/器官/组织/细胞类型的各种已知的病理的特异的试验。
本发明还提供了用于选择潜在的miRNA生物标记物的方法。为了反映特定器官系统、器官、组织或细胞类型中的病理变化，此类生物标记物应当首先在这些器官系统、器官或组织之一中富集，其次它们在体液中的浓度应当高到足以被检测出。尽管目前不是所有的miRNA都被鉴定出，并且许多miRNA的器官/组织表达谱还是未知的，但公开数据(参见，例如Hua等，BMCGenomics2009,10:214；Liang等，BMC Genomics.2007,8:166；Landgraf等，细胞.2007,129:1401-1414；Lee等，RNA.2008,14:35-42；http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/；http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/)足以制定用于选择潜在生物标记物的主要原理：
1.器官系统/器官/组织/细胞类型-富集。尽管某些miRNA在特定器官或组织中高度富集，例如miR-122在肝脏中富集，miR-124在脑中富集，但是还没有已知的miRNA对一种器官或组织100%特异。当然，与在所有其它器官系统/器官/组织/细胞类型中相比，在给定器官系统/器官/组织/细胞类型中富集的miRNA越高，其作为生物标记物的潜能越好。实际上，如果miRNA在一种器官中的浓度比在其它器官中的浓度高至少4-5倍，则可将其选择为潜在的UST用生物标记物。对于许多器官，可在文献中找到此类miRNA(例如，参见Hua等，BMCGenomics2009,10:214；Liang等，BMC Genomics.2007,8:166；Landgraf等，细胞.2007,129:1401-1414；Lee等，RNA2008,14:35-42；http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/；http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/)。表1表示根据众多公开数据在各种器官中富集的miRNA。可以看出某些miRNA在相同器官系统的不同器官中富集。这尤其是胃肠、神经、生殖和血液器官的特征(表2)。使用这些miRNA允许设计将检测这些系统中而不是特定器官中的病理的试验。同时，存在在系统的一至两种器官中富集的miRNA，这些miRNA可用于能够更精确地确定病理位置的试验。这些miRNA的列表示于表2的第3栏。还存在在两种甚至更多器官中富集的miRNA，其通常在从相同细胞类型的胚胎形成期间发育。在该情况下，miRNA浓度在体液中的增加无法明确解释。然而，在不同组器官中富集的多种miRNA的组合解决该问题，并且本发明还包括用于分析由此类多种miRNA获得的数据的计算机实现方法。同样重要的是要注意，如果第二种器官中富集的miRNA在体液中出现的几率低，则这些miRNA富集不会显著影响试验结果。例如，许多miRNA在皮肤中富集(除了其它器官以外)，但如果这些miRNA位于表皮，则它们从皮肤出现在血流中的几率就非常低，并且本发明的方法使用这些miRNA。
2.miRNA表达水平。由于可期望更多的miRNA生物标记物分子出现于体液中，如果潜在miRNA生物标记物在靶器官系统/器官/组织/细胞类型中的浓度足够高，则试验开展得越早且其灵敏性越高。因此，如果在多种潜在miRNA生物标记物之间存在选择，应选择不仅在靶标中富集而且还高度表达(如，每个细胞≥1000个拷贝)的那些miRNA。这对于小器官或器官中的部分或特定的细胞类型，例如胰腺β-细胞岛尤其重要。这不意味着不高度表达的miRNA就不能用于UST开发，而是低水平表达的miRNA的检测可能需要较大量的体液和更灵敏的miRNA定量技术。同时，由于miRNA在体液中的浓度还取决于其从细胞分泌至细胞外空间和输送至体液的效率(参见下面的部分)，应分析尽可能多的器官系统/器官/组织/细胞类型-富集的miRNA用于实验选择最有潜力的生物标记物。
3.miRNA分泌。无细胞miRNA出现于体液中的方式有多种(Hunter等，PLoSONE.2008,3:e3694；Wang等，Nucleic Acids Res.2010,38:7248-7259；Pigati等，PLoSONE.2010,5:el3515；Gupta等，Circ.Cardiovasc.Genet.2010,3:484-488；Iguchi等，Commun.Integr.Biol.2010,3:478-481；Kosaka等，J.Biol.Chem.2010,285:17442-17452)。miRNA可由于如下原因出现于细胞外空间，然后出现于体液中：(i)细胞死亡和细胞膜渗透(permeabilization)；(ii)某些细胞区室(compartment)如神经元中的轴突、树突和棘状突起的破坏；(iii)胞吐作用(Skog等，Nat细胞Biol.,2008,10:1470-1476)；(iv)起泡(blebbing)(Charras等，Biophys.J.2008,94:1836-1853；Fackler,Grosse,J.细胞Biol.2008,181:879-884)；(v)游离的或蛋白质结合的miRNA的分泌(Wang等，NucleicAcids Res.2010,38:7248-7259)。后一种机理提供了超过50%的无细胞miRNA从肝细胞进入细胞外基质。miRNA的分泌是选择性的且各种miRNA在细胞和细胞外基质中的浓度的比例不同。miRNA分泌的选择性对于选择潜在的生物标记物非常重要。由于还未研究miRNA从正常细胞和在病理发展期间分泌的机理(Rabinowits等，Clin Lung Cancer,2009,10:42-46)，有必要分析更多的miRNA，牢记其中的一些由于在靶器官/组织中高度表达和富集而有发展潜力，它们可以以低水平分泌，反之亦然。另外，目前证实，某些miRNA如miR-451和miR-1246，其以非常低的水平从正常细胞分泌，可以更有效地从病理细胞分泌(Pigati等，PLoSONE,2010,5:el3515)。这些miRNA还可作为潜在的生物标记物来分析，即使它们不在特定的器官系统、器官或组织中高度富集，这是由于它们与更多器官/组织-特异性miRNA的组合将提供对检测病理有用的额外的信息。
重要的是记住，许多miRNA还未被发现，许多目前发现的miRNA在各种组织中的表达谱还未分析。另外，许多器官、组织以及特别是细胞类型并未试验已知miRNA的表达。因此，尽管UST开发可基于许多器官和组织的已公布数据而开始，但另外寻求新生物标记物将增加UST的信息价值。首先，应分析所有已知miRNA在各种的器官系统/器官/组织/细胞类型中的miRNA表达谱来定义新的器官系统-/器官-/组织-富集的miRNA(例如，使用RT-PCR，其目前是miRNA定量测定的最灵敏且变化最小的技术)。其次，应如上所述分析所有新发现miRNA的表达谱。第三，由于所有器官由各种细胞类型组成，应另外分析在特定器官中富集的miRNA的表达以找出其中富集有这些miRNA的细胞类型。目前，此类研究的最佳技术是原位杂交(ISH)。根据目前可获得的各种miRNA，此类信息已包括在表1和2中。例如，除了胰腺富集的miRNA以外，还包括胰腺β-细胞富集的miRNA，以及位于各种脑区域中的神经元中的某些miRNA的富集的信息。
表1.在各种人类器官和组织中富集的miRNA。
多种水平或几代(generation)UST是可能的。第一种可针对人体系统(胃肠、泌尿生殖系统、脑、心血管系统等)开发。接下来的试验水平可关注于器官、组织、细胞类型等。取决于临床需要和经济优势，至少有两种可能的UST版本及其实际应用：(i)首先，可进行人体系统的UST，然后，如果已检测了一种或多种系统的病理，将进行这些系统的器官/组织的试验；(ii)其次，可将器官/组织/细胞类型的UST直接应用于筛选目的。
所有器官和组织由具有不同来源、功能和潜在病理的多种细胞类型构成。尽管本发明主要关注器官和组织以及它们的系统的水平，但当可获得各种细胞类型中的miRNA表达谱的足够信息时，可将相同的方法用于开发覆盖各种细胞类型的UST。目前，已获得胰腺β-细胞的此类信息(表1和2)，使得在UST中包括β-细胞-富集的miRNA可行，例如用于早期检测1型糖尿病。B-和T-淋巴细胞的miRNA标记也是可得的，将它们包含在UST中对早期检测涉及这些细胞类型的病理有益。
表2.在器官系统和仅特定器官中富集的miRNA。
尽管本发明关注不取决于它们的性质而取决于对特定器官系统、器官、组织和/或细胞类型的特异性的UST开发以及其用于早期检测病理的用途，此类试验还可包括其表达增加是最常见的一般性病理如低氧、炎症和癌症的特点的miRNA生物标记物(表3)。用于这些病理的许多更具潜力的miRNA生物标记物将稍后描述。
表3.其水平变化为广泛病理特点的miRNA列表
miRNA 病理*
Let-7家族 癌症
10b 癌症
17-92家族 癌症
21 癌症、炎症
29a 癌症
31 癌症、炎症
34a 癌症、炎症
106a,b 癌症
125a-5p 炎症
125b 炎症
126 癌症、炎症
146a,b 癌症、炎症
150 炎症
155 癌症、炎症
184 癌症
195 癌症
200/141家族 癌症
210 癌症
221 炎症
222 炎症
223 炎症
270 低氧
373 癌症,低氧
375 癌症
423-5p 癌症
424 低氧
451 癌症
486 癌症
*参考：
1.Osada H.,Takahashi T.,Carcinogenesis2007,28,2-12.
2.Scholer N.等，Exptl.Hematology2010,38,1126-1130.
3.Ma L.,Weinberg RA.,Trends in Genetics,2008,24,448-456.
4.Esquela-Kerscher A,Slack FJ,Nature Rev.cancer,2006,6,259-269
5.Krutovskikh VA,Herceg Z，，Bioessays,2010,32,894-904.
6.Wang Q.等，Exptl.Biol.Med.,2012,[Epub Feb16],
7.Oglesby IK等，Respiratory Res.,2010,11,148.
8.Leidinger P.等，Frontiers in Genetics,2012,2,104.
9.Lujambio A,Lowe SW.,Nature,2012,482,347-355.
10.Yu D.-C.,等，Int.J.Mol.Sci.,2012,12,2055-2063.
在下述实施例中所述的各种有用的miRNA生物标记物和标准物可总结于下表：
表4：MCI/AD的生物标记物/标准物对
编号 生物标记物 标准物
1 miR-128 miR-9、miR-181a、miR-491-5p、miR-141
2 miR-132 miR-9、miR-181a、miR-491-5p、miR-141
3 miR-874 miR-9、miR-181a、miR-491-5p、miR-141
4 miR-134 mir-127、miR-370
5 miR-323-3p mir-127、miR-370
6 miR-382 mir-127、miR-370
7 所有生物标记物miRNA 几种或所有标准物miRNA的平均值
表5：肺疾病的生物标记物/标准物对
编号 生物标记物 标准物
1 miR-34b miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155、miR-223、miR-409-3p
2 miR-486-5p miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155、miR-223、miR-409-3p
3 miR-192 miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155、miR-223、miR-409-3p
表6：用于区分NSCLC与肺炎性疾病的生物标记物/标准物对
编号 生物标记物 标准物
1 miR-34b miR-155
2 miR-486b-5p miR-146b-5p
3 miR-192 miR-146b-5p
表7：GI疾病的生物标记物/标准物对
编号 生物标记物 标准物
1 miR-192 miR-30e-3p、miR-145、miR-148a
2 miR-194 miR-30e-3p、miR-145、miR-148a
3 miR-203 miR-30e-3p、miR-145、miR-148a
4 miR-215 miR-30e-3p、miR-145、miR-148a
表8：用于区分克罗恩氏病和GI癌症的生物标记物/标准物对
编号 生物标记物 标准物
1 miR-215 miR-30e-3p、miR-194、miR-203
2 miR-203 miR-148a
3 miR-194 miR-148a、miR192
4 miR-192 miR-203
表9：miRNA对，其比例区分各种GI器官的癌症
编号比较的癌症 miRNA对
1食管vs胃 miR-194/miR-145、miR-194/miR148a、miR-194/miR-30e-3p
2胃vs结直肠 miR-215/miR-203、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR148a
3食管vs结直肠 miR-192/miR-145、miR-192/miR148a、miR-192/miR-30e-3p
表10：miRNA对，其比例区分肺和GI系统的病理
编号 miRNA对
1 miR-192/miR-126
2 miR-155/miR-126
3 miR-145/miR-126
4 miR-155/miR-30e-3p
5 miR-192/miR-30e-3p
6 miR-155/miR-409-3p
7 miR-486-5p/miR-17-5p
8 miR-155/miR-17-5p
9 miR-192/miR-17-5p
10 miR-146b-5p/miR-31
11 miR-155/miR-31
12 miR-192/miR-31
13 miR-486-5p/miR-155
14 miR-192/miR-155
15 miR-145/miR-155
16 miR-146b-5p/miR-155
17 miR-486-5p/miR-203
18 miR-192/miR-203
19 miR-145/miR-203
20 miR-192/miR-215
21 miR-155/miR-215
表11：miRNA对，其比例区分肺和GI系统的炎性病理和癌症
编号 miRNA对
1 miR-17-5p/miR-155
2 miR-192/miR-155
3 miR-215/miR-155
4 miR-192/miR-30e-3p
5 miR-155/miR-30e-3p
6 miR-146b-5p/miR-30e-3p
对于测量体液中miRNA水平的有用的方法的实例包括用选择性探针的杂交(如，使用RNA印迹法(Northern blotting)、基于珠的流式细胞仪、寡核苷酸微芯片[微阵列]或溶液杂交分析如Ambion mirVana mirna检测试剂盒)、基于聚合酶链式反应(PCR)的检测(如，茎-环反转录-聚合酶链式反应[RT-PCR]、基于定量RT-PCR的阵列法[qPCR-array])或通过下一代测序技术(如，Helicos小RNA测序(Helicos small RNA sequencing)、miRNABeadArray(Illumina)、Roche454(FLX-钛)和ABI SOLiD)之一的直接测序法。为了参考其它适用的技术，参见例如Chen等，BMC Genomics,2009,10:407；Kong等，J CellPhysiol.2009；218:22-25。由于许多组织/器官-特异性miRNA以比遍在miRNA低的浓度存在于体液，且筛选试验应能够检测早期疾病相关的变化(其可相对低)，至少在原理论证阶段，重要的是使用测量miRNA水平的最灵敏且最小变化的技术。在本发明中，贯穿整个研究使用RT-PCR，其检测大量血浆miRNA且比各种阵列技术明显更强大。这不排除使用导致临床试验的其它miRNA分析技术。
在一些实施方案中，将miRNA在定量前纯化。miRNA可通过各种方法从体液分离纯化，包括使用商品化试剂盒(如，miRNeasy试剂盒[Qiagen]、MirVana RNA分离试剂盒[Ambion/ABI]、miRACLE[Agilent]、高纯化miRNA分离试剂盒[Roche]和miRNA纯化试剂盒[Norgen Biotek Corp.])、Trizol提取(参见下述实施例1)、在阴离子交换剂上的浓缩纯化、由RNA结合底物覆盖的磁珠或在互补寡核苷酸上某些miRNA的吸附。
在一些实施方案中，减少或消除体液样品中和/或小RNA纯化期间的miRNA降解。用于减少或消除miRNA降解的有用的方法包括，但不限于，添加Rnase抑制剂(如，RNasin Plus[Promega]、SUPERase-In[ABI]等)、使用氯化胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸处理、十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。另外，当使用尿样作业时，当样品在膀胱内保留较短时间(如，小于4小时)时，可实现miRNA降解的较低风险。当在miRNA定量前需要样品储运时，减少体液样品中miRNA的降解特别重要。
本发明还提供几种在体液中检测的miRNA浓度归一化的方法。为了解释纯化期间给定miRNA的可能损失、潜在的RT-PCR抑制、样品分离和处理期间源自染色或损伤的血液或尿液细胞的miRNA污染、肾脏滤过的变化等，可采用各种实验数据归一化方法。例如，在本发明中可使用下列归一化方法中的一种或多种：
a)可合成合成的miRNA(如人细胞中不存在的miRNA)寡核苷酸并用作纯化和RT-PCR抑制期间的损失对照(在miRNA纯化之前将这些添加至体液样品)。
b)靶miRNA的浓度可归一化为遍在miRNA(如miR-16、miR-30e、miR-103等等)、小核仁RNA(snoRNA)、U6小核RNA(U6RNA)之一。
c)另一方法基于靶miRNA浓度相对于在多种组织中表达但不在靶组织中表达的miRNA的归一化。例如，miR-10a和miR-141以比其它器官低很多的水平在脑中表达，miR-409-3p以比其它组织低很多的水平在肺中表达。该方法降低标准物miRNA因靶病理而变化的几率。
d)靶miRNA的浓度还可归一化为在其它器官中的miRNA(如，在心脏中富集的miRNA相对于在结肠或脑中富集的miRNA归一化，反之亦然)。
e)如果在同一系统的不同细胞类型或不同器官中表达生物标记物和标准物miRNA，则靶miRNA相对于在相同器官、组织或器官系统中富集的其它miRNA的归一化可为有效的。
f)如果它们的表达和/或分泌受病理不同地影响，则靶miRNA相对于来自相同器官和组织的另一miRNA的归一化。
g)当例如靶miRNA的表达和/或分泌中的变化是特定病理(癌症、炎症等)的特征，但该miRNA不在靶标器官/组织中富集时，靶miRNA相对于组织-富集的miRNA的归一化是有用的。在此类情况下，相对于组织-富集的miRNA的归一化将有助于将病理与特定器官或器官系统相联系。
h)相对于几种miRNA标准物的平均值的归一化，或者如果分析许多，如>15种miRNA，则相对于所试验的所有miRNA的平均值归一化。
i)为了解释肾脏滤过(当用尿液样品作业时)的变化，尿中的miRNA浓度可基于肌酸酐和/或白蛋白水平归一化。
连同进一步数据处理的归一化计算可通过UST软件完成，其由三个部分组成：
·用于接入和维护K库(base)和I库的数据库管理系统(DBMS)。其可为工业标准体系之一，例如但不限于SQL服务器、Oracle、MySQL等。
·用于研究阶段的筛选试验开发的应用。该应用的功能包括选择适合的miRNA和构建D集合、创建病理集合等。该应用为台式且包括：(i)用于进入/检验K库和I库中的数据并控制算法运行的用户界面；(ii)用于开发阶段的学习和分类的数据处理；(iii)用于D集合一致性检验等的服务程序等；(iv)用于K库和I库中表格创建/验证/修正的脚本。数据处理的算法(算法1)包括学习和分类部分。
·用于UST临床应用中筛选试验处理的应用。该应用的功能包括使用大量数据训练并基于实际筛选试验数据分类。该应用可为台式，或网络应用，并包括：(i)用于进入/检验I库中的数据并控制算法运行的用户界面；(ii)用于受试者数据的学习和/或分类的数据处理；(iii)用于K库和I库中表格创建/验证/修正的脚本；这些表格不同于筛选试验开发应用中的那些。如在算法1中那样，数据处理的算法(算法2)包括学习和分类，并可与算法1中的那些不同。
如以下在实施例中详细讨论的，通过来自患有不同的几种器官疾病的患者的血浆miRNA分析来验证所提出的方法。
1.神经系统：
a)MCI(轻度认知障碍)；
b)阿尔茨海默病(AD)。
2.胃肠系统：
a)食管癌症；
b)胃癌；
c)结肠癌症；
d)克罗恩氏病。
3.呼吸系统：
a)哮喘；
b)肺炎；
c)COPD(慢性阻塞性肺疾病)；
d)肺癌。
为了选择生物标记物和标准物miRNA，通过RT-PCR分析在各器官或器官系统中富集的多种miRNA的血浆浓度。还分析在多种器官中表达但在靶标器官中表达不足的遍在miRNA和miRNA作为潜在的标准物。作为潜在的生物标记物和标准物试验各器官或器官系统分析的所有miRNA，将提供在病理和各对照之间的统计学上显著的差异的组合选作最具有发展潜力。
神经系统
将轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的早期检测用于验证为开发用于神经系统的筛选试验所提出的方法。AD为最常见的神经退行性疾病，其包括由脑细胞的代谢变化、神经元的突触和其它区室的损失以及最终的神经元死亡引起的一大组病理(为参考，参见Neurodegenerative diseases:From Molecular Concepts to Therapeutic Targets.编辑：R.von Bernhardi,N.C.Inestrosa,Nova Publishers,2008)。AD的特征在于神经突退缩、轴突输送缺陷、突触机能障碍、突触损失，并最终特征在于脑的几种疾病特异区域如海马体和皮质的神经元死亡(参见，例如Crews,Masliah,Human Mol Gen.,2010,19:R12-R20；Bredesen,Molecular Neurodegeneration2009,4:27；Nimmrich和Ebert,RevNeurosci.2009,20:1-12；Yoshiyama等，Neuron.2007,53:337-351；Wishart等，JNeuropathol Exp Neurol.2006,65:733-739；Gylys等，Neurochem Int.2004;44:125-131；Conforti等，Trends Neurosci.2007,30:159-166；Revuelta,等，Am J Alzheimers DisOther Demen2008,23:97-102)。
表现为轻度临床症状的AD的第一症状阶段为MCI，其通常被定义为正常老龄化和痴呆症之间的中间状态(DeCarli,Lancet Neurol.,2003,2:15-21；Stephan等，Alzheimer′s Res Therapy,2009,1:1-9；Apostolova等，Human brain Mapping,2010,31:786-797)。MCI为可导致不同结果的异质性综合征。多达40%的MCI患者恢复为正常状态(Larrieu等，Neurology,2002,59:1594-1599；Brooks,Loewenstein,Alzheimer′s Res Therapy,2010,2:28-36)，尸体解剖研究表明大量MCI患者不具有AD病理的迹象(Jicha等，Arch Neurol,2006,63:674-681；Khan,Alkon,Neurobiol.Aging,2010,31:889-900)。约60%的MCI患者以每年10-15%的速率转化为痴呆症(Petersen等，Arch Neurol.2001,58:1985-1992；Apostolova等，Human brain Mapping,2010,31:786-797)。尽管AD为痴呆症最常见的原因，但约20%的向痴呆症发展的MCI患者诊断为未患有AD而患有其它神经退行性疾病如血管症、路易氏体(Lewy body)症、亨廷顿症、帕金森症及其它痴呆症(Jicha等，Arch Neurol,2006,63:674-681；Stephan等，Alzheimer′s Res Therapy,2009,1:1-9)。
因此，通过循环miRNA的分析来检测MCI和AD支持了开发用于各种病理的器官/系统-特异性试验的思想。如在选择生物标记物和标准物miRNA的实施例中详细讨论的，通过RT-PCR在MCI和AD患者及年龄相称的对照组的血浆中分析多种脑-富集的miRNA的浓度，包括神经突/突触-富集的miRNA的浓度。作为潜在的生物标记物和标准物以及组合试验所有选择的miRNA，将提供MCI患者和年龄相称的对照之间的统计上显著的差异的那些鉴定为最具希望。数据已证实最有效的潜在的生物标记物为神经突/突触miRNA，最有效的标准物为其它脑-富集的miRNA，尽管其它miRNA也可用于归一化。两个家族的生物标记物，miR-132家族和miR-134家族，以及几种标准物在MCI检测中显示最高的灵敏性(84%-92%)和特异性(84%-90%)。miR-134家族成员之间的高度相关可容易通过如下事实来解释，该家族的所有成员，即miR-134、miR-323-3p和miR-382，属于相同的簇并在相同细胞类型中表达。之前未记载过miR-132家族的成员即miR-128、miR-132和miR-874之间的密切关系。同样令人感兴趣的是，在不同标准物的情况下，miR-132和miR-134生物标记物家族产生较好的结果。在标准物miR-491-5p、miR-181a、miR-9和miR-141的情况下，miR-132家族比miR-134家族更有效。另一方面，在标准物miR-370和miR-127的情况下，miR-134家族比miR-132家族产生更好的结果。
因此，异质性MCI综合征和AD可通过分析血浆中的无细胞循环脑-富集的miRNA来检测。
由于不同的脑区域参与导致痴呆症发展的各种神经退行性疾病(Geldmacher&Whitehouse,Neurology.1997,48:S2-9；Levy&Chelune,J Geriatr PsychiatryNeurol.200720:227-238；Gong&Lippa,Am J Alzheimer′s Dis Other Demen,2010,25:547-555)并由于在各种脑区中miRNA表达谱的多样性(Landgraf等，Cell.2007,129:1401-1414;The miR-Ontology Data Base:http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)，所以其它脑-富集的miRNA的分析会有助于区分由脑中不同神经元病理引起的变化和过程。
胃肠系统
将患有三种胃肠(GI)器官(食管、胃和结肠)的1和2阶段以及患有克罗恩氏病(可引起GI道任何部分的炎性肠病)的患者的血浆样品用于验证为开发用于GI系统的筛选试验所提出的方法。测量GI系统中或特别是GI器官中富集的miRNA，例如在结肠和小肠中高度富集的miR-215，和在食管中富集并在胃中富集度较低的miR-203，以及遍在miR-30e-3p的血浆浓度。计算所有可能的miRNA对的比以找出最具有发展前景的生物标记物/标准物组合。所得数据已阐明，miR-192、miR-194、miR-203和miR-215是最有效的生物标记物，miR-145、miR-148a和miR-30e-3p是最有效的标准物。生物标记物/标准物比有效地区分患有所有研究疾病的患者和对照患者。高度富集在食管和胃中的miR-203在检测这些器官的癌症中特别有效，在结肠中高度富集的miR-215在区分患有结肠癌症和克罗恩氏病的患者与对照患者中最有效。两种或更多种生物标记物/标准物比的组合可用于增加特异性和灵敏性。例如，相对于miR-30e-3p归一化的miR-192和miR-203以94%的灵敏性和100%的特异性有效地区分患有GI系统所有病理的患者与对照患者。重要的是，所有试验肿瘤为1或2阶段，这意味着所提出的方法可有效地用于筛选和早期诊断。然后更加详细地比较不同癌症以及克罗恩氏病vs GI系统所有癌症的对。结果已发现下列能够区分特定病理的生物标记物/标准物比：
1.克罗恩氏病vs食管、胃和结直肠癌：miR-194/miR-148；miR-215/miR-30e-3p；miR-215/miR-194；miR-203/miR-148a；miR-192/miR-203；miR-215/miR-203和miR-194/miR-192。
2.食管癌vs胃癌：miR-194/miR-145；miR194/miR-148a；miRl94/miR-30e-3p。
3.食管癌vs结直肠癌：miR-192/miR-145；miR192/miR-148a；miRl92/miR-30e-3p。
4.胃癌vs结直肠癌：miR-203/30e-3p；miR-203/miR-148a；miR-215/miR-203。
因此，在GI系统的器官中富集的miRNA的血浆浓度的分析对下列有效：(i)检测食管、胃和结肠中的肿瘤和炎性病况，例如克罗恩氏病：(ii)区分炎性疾病和癌症；(iii)区分位于GI系统的各种器官中的癌症。
呼吸系统
将患有四种疾病即哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和非小细胞肺癌(NSCLC，1-4阶段)的患者的血浆样品用于验证为开发用于呼吸系统的筛选试验而提出的方法。由于招募的患有哮喘和肺炎的患者为非吸烟者，患有COPD和NSCLC的患者为吸烟者，所以还从两个不同的对照组-吸烟者和非吸烟者收集血浆样品。测量肺富集的miRNA和存在于许多器官但在肺中表达不足的miR-409-3p的血浆浓度。再次，如上对GI系统的描述，计算所有可能的miRNA对的比以找出最具发展前景的生物标记物/标准物组合。
已发现在肺中高度富集的miR-34b和miR-486-5p为相对于miR-409-3p归一化的有效的生物标记物，其区分来自非吸烟对照的患有哮喘和肺炎的患者与来自吸烟对照的患有COPD和NSCLC的患者。其它有效的标准物为肺-富集的miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155和miR-223，可能是由于它们在肺病理中的下调(Liu X.等，Clin.Cancer Res.2009,15:1177-1183；Miko E.等，Exp.Lung Res.2009,35:646-664；Halappanavar S.等，Toxicology2011,285:133-141；Heegaard NH等，Int.J.Cancer,2012,130:1378-1386)。出乎意料地，miR-192还起到肺病理的有效生物标记物的作用。由于还示出该miRNA为对GI系统疾病有效的生物标记物，因此有理由建议miR-192的表达或/和分泌由于炎症或肿瘤发展过程而增加(Benjamin H.等，J.Mol.Diagn.2010,12:771-779；LanHY.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2011Dec.28[印刷前的电子版(Epub ahead ofprint)]；Luzna P.等，Diagn.Pathol.2011,6:114；Wu Q.等，J.Biomed.Biotechnol.2011,Epub May26；Zhou J.等，J.Clin.Oncol.2011,29:4781-4788)。
由于miRNA生物标记物/miRNA标准物比对于吸烟和非吸烟对照没有不同，因此将四种病理与组合的对照(combined controls)(吸烟和非吸烟受试者)相比较。所得数据表明，通过各种miRNA生物标记物和标准物的组，例如相对于miR-409-3p归一化的miR-34b、相对于miR-223归一化的miR-486-5p或相对于miR-155归一化的miR-192，患有所有四种分析的病理的患者可有效区别于这些组合对照。还存在其它有效的miRNA生物标记物和标准物的组。
还分析了miRNA生物标记物和标准物的各种组合将NSCLC与此类炎性疾病如哮喘、肺炎和COPD区分的能力。结果表明，使用miR-34b与miR-155、miR-486-5p与miR-146b-5p或与miR-142-5p、miR-192与miR-146b-5p的比，使患有NSCLC的患者有效地区别于患有炎性疾病的患者。存在其它有效的miRNA生物标记物和标准物的组合。
因此，可通过分析血浆中无细胞循环miRNA来有效地检测肺系统的病理，如果肺-富集的miRNA用作生物标记物或标准物或二者。一些生物标记物/标准物组合还可有效地区分癌症患者与患有炎性肺疾病的患者。
不同器官系统病理的区分
为了证实基于体液中器官-富集的miRNA的分析的试验能够检测患有特定器官系统病理的患者的思想，必须阐明存在能够区分不同器官系统的病理的miRNA组合。如实施例中详细描述的，从患有GI系统疾病(克罗恩氏病以及食管、胃和结直肠癌)和肺系统疾病(哮喘、肺炎、COPD和NSCLC)的患者获得的血浆样品纯化miRNA。分析肺-富集和GI系统-富集的miRNA以及参与各种器官的病理过程的几种miRNA的浓度。另外，研究中包括遍在miR-30e-3p和miR-409-3p作为潜在的标准物。各miRNA的浓度相对于miR-30e-3p和miR-409-3以及彼此归一化，根据ABI操作手册(2-ΔCt)转化为miRNA的相对量(RQ)，并比较患有肺和GI系统疾病的患者的miRNA谱的特性。数据表明，许多miRNA对有效地区分患有肺和GI系统疾病的患者：miR-192/miR-126；miR-155/miR-126；miR-145/miR-126；miR-155/miR-30e-3p；miR-192/miR-30e-3p；miR-155/miR-409-3p；miR-486-5p/miR-17-5p；miR-155/miR-17-5p；miR-192/miR-17-5p；miR-146b-5p/miR-31；miR-155/miR-31；miR-192/miR-31；miR-486-5p/miR-155；miR-192/miR-155；miR-145/miR-155；miR-146b-5p/miR-155；486-5p/miR-203；miR-192/miR-203；miR-145/miR-203；miR-192/miR-215；miR-155/miR-215。两种miRNA对的组合增加了试验的准确性。例如，miR-145/miR-155和miR-486-5p/miR-155比的组合以95%的灵敏性、90%特异性和93%准确性区分患有GI系统所有病理的患者与患有肺疾病的患者。
各种器官系统中不同病理的区分
由于在各种器官中炎性疾病和癌症发展期间一些miRNA的表达和分泌的特征变化，因此假设在体液中它们浓度的分析可用于区分这些病理。将相同的血浆样品用于miRNA纯化，并分析在前面部分描述的相同的miRNA。在该研究中，调查各种miRNA组合以区分患有炎性疾病(哮喘、肺炎、COPD和克罗恩氏病)的患者与患有各种癌症(食管、胃、结直肠和非小细胞肺癌)的患者的能力。数据表明几种miRNA对有效地区分患有炎性疾病的患者与癌症患者：miR-17-5p/miR-155；mir-192/miR-155；miR-215/miR-155；miR146b-5p/miR155；miR192/miR-30e；miR-146b-5p/miR-30e-3p；miR155/miR-30e-3p。区分炎性疾病与癌症的miRNA对相对于能够区分肺系统疾病与GI系统疾病的miRNA对少。首先，许多miRNA的表达变化是两种病理类型的特征。其次，在许多情况中，癌变伴随相对显著的炎症。两种miRNA对的组合增加了试验准确性。例如，miR-146b-5p/miR-155和miR-146b-5p/miR-30e-3p比的组合以80%灵敏性、98%特异性和89%准确性区分所有患有炎性疾病的患者与癌症患者。
因此，本发明所示的实验结果支持其主要思想。在特定器官系统中或在器官中富集的miRNA的血浆浓度的分析区分：(i)器官系统疾病与对照；(ii)胃肠系统的三种器官的病理；(iii)肺和胃肠系统的疾病；(iv)癌症和炎性疾病。
试剂盒
连同上述诊断和筛选方法，本发明提供包括特异性检测靶miRNA的一种或多种引物和/或探针组的各种试剂盒。此类试剂盒可进一步包括特异性检测标准物miRNA的引物和/或探针组。试剂盒中引物或探针的组合可基于例如表1-11中所列分子的各种组合。
此类试剂盒可用于从患者分离的体液样品中的直接miRNA检测或可用在纯化的RNA样品上。
本发明的试剂盒还可提供用于引物延伸和扩增反应的试剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种或多种下列组分：逆转录酶、DNA聚合酶(诸如热稳定的DNA聚合酶)、聚合酶链式反应缓冲液、逆转录缓冲液和脱氧核苷三磷酸(dNTP)。可选地(或另外地)，试剂盒可包括用于进行杂交分析的试剂。检测试剂可包括核苷酸类似物和/或标记部分，如直接可检测部分如荧光团(荧光染料)或放射性同位素，或间接可检测部分如结合对的成员，例如生物素或能够催化非可溶性比色或发光反应(luminometric reaction)的酶。另外，试剂盒可进一步包括包含用于核酸电泳检测的试剂的至少一种容器。此类试剂包括直接检测核酸的那些如荧光嵌合剂或银染试剂，或指导检测标记的核酸的那些试剂，例如，但不限于ECL试剂。试剂盒可进一步包括miRNA分离或纯化手段以及阳性和阴性对照。试剂盒还可包括以政府机构规定的形式管理诊断试剂盒的制造、使用或销售的与此相关的注意事项。试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在优选用于以高通量设置的机器人操作的适当装置(housing)中。
试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来重建。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器手段。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常包含另外的组分可单独放置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，各种组分的组合可包括在容器中。
此类试剂盒还可包括保持或维持DNA或RNA的组分，例如保护以抵抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
定义
本文所使用的术语″筛选试验″是指用于疾病早期检测、优选在其临床表现之前的检测的试验。本文主要描述两种筛选试验：(i)检测特定器官系统/器官/组织/细胞类型中的病理的筛选试验，和(ii)检测特定一般性病理变化诸如低氧、炎症或癌变但不将该病理局限于特定器官系统/器官/组织/细胞类型的筛选试验。术语″通用筛选试验(UST)″是指上述筛选试验的一种或两种。
术语″器官系统″是指一组一起作用以执行某一任务的相关器官。例如，食管、胃、十二指肠、小肠和大肠为消化系统的器官。唾液腺、胰腺和肝脏也是消化系统的组分。同时，分泌激素的胰腺β-岛也与内分泌系统相关。
本发明的含义中，术语″器官/组织/细胞类型-富集的miRNA″是指与其它器官、组织或细胞类型相比，在相应器官、组织或细胞类型中以增加量(如，至少高出5倍的浓度)存在的miRNA，并可为试验的体液中可检测量的miRNA的来源。术语″器官系统-富集的miRNA″是指与其它器官系统、器官、组织或细胞类型相比，在相应器官系统的所有或至少几种器官中以增加量(如，至少高出5倍的浓度)存在的miRNA，并可为试验的体液中可检测量的miRNA的来源。为了在本发明的诊断方法中有用，此类器官系统-/器官-/组织-/细胞类型-富集的miRNA应当由于其从细胞中释放并运输至所述体液而在所述体液中可检测。
本文所使用的术语″病理″是指在与其功能障碍和/或局部破坏和/或缺失相关的相应器官、组织或细胞类型中参与代谢和/或结构变化的非特定的病理。术语″与……相关″用于包括任何相关性、共现性和任何因果关系。
本文所使用的术语″microRNA″或″miRNA″是指一类小的约22nt长的非编码成熟RNA分子。它们在通过结合至信使转录本(mRNA)的互补区以抑制其翻译或调控降解的靶基因调控中起到重要作用(Griffiths-Jones Nucleic Acids Research,2006,34,Databaseissue:D140-D144)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，且一种mRNA可受靶向3′UTR不同区域的多种miRNA调控。一旦结合至mRNA，miRNA可通过影响如mRNA翻译和稳定性来调节基因表达和蛋白质产生(Baek等，Nature455(7209):64(2008)；Selbach等，Nature455(7209):58(2008)；Ambros,2004,Nature,431,350-355；Bartel,2004,细胞,116,281-297；Cullen,2004,Virus Research.,102,3-9；He等，,2004,Nat.Rev.Genet.,5,522-531；and Ying等，2004,Gene,342,25-28)。用于本发明方法的器官/组织/细胞-富集的miRNA的实例包括，但不限于表1所列的miRNA。用于本发明方法的器官系统-富集的miRNA的实例包括，但不限于表2第2栏所列的miRNA。在本发明方法的用于更精确定位病理的器官/组织/细胞类型-富集的miRNA的实例包括，但不限于表2第3栏所列的miRNA。
大多数目前已知的miRNA的信息可见于miRNA数据库miRBase(可于万维网mirbase.org获得)。还参见Burside等，BMC Genomics9:185(2008)；Williams等，BMCGenomics8:172(2007)；Landgraf等，细胞129:1401(2007)。
本文所使用的术语″miRNA阵列″是指用于分子生物学和医学的复杂技术。其由排列的一系列多个(例如，上千)微小的寡核苷酸点组成，各自包含与特定靶miRNA互补的特异序列(探针)。在高严格条件下探针-靶标杂交后，所得杂交体通常通过定量荧光团-、银-或化学发光-标记的靶标检测和定量，从而确定miRNA的相对丰度。在本发明的方法中，定制和商购可得的miRNA阵列均可使用。有用的商购可得的miRNA阵列的非限制性实例(基于靶标标记、杂交检测和分析的各种方法)包括由Agilent、Illumina、Exiqon、Invitrogen、Febit和LC Sciences生产的阵列。
本文所使用的术语″下一代测序技术″广义上是指平行产生多个测序反应的测序方法。这使得极大地增加数据的通量和产率。常用的下一代测序平台的非限制性实例包括Helicos小RNA测序、miRNA BeadArray(Illumina)、Roche454(FLX-钛)和ABI SOLiD.
本文所使用的″个体″或″受试者″或″动物″是指神经退行性疾病或其它神经性病理的人、兽医用动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)和实验动物模型(参见下述实施例)。在优选实施方案中，受试者为人。
术语″泌尿道″是指参与尿从身体分泌和消除的器官和管。
本文所使用的术语″纯化″是指已在减少或消除不相关物质即污染物(包括由其获得物质的原料)的存在的条件下分离的物质。例如，RNA纯化包括存在于体液中的蛋白质、脂质、盐及其它不相关化合物的消除。
在物质的分析试验的情况下，即可使用如本文所使用的术语″基本上无″。优选地，基本上无污染物的纯化的物质为至少50%的纯度；更优选地，至少90%的纯度，并仍更优选至少99%的纯度。纯度可通过色谱、凝胶电泳、组成分析、生物学试验以及本领域已知的其它方法来评价。
如本文所使用的，术语″类似处理的″是指使用相同操作手册获得的样品(如，体液样品或纯化的RNA)。
本文所使用的术语″对照水平″包括预定标准(如，参考中公布的值)以及在与对照受试者(如，年龄和性别相称的健康受试者)类似处理的样品中的实验确定的水平。由于本发明描述了可针对相同受试者周期进行的筛选试验，所以来自相同个体的在先数据可用作″对照水平″。
为了区分两种病理，如癌症vs炎症或食管癌vs结直肠癌，血浆中miRNA的水平比将不会与预定的对照比相比较，而是与作为相应病理的特征的血浆中的miRNA水平的预定范围比相比较。为了定义这些比例，将招募几百名患者，并且在其血浆样品中测量感兴趣的miRNA的水平。然后计算各种miRNA对的水平比，这将提供相应病理的特征比的范围并覆盖例如100%、99%或95%的病理情况。实际临床设置中使用的预定范围将根据对试验灵敏性和特异性的需要而确定。
术语″约(about)″或″大约(approximately)″是指在统计学上有意义的值的范围。此类范围可在数量级内，优选在给定值或范围的50%内、更优选在20%内，仍更优选在10%内，甚至更优选在5%内。术语″约″或″大约″所包括的允许的变化取决于待研究的特定系统，并可容易被本领域普通技术人员所理解。
根据本发明，可采用本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术完整解释于文献中。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,分子克隆：实验室手册，第二版。冷泉港，NY:冷泉港实验室出版社，1989(这里，″Sambrook等，1989″)；DNA克隆：实用方法，第Ｉ和Ｉ Ｉ卷(D.N.Glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)；核酸杂交[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.]；转录和翻译[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)]；动物细胞培养[R.I.Freshney编辑(1986)]；固定化细胞和酶[IRL出版社]；B.Perbal,分子克隆实用指南(1984)；Ausubel,F.M.等(编辑)；分子生物学现有操作手册John Wiley&Sons,Inc.,1994。这些技术包括如下述所述的定位诱变：Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985)，美国专利号5,071,743，Fukuoka等，Biochem.Biophys.Res.Commun.263:357-360(1999)；Kim和Maas,BioTech.28:196-198(2000)；Parikh和Guengerich,BioTech.24:428-431(1998)；Ray和Nickoloff,BioTech.13:342-346(1992)；Wang等，BioTech.19:556-559(1995)；Wang和Malcolm,BioTech.26:680-682(1999)；Xu和Gong,BioTech.26:639-641(1999)，美国专利号5,789,166和5,932,419，Hogrefe,Strategies14.3:74-75(2001)，美国专利号5,702,931、5,780,270和6,242,222，Angag和Schutz,Biotech.30:486-488(2001)，Wang和Wilkinson,Biotech.29:976-978(2000)，Kang等，Biotech.20:44-46(1996)，Ogel和McPherson,Protein Engineer.5:467-468(1992)，Kirsch和Joly,Nucl.Acids.Res.26:1848-1850(1998)，Rhem和Hancock,J.Bacteriol.178:3346-3349(1996)，Boles和Miogsa,Curr.Genet.28:197-198(1995)，Barrenttino等，Nucl.Acids.Res.22:541-542(1993)，Tessier和Thomas,Meths.Molec.Biol.57:229-237，以及Pons等，Meth.Molec.Biol.67:209-218。
用于训练数据集(Training Data Set)的术语″标记数据″是指从已知诊断的人的临床样品获得的分析结果。例如，对于miRNA靶向肝脏的标记数据，应从患有肝脏病理(标记″肝脏″和，例如″肝炎″或″肝细胞癌″)和无任何肝脏病理(标记″对照″)的人收集数据。
如本文所使用的，术语″D集合″是指选择用于检测特定器官系统/器官/组织/细胞类型的病理的一组miRNA(生物标记物)。各D集合包括至少一种但典型地超过一种生物标记物，一些生物标记物为超过一个D集合的成员。
术语″K库″是指数据库，包含关于所有筛选试验类型及其组分的知识。
将信息分组在不同表格的组中，例如：
·最新开发的所有筛选试验的列表；
·由那些试验覆盖的所有病理的列表；
·所使用的(以及假定使用)miRNA列表；
·在所有筛选试验中使用的D集合的列表；
·筛选试验类型-D集合-miRNA的关系；
·包含在相应的D集合中使用的各miRNA的常数的表格。
这些表格必须在算法的学习步骤填入，并用于在算法的分类部分中的计算。
该数据库在获得新验证的研究数据时修改和扩充。
术语″I库″是指包含个体筛选试验的实际数据的数据库，包括受试者和相关信息、筛选试验历史、其原始数据和处理结果等的列表。
两种数据库与实施学习/分类的算法的程序一起为本发明的一部分。
在算法描述中使用的术语″迭代(iteration)″。其是指循环执行的程序回路的主体。
实施例
还借助下列实施例描述和说明本发明。然而，在说明书任何位置的这些及其它实施例的使用仅为说明性，并决不限制本发明或任何示例性术语的范围及含义。同样地，本发明不限于这里所述的任何特定的优选实施方案。的确，本发明的许多修改和变化对于本领域技术人员在阅读该说明书时可以是显而易见的，并且此类变化可在不偏离本发明的精神或范围下进行。因此，本发明仅受所附权利要求的用语以及这些权利要求所具有的等同物的完整范围的限定。
实施例1：用于从血清和血浆纯化miRNA的不同方法的比较。
有许多用于miRNA分离的商用试剂盒，包括miRNeasy试剂盒(Qiagen)、MirVanaRNA分离试剂盒(Ambion/ABI)、miRACLE(Agilent)、高纯miRNA分离试剂盒(Roche)和miRNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp.)。另外，通常使用基于使用Trizol(Invitrogen)的内部技术。在Trizol去蛋白作用后，用异丙醇沉淀RNA或另外在硅胶柱上纯化。在一些实验中，用无RNAse的DNAse(Qiagen、ABI、Invitrogen等)处理纯化的RNA。使用RT PCR比较通过不同方法获得的miRNA制备物。
从相同的5名健康供体获得的血浆和血清样品中纯化miRNA。在添加含胍溶液后相对于每1ml血浆或血清掺标(spiked)107个拷贝的拟南芥(Arabidopsis thaliana)miR-159a(ath-miR-159a)用于评价miRNA产量。比较两种技术，一种基于MirVana Paris试剂盒(Ambion/ABI)，另一种基于Trizol(Invitrogen)去蛋白作用，并随后在硅胶柱上纯化。在RNA纯化后，通过RT-PCR在最终的制备物中测量掺标的miRNA和人内源性miR-9、miR-16和miR-134的浓度。MirVana Paris试剂盒在miRNA分离上比基于Trizol的技术更有效，并选择用于进一步实验。尽管所有分析的miRNA在血清和血浆中是可检测的，并且两种样品类型适用于miRNA试验，但血浆的最终PCR Ct值低约2个循环，因而将后者用于随后的实验。基于掺标的ath-miR-159a的定量测量，用MirVana试剂盒从血浆分离的miRNA的平均产量为71.4%。
实施例2：用于试验的miRNA的选择。
潜在的miRNA生物标记物(表1)最初基于关于它们在各种器官和组织中的丰度的文献数据来选择(参见，例如Hua等，BMC Genomics2009,10:214；Liang等，BMCGenomics.2007,8:166；Landgraf等，细胞.2007,129:1401-1414；Lee等，RNA.2008,14:35-42；http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/；http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/)。然后选择对于相同器官系统的几种器官常见的miRNA作为用于相应系统的潜在生物标记物(表2，第2栏)。将在系统的一个器官中富集但不在其它器官中富集的那些miRNA鉴定为用于更精确的病理定位的潜在的生物标记物(表2，第3栏)。对于归一化，除了掺标的合成的非人miRNA如ath-mir-159a和遍在miRNA如miR-16和miR-30e-3p以外，选择在多种组织中表达但不在靶组织中表达的miRNA。例如，miR-10b和miR-141可用于归一化脑生物标记物，miR-409-3p用于肺系统生物标记物，等等。实验选择其它具有发展潜力的在分析的组织、分析的器官和系统中富集的标准物。
根据下述实施例8，作为与K库相对应的D集合必须包括所有这些生物标记物。
实施例3：脑富集的miRNA在诊断为患有神经系统疾病的患者的血清/血浆中的水平增加的检测。
将来自健忘的MCI和AD患者和AMC(每组20名)的血浆样品用于该研究。通过Trizol-硅胶法根据Asuragen步骤从两个200μl等份的血浆样品分离RNA。使用逆转录试剂盒和miRNA特异性茎-环引物(Applied Biosystems)进行单独的靶qRT-PCR。进行RT步骤三次，并且最终的PCR中存在2μl血浆等同物。
示于图1-6的数据表明当与年龄相称的对照比较时，在MCI和AD患者的血浆中神经突/突触miRNA(miR-7、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-323-3p、miR-382、miR-874)的中值浓度增加2-5倍。当相对于脑富集的miRNA如miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p进行归一化时效果更显著。
两个生物标记物家族，miR-132和miR-134家族，以及几种标准物已表现出最高的灵敏性和特异性。这些生物标记物和标准物的组合的受试者操作特征(ROC)曲线示于图7A-C和8A-C。当相对于miR-491-5p标准化时生物标记物miR-128、miR-132和mir-874(″miR-132家族″)表现出84%-92%灵敏性和84%-90%特异性。对于miR-128、miR-132和miR-874的ROC曲线下的面积(AUC)分别为0.95、0.93和0.95。第二具有发展潜力的生物标记物组由miR-134、miR-323-3p和miR-382(″miR-134家族″)组成，并且当相对于miR-370归一化时表现出78%-91%灵敏性和85-87%特异性。对于miR-134、miR-323-3p和miR-382的AUC分别为0.91、0.94和0.92。
示于图9A-F的关联分析表明miR-128、miR-132和miR-874形成一个生物标记物家族(成对比较中的斯皮尔曼试验r值在0.93-0.95范围内)，和miR-134、miR-323-p和miR-382形成另一生物标记物家族(成对比较中的斯皮尔曼试验r值在0.87-0.93范围内)。miR-134家族的成员之间的高度相关可容易通过如下事实解释：该家族的所有成员，即miR-134、miR-323-3p和miR-382，属于相同的簇并在相同细胞类型中表达(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Cluster.cgi)。miR-132家族的成员即miR-128、miR-132和miR-874之间的紧密相关之前还未记载过。同样有趣的是，在不同的标准物的情况下，生物标记物家族miR-132和miR-134产生更好的结果。在标准物miR-491-5p、miR-18la、miR-9和miR-141的情况下，miR-132家族比miR-134家族更好。另一方面，在标准物miR-370和miR-127的情况下，miR-134家族比miR-132家族表现出更好的结果。miR-132和miR-134生物标记物家族之间的相关性相对低(成对比较斯皮尔曼试验中的r值在0.56-0.79范围内)，表明它们或者反映不同的病理过程或者位于不同的脑区。
实施例4：肺富集的miRNA在患有肺疾病的患者的血清/血浆中的水平增加的检测。
从诊断为患有各种肺疾病，例如哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和非小细胞肺癌(NSCLC)的患者(每组10名)获得血浆样品。由于招募的患有哮喘和肺炎的患者为非吸烟者，患有COPD和NSCLC的患者为吸烟者，所以还从两组对照，吸烟者和非吸烟者(每组10名)采集血浆样品。通过Trizol-硅胶法根据Asuragen步骤从两个200μl等份的血浆样品分离RNA。使用逆转录试剂盒和miRNA特异性茎-环引物(Applied Biosystems)进行单独的靶qRT-PCR。进行RT步骤三次，并且最终的PCR中存在2μl血浆等同物，从而测量在肺中富集的miR-34b、miR-142-5p、miR-146-5p、miR-155、miR-223、miR-486-5p的浓度，以及在胃肠系统中遍在和富集的miR-192和miR-409-3p的水平。后者基本上是遍在的，但在肺中表达不足。各肺富集的miRNA的浓度相对于miR-409-3p和miR-192以及彼此归一化，根据ABI操作手册(2-ΔCt)转化为miRNA的相对量(RQ)，并与对照比较miRNA谱。
正如预期的，发现在肺中高度富集的miR-34b和miR-486-5p为有效的生物标记物，miR-409-3p为有效的标准物(图10A-D)。其它有效的标准物为肺富集的miR-142-5p、miR-146b-5p、miR-155和miR-223(图11A-H和12A-H)，其至少在一些情况中可通过它们在肺病理中的下调来解释(Liu X.等，Clin.癌症Res.2009,15:1177-1183；Miko E.等，Exp.肺Res.2009,35:646-664；Halappanavar S.等，Toxicology2011,285:133-141；HeegaardNH等，Int.J.癌症,2012,130:1378-1386)。出乎意料的是，miR-192也表现为有效的生物标记物(图13A-J)。由于该miRNA也显示为GI系统疾病的生物标记物，有理由暗示该miRNA的表达和/或分泌由于炎症或肿瘤发展而增加(Benjamin H.等，J.Mol.Diagn.2010,12:771-779；Lan HY.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2011Dec.28[印刷前的电子版]；Luzna P.等，Diagn.Pathol.2011,6:114；Wu Q.等，J.Biomed.Biotechnol.2011,Epub May26；Zhou J.等，J.Clin.Oncol.2011,29:4781-4788)。
miRNA生物标记物miRNA/miRNA标准物比对于吸烟和非吸烟对照不同。因此，各种病理可与组合对照(吸烟和非吸烟受试者)相比。图14A-C表明通过各种miRNA生物标记物和标准物的组，例如相对于miR-409-3p归一化的miR-34b、相对于miR-223归一化的miR-486-5p或相对于miR-155归一化的miR-192，将四种分析的病理有效地与该组合对照相区分。还存在其它有效的miRNA生物标记物和标准物的组。
还分析了miRNA生物标记物和标准物的各种组合区分NSCLC与该炎性疾病如哮喘、肺炎和COPD的能力。图15A-C示出使用miR-34b与miR-155、miR-486-5p与miR-146b-5p、或miR-192与miR-146b-5p的比将患有NSCLC的患者与患有炎性疾病的患者相区分。存在其它miRNA生物标记物和标准物的有效组合。
实施例5：胃肠系统富集的miRNA在患有胃肠系统疾病的患者的血清/血浆中的水平增加的检测。
从诊断为患有GI系统各种疾病例如食管、胃和结肠癌，以及炎性病况、克罗恩氏病的患者(每组10名)获得血浆样品。通过Trizol-硅胶法根据Asuragen步骤从两个200μl等份的血浆样品分离RNA。使用逆转录试剂盒和miRNA特异性茎-环引物(AppliedBiosystems)进行单独的靶qRT-PCR。进行RT步骤三次，并且最终的PCR中存在2μl血浆等同物，从而测量在GI系统的器官中富集的miR-145、miR-148a、miR-192、miR-194、miR-203、miR-215的浓度，以及遍在miR-30e-3p的水平。各GI系统富集的miRNA的浓度相对于miR-30e-3p以及彼此归一化，根据ABI操作手册(2-ΔCt)转化为miRNA的相对量(RQ)，并与对照比较miRNA谱。图16A-L清楚地示出miR-192、miR-194、miR-203和miR-215为有效的生物标记物，miR-145、miR-148a和miR-30e-3p为有效的标准物。生物标记物/标准物比有效地将患有所有研究疾病的患者与对照区分。在食管和胃中高度富集的miR-203在检测这些器官的癌症中特别有效，在结肠中高度富集的miR-215在区分患有结肠癌和克罗恩氏病的患者与对照中最有效。相对于miR-30e-3p归一化的miR-192和miR-203的组合以如实施例8的记载所计算的94%灵敏性和100%特异性将患有GI系统所有病理的患者与对照有效地区分(图16M)。重要的是所有肿瘤为阶段1或2癌症，这意味着所提出的方法可有效地用于筛选和早期诊断。
另外，将各种癌症彼此相比较，将克罗恩氏病与所有GI系统的癌症相比较。结果已发现能够区分特定病理的下列生物标记物/标准物比：
1.克罗恩氏病vs食管、胃和结直肠癌：miR-194/miR-148a；miR-215/miR-30e-3p；miR-215/miR-194；miR-203/miR-148a；miR-192/miR-203；miR-215/miR-203和miR-194/miR-192(图17A-G)。
2.食管癌vs胃癌：miR-194/miR-145；miR194/miR-148a；miR194/miR-30e-3p(图18A-C)。
3.胃癌vs结直肠癌：miR-203/30e-3p；miR-203/miR-148a；miR-215/miR-203(图18D-F)。
4.食管癌vs结直肠癌：miR-192/miR-145；miR192/miR-148a；miR192/miR-30e-3p(图18G-I)。
因此，在GI系统的器官中富集的miRNA的血浆浓度的分析对下列有效：(i)检测克罗恩氏病和食管、胃和结肠中的肿瘤；(ii)区分炎性疾病与癌症；(iii)区分位于GI系统的各种器官的癌症。
实施例6：各种器官系统的病理的区分。
将由实施例4和5中记载的患者获得的血浆样品纯化的miRNA制剂用于本研究。研究各种miRNA组合区分患有GI系统疾病(克罗恩氏病以及食管、胃和结直肠癌)的患者与患有肺系统疾病(哮喘、肺炎、COPD和NSCLC)的患者的能力。将肺富集的miR-126、miR-146b-5p、miR-155和miR-486-5p，以及Gl富集的miR-145、miR-192、miR-203和miR-215包括在本研究中。这些miRNA中的一些(表3)的表达已知在各种器官的病理中失控。另外，分析在各种器官的病理过程中参与的miR-17-5p和mir-31，以及用作实施例4和5中的标准物的miR-30e-3p和miR-409-3p。通过Trizol-硅胶法根据Asuragen步骤从两个200μl等份的血浆样品分离RNA。使用2μl血浆等同物以终PCR为10μl的反应体积运行单独的靶 miRNA qRT-PCR试验(Applied Biosystems)三次。各miRNA的浓度相对于miR-30e-3p和miR-409-3p以及彼此归一化，根据ABI操作手册(2-ΔCt)转化为miRNA的相对量(RQ)，并比较患有肺和GI系统疾病的患者的miRNA谱特征。图19A-U表明许多miRNA对有效地区分患有肺和GI系统疾病的患者：miR-192/miR-126；miR-155/miR-126；miR-145/miR-126；miR-155/miR-30e-3p；miR-192/miR-30e-3p；miR-155/miR-409-3p；miR-486-5p/miR-17-5p；miR-155/miR-17-5p；miR-192/miR-17-5p；miR-146b-5p/miR-31；miR-155/miR-31；miR-192/miR-31；miR-486-5p/miR-155；miR-192/miR-155；miR-145/miR-155；miR-146b-5p/miR-155；486-5p/miR-203；miR-192/miR-203；miR-145/miR-203；miR-192/miR-215；miR-155/miR-215。
两种miRNA对的组合增加了试验准确性。图19V和19W提供了利用miR-145/miR-155和miR-486-5p/miR-155比的组合的实例，其以95%灵敏性、90%特异性和93%准确性区分患有GI系统所有病理的患者和患有肺疾病的患者。
实施例7：癌症与炎性疾病的区分
将实施例6中研究的相同的血浆样品用于RNA纯化并分析相同的miRNA。在该研究中，研究各种miRNA组合区分患有炎性疾病(哮喘、肺炎、COPD和克罗恩氏病)的患者和患有各种癌症(食管、胃、结直肠和非小细胞肺癌症)的患者的能力。图20A-F表明几种miRNA对有效地区分患有炎性疾病的患者和患有各种癌症的患者：miR-17-5p/miR-155；mir-192/miR-155；miR-215/miR-155；miRl92/miR-30e；miR-146b-5p/miR-30e-3p；miR155/miR-30e-3p。区别炎症疾病与癌症的miRNA对相对于能够区分肺系统疾病与GI系统疾病的miRNA对少。首先，许多miRNA的表达变化是两种病理类型的特征。其次，在许多情况中，癌变伴随相对显著的炎症。
两种miRNA对的组合增加了试验准确性。图20G和20H提供了miR-146b-5p/miR-155和miR-146b-5p/miR-30e-3p比的组合的实例，其以80%灵敏性、98%特异性和89%准确性区分所有患有炎性疾病的患者与癌症患者。
因此，上述实验的结果支持本发明的主要思想。在血浆中，在特定器官系统中或在器官中富集的miRNA浓度的分析区分：(i)器官系统疾病与对照；(ii)GI系统的三种器官的病理；(iii)肺和GI系统的疾病；(iv)癌症和炎性疾病。
实施例8：用于多重miRNA分析的方法及其用于生物标记物选择和检测具有病理变化的器官系统或特定器官的用途。
将两种不同的应用用于UST开发(研究阶段)及其临床用途(筛选数据处理)。两种应用中的算法包含训练和分类部分，但它们是明显不同的。
用于筛选试验开发的算法
在下列算法描述和相关的图中，术语″生物标记物″定义了用于病理诊断和更普遍地用于区分各受试者组的miRNA对、标记物和标准物。术语″ROC″表示受试者操作特征，用于分类的统计学资料。
所提出的算法基于下列简化的假设：
·对于任何生物标记物或生物标记物的组合，有限数量，如≤20个实验可供使用；
·任何生物标记物对特定病理的响应可独立开发并不应与分配至特定的D集合的生物标记物的″最终″组合相关联；
·算法应是概率性的，其允许较好的结果评价。
算法的第一部分涉及使用相应器官系统、器官、组织或细胞类型的病理的标记数据的训练。图21A概括了该算法在该部分的操作。
该部分呈现与进行实验的人员的特别是每一步的基础对话(intensive dialog)。第一步总是包括一些手动操作-或者输入样品值，或者执行导入(部分或完全地)来自一些标准文件的数据的操作。文献的类型可为，但不限于Excel电子表格或文本文档限定的文件。所有其它步骤可自动进行，仅手动确认如″下一步″，或者可具有一些手动更正。例如，在归一化阶段，技术人员应提供最佳类型的归一化，或者进行其几种类型的所有处理。一些样品可具有某些统计学合理范围之外的值。一般来说，该范围是多重标准偏差，例如但不限于，两次或三次标准偏差，取决于值分布(其与正常值有多近等)、可作出是否将这些样品从统计资料排除的决策等。统计学分析包括靶标-对照分离的P-水平的计算和ROC(受试者操作特征)曲线参数。算法的最后步骤-作出添加标记物的决策-可包括下述分类算法的一部分(内环)。在该步骤中，计算的参数应用于训练集(training set)。使用该标记的决策基于分类成功的水平。该决策可在分类阶段再访问。
算法的分类部分示于图21B。
算法的第二部分，分类，主要用于验证数据处理。另外，其中的部分(内环)可用于训练算法的最后步骤。通常，在研究阶段，这些部分(训练步骤和分类步骤)以迭代方式使用，即，重复多次，从而达到临床可接受的试验准确性。
分类步骤包含两个巢式迭代环，穿过D集合(外环)和每个D集合中的生物标记物(内环)。
通过内部生物标记物环的迭代步骤包括：
步骤1.D集合生物标记物的归一化
归一化可包括基于掺标的miRNA的一种通用筛选试验归一化(每个试验一个)，和对特定的D集合类型b)、c)或d)特异的归一化(参见上述发明部分的详细描述)，或它们中的不止一种。将用于各生物标记物的具体归一化的版本包括在K库中作为D集合的说明中。因此，如果一种生物标记物为超过一个D集合的成员，则应在每个集合中相应地归一化。
步骤2.生物标记物可能性计算
对于特定人的生物标记物浓度必须绘制为两种可能性：患有病理或不患有病理。绘制操作使用两种概率函数，基于处理两个群体的生物标记物数据：患有病理和不患有病理(对照)。各概率函数为线性近似曲线，对照群体从1至0，患有靶标病理的群体从0至1。在K库中保存、检索并更新每个曲线的说明。
步骤3.使用历史(时空点)
靶标和对照曲线的相当部分重叠。如果实际值在该重叠区域内，则必须决策如何解释结果。这是基于，但不限于，患有病理和无病理的概率的比较；如果此类数据已在I库中提取并保存，则分析同一人现存的生物标记物数据。
这是生物标记物迭代的结束。
D集合环的迭代步骤(外部D步骤)
步骤1.靶标概率计算。
在大多数情况下，包括在特定D集合中的生物标记物在统计上是独立的，即属于对照或靶标组的特定浓度值的概率不显著依赖于D集合中其它生物标记物的值。在该情况中，已计算了包括该D集合的生物标记物的概率的加权总和。默认情况下(By default)，所有加权相等，例如三种生物标记物各自的加权为1/3。然而，对于在该D集合中的每个生物标记物，每个加权可保存在K库中。它们可基于一些生物标记物ROC参数，如灵敏性、特异性或AUC(曲线下的面积)。任何D集合中的所有生物标记物的加权总和应为1。
在特定的D集合中一些生物标记物的显著相关性(interdependency)的情况中，K库包含该组的多维概率面的描述，其中维度等于组中相关生物标记物的数量。使用该描述，将各生物标记物值的组合绘制成两种概率。如果D集合还包含独立的生物标记物，则使用相关生物标记物和单独的独立生物标记物的组的概率的加权总和计算D集合的概率。
D步骤2.决策。
一般说来，结果应以对靶标病理为POSITIVE或NEGATIVE示出。在特殊情况下，还可使用附有百分比的结果UNDETERMINED。决策参数必须预先设定并保存在K库。它们可为全筛选的(Screening-wide)，或靶标(器官系统/器官/组织)特异性和适用于在前面步骤(D-步骤1)中计算的概率。这些参数可用于两种概率中的每一种(PP–病理概率，PC–对照概率)，或者更常见的用于两种概率的差。实例：(i)差参数(difference parameter)为0，即PP>PC使者POSITIVE，PP<PC是指NEGATIVE；(ii)PP-PC≤0.25为NEGATIVE，PP–PC≥0.35在POSITIVE，和UNDETERMINED在两者之间；(iii)PP>0.6为POSITIVE，PC>0.7为NEGATIVE，其它的为UNDETERMINED。
D步骤3.登记
结果与识别数据如试验#、日期/时间标识、患者身份等一起显示并保存至I库。
用于临床试验的算法和用途
当研究阶段完成时，K库包含UST的所有组分及其版本：生物标记物、D集合和分类常数。在下一阶段，使用这些工具进行较大的临床研究。
基于所得结果，进行生物标记物和D集合的验证和评价以及算法或/和常数的一些修改。例如，可使用不同的分类算法，如多项逻辑斯蒂回归(Multinomial LogisticRegression)(Hosmer DW,Lemeshow S.Applied logistic regression.Wiley,2000；Allison PD.Logistic regression using the SAS system:theory andapplication.Wiley,2008)或支持向量机(Support Vector Machines)(Cristianini N,Shawe-Taylor J.An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-based Learning Methods.Cambridge Press,2000；Abe S.SupportVector Machines forPattern Classification.Springer,2010)。K库相应地得到一些更改。此类更改后，将进行临床试验。
在临床用途中，分类算法使用来自K库的常数和参数，实际试验数据保存至I库。K库保持不变直至下一修改，即获得新的研究验证数据。
通常，该说明书中记载的算法、函数运算或主题的任一种可在数字电子电路图中或在包括在该说明书中公开的结构及其结构等同物，或者组合它们的一种或多种的计算机软件、固件或硬件中实施。例如，在一些实施方案中，一种或多种数据处理设备可为可在计算机中安装并配置以进行选择和/或检测病理的生物标记物的算法以及进行一种或多种病理分类的算法的模块的一部分。在一些实施方案中，一种或多种数据处理设备可为安装于计算机并配置以进行实施例8中所述的包括巢式迭代环(如生物标记物环和D集合环)的分类算法的模块的一部分。例如，一种或多种数据处理设备可配置为进行图21A和21B中所示的一种或多种运算。在一些实施方案中，算法可作为一种或多种计算机程序产品，即，通过数据处理设备或为了控制数据处理设备的操作，在用于执行的计算机可读介质上编码的计算机程序指令和一种或多种模块来执行。
计算机可读介质可为机器可读的存储设备，机器可读的储存基质、记忆装置或它们的一种或多种的组合。术语″数据处理设备″包括用于处理数据的所有设备、装置和机器，包括例如可编程处理器、计算机或多处理器或计算机。设备可包括，除硬件外，创建所述计算机程序的执行环境的代码，例如，构成处理器固件的代码、协议包、数据库管理系统、操作系统、运行环境或它们一种或多种的组合。设备包括创建、验证和/或修改K库或I库表格的代码。在一些实施方案中，K库和I库可在数据库管理系统如SQL服务器、Oracle、MySQL等上维护。
计算机程序(还称作程序、软件、软件应用、脚本或代码)可以以包括编译或解释语言的程序语言的任何形式写入，并且其可以以适用于计算机环境的单元而存在的任何常用调用形式来调用。计算机程序不必对应于文件系统中的文件。程序可保存在支持其它程序或数据的文件的一部分中(例如，保存在标记语言文件中的一种或多种脚本)，在专用于所述程序的单个文件中，或者在多个协同文件(如，保存一种或多种模块、副程序或代码的部分的文件)中。可调用计算机程序以在一台计算机上或多台计算机上执行，所述多台计算机位于一个位点或分布在多个位点并由通信网络连通。
在本说明书中记载的过程可由执行一个或多个计算机程序的一个或多个可编程的处理器进行，从通过操作输入数据并产生输出数据来执行功能。适用于执行计算机程序的处理器包括，例如一般和特殊用途的微处理器两种，以及任一种数字计算机的任何一种或多种处理器。
在一些实施方案中，使用者通过一个或多个装置手动进入从研究阶段或临床阶段中的筛选试验获得的数据。在一些实施方案中，使用者可从一个或多个装置观察或接收输出数据，该输出数据例如但不限于，生物标记物分类数据和与检测生物标记物浓度变化相关的数据。其它类装置也可用于提供与使用者的相互作用；例如，提供至使用者的反馈可为任何形式的传感反馈，例如，视觉反馈或听觉反馈；来自使用者的输入可以以包括听觉、语言或触觉输入的任何形式接收。
本说明书中记载的主题的实施方案可在包括后端组件如数据服务器，或包括中间设备组件如应用服务器，或包括前端组件如具有图形用户界面或网页浏览器，使用者可借此与本说明书中记载的主题的实现交互的客户端计算机，或者此类后端、中间或前段组件的一种或多种的任意组合的计算机系统中执行。例如，在一些实施方案中，该系统可包括允许使用者进入和/或检查K库和I库中的数据的图形用户界面/浏览器界面。可选地，或者另外，界面可允许使用者控制、修改或操作算法的执行。在一些实施方案中，系统可从连接至互联网的其它系统和/或组件检索或输出数据。
***
本发明不限于在此记载的具体实施方案的范围。的确，本发明的各种修改，除了这里所述的那些以外，从前述记载对于本领域技术人员将变得显而易见。这种修改意于落入所述权利要求的范围内。
本文所引用的所有专利、申请、公布、试验方法、文献和其它材料在此以其全部内容引入以作参考，如同实际存在于本说明书中。

Claims (15)

1.一种引物和/或探针组在制备用于以下方法的试剂盒中的用途，所述方法为用于检测受试者中的器官系统的病理的方法，
所述引物和/或探针组包括对检测在所述器官系统中富集的至少一种生物标记物miRNA特异的引物和/或探针、和对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针，其中所述方法包括：
a.对于包含胃肠系统、呼吸系统和神经系统的各多种不同器官系统，测量在所述器官系统中富集的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的所述miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比高于所述相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有所述器官系统的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比不高于所述相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述器官系统的病理，且
其中，
(1)用于神经系统的生物标记物miRNA/标准物miRNA对选自由miR-128/miR-9、miR-128/miR-181a、miR-128/miR-491-5p、miR-128/miR-141、miR-132/miR-9、miR-132/miR-181a、miR-132/miR-491-5p、miR-132/miR-141、miR-874/miR-9、miR-874/miR-181a、miR-874/miR-491-5p、miR-874/miR-141、miR-134/miR-127、miR-134/miR-370、miR-323-3p/miR-127、miR-323-3p/miR-370、miR-382/miR-127、和miR-382/miR-370组成的组，
(2)用于呼吸系统的所述生物标记物miRNA/标准物miRNA对选自由miR-34b/miR-142-5p、miR-34b/miR-146b-5p、miR-34b/miR-155、miR-34b/miR-223、miR-34b/miR-409-3p、miR-486-5p/miR-142-5p、miR-486-5p/miR-146b-5p、miR-486-5p/miR-155、miR-486-5p/miR-223、miR-486-5p/miR-409-3p、miR-192/miR-142-5p、miR-192/miR-146b-5p、miR-192/miR-155、miR-192/miR-223、和miR-192/miR-409-3p组成的组，和
(3)用于胃肠系统的所述生物标记物miRNA/标准物miRNA对选自由miR-192/miR-30e-3p、miR-192/miR-145、miR-192/miR-148a、miR-194/miR-30e-3p、miR-194/miR-145、miR-194/miR-148a、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR-145、miR-203/miR-148a、miR-215/miR-30e-3p、miR-215/miR-145、和miR-215/miR-148a组成的组。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述miRNA的水平的对照比为预定标准。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述预定标准使用各自的器官系统未患有病理的对照受试者群体来测定。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述对照受试者与诊断受试者年龄相称。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述miRNA的水平的对照比为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同miRNA的水平比。
6.一种引物和/或探针组在制备用于以下方法的试剂盒中的用途，所述方法为用于检测受试者中器官的病理的方法，
所述引物和/或探针组包括对检测在所述器官中富集的至少一种生物标记物miRNA特异的引物和/或探针、和对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针，其中所述方法包括：
a.对于各至少两种不同的器官，测量在所述器官中富集的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量标准物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.计算步骤(a)和(b)中测量的所述miRNA的水平比；
d.比较步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比与相应的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比高于所述相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有所述器官的病理，或(ii)当在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比不高于所述相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述器官的病理，且
其中，所述至少两种器官之一为胃肠器官，和生物标记物miRNA/标准物miRNA对选自由miR-194/miR-145、miR-194/miR148a、miR-194/miR-30e-3p、miR-215/miR-203、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR148a、miR-192/miR-145、miR-192/miR148a、和miR-192/miR-30e-3p组成的组。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述miRNA的水平的对照比为预定标准。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述预定标准使用各自的器官未患有病理的对照受试者群体来测定。
9.根据权利要求8所述的用途，其中对照受试者与诊断受试者年龄相称。
10.根据权利要求6所述的用途，其中所述miRNA的水平的对照比为事先从相同受试者采集的同样处理的体液样品中相同miRNA的水平比。
11.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括鉴定所述病理是否为癌症或炎症，所述方法包括：
a.测量与癌症相关的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量与炎症相关的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.测量在所涉及的器官系统中富集的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
d.测量至少一种标准物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
e.计算在步骤(a)、(b)、(c)、和(d)中测量的所述miRNA的成对水平比；
f.比较步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比与癌症和炎症特有的相应预定比，和
g.(i)当在步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比在癌症特有的预定范围内时，将所述病理鉴定为癌症，或(ii)当在步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比在炎症特有的预定范围内时，将所述病理鉴定为炎症，且
其中，
(1)所述病理涉及呼吸系统，和所述miRNA比选自由miR-34b/miR-155、miR-486b-5p/miR-146b-5p、和miR-192/miR-146b-5p组成的组；
(2)所述病理涉及胃肠系统，和所述miRNA比选自由miR-215/miR-30e-3p、miR-215/miR-194、miR-215/miR-203、miR-203/miR-148a、miR-194/miR-148a、miR-194/miR192、和miR-192/miR-203组成的组；或
(3)所述病理涉及呼吸系统或胃肠系统，和所述miRNA比选自由miR-17-5p/miR-155、miR-192/miR-155、miR-215/miR-155、miR-192/miR-30e-3p、miR-155/miR-30e-3p、和miR-146b-5p/miR-30e-3p组成的组。
12.根据权利要求6所述的用途，其进一步包括鉴定所述病理是否为癌症或炎症，所述方法包括：
a.测量与癌症相关的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的体液样品中的水平；
b.测量与炎症相关的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
c.测量在所涉及的器官中富集的至少一种生物标记物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
d.测量至少一种标准物miRNA在从所述受试者采集的相同体液样品中的水平；
e.计算在步骤(a)、(b)、(c)和(d)中测量的所述miRNA的成对水平比；
f.比较步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比与癌症和炎症特有的相应预定比，和
g.(i)当在步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比在癌症特有的预定范围内时，将所述病理鉴定为癌症，或(ii)当在步骤(e)中计算的所述miRNA的水平比在炎症特有的预定范围内时，将所述病理鉴定为炎症，且
其中，
(1)所述病理涉及肺，和所述miRNA比选自由miR-34b/miR-155、miR-486b-5p/miR-146b-5p、和miR-192/miR-146b-5p组成的组；
(2)所述病理涉及胃肠系统的器官，和所述miRNA比选自由miR-215/miR-30e-3p、miR-215/miR-194、miR-215/miR-203、miR-203/miR-148a、miR-194/miR-148a、miR-194/miR192、和miR-192/miR-203组成的组；或
(3)所述病理涉及呼吸系统或胃肠系统的器官，和所述miRNA比选自由miR-17-5p/miR-155、miR-192/miR-155、miR-215/miR-155、miR-192/miR-30e-3p、miR-155/miR-30e-3p、和miR-146b-5p/miR-30e-3p组成的组。
13.一种试剂盒，其包括对检测选自由以下的至少一种生物标记物miRNA/标准物miRNA对特异的引物或探针：
(1)miR-128/miR-9、miR-128/miR-181a、miR-128/miR-491-5p、miR-128/miR-141、miR-132/miR-9、miR-132/miR-181a、miR-132/miR-491-5p、miR-132/miR-141、miR-874/miR-9、miR-874/miR-181a、miR-874/miR-491-5p、miR-874/miR-141、miR-134/miR-127、miR-134/miR-370、miR-323-3p/miR-127、miR-323-3p/miR-370、miR-382/miR-127、miR-382/miR-370；
(2)miR-34b/miR-142-5p、miR-34b/miR-146b-5p、miR-34b/miR-155、miR-34b/miR-223、miR-34b/miR-409-3p、miR-486-5p/miR-142-5p、miR-486-5p/miR-146b-5p、miR-486-5p/miR-155、miR-486-5p/miR-223、miR-486-5p/miR-409-3p、miR-192/miR-142-5p、miR-192/miR-146b-5p、miR-192/miR-155、miR-192/miR-223、miR-192/miR-409-3p；
(3)miR-192/miR-30e-3p、miR-192/miR-145、miR-192/miR-148a、miR-194/miR-30e-3p、miR-194/miR-145、miR-194/miR-148a、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR-145、miR-203/miR-148a、miR-215/miR-30e-3p、miR-215/miR-145、miR-215/miR-148a；
(4)miR-486b-5p/miR-146b-5p；
(5)miR-215/miR-194、miR-215/miR-203、miR-194/miR-192、miR-192/miR-203；
(6)miR-17-5p/miR-155、miR-215/miR-155、miR-155/miR-30e-3p、miR-146b-5p/miR-30e-3p；
(7)miR-192/miR-126、miR-155/miR-126、miR-145/miR-126、miR-155/miR-409-3p、miR-486-5p/miR-17-5p、miR-155/miR-17-5p、miR-192/miR-17-5p、miR-146b-5p/miR-31、miR-155/miR-31、miR-192/miR-31、miR-145/miR-155、miR-146b-5p/miR-155、miR-486-5p/miR-203、miR-145/miR-203、miR-192/miR-215、miR-155/miR-215。
14.根据权利要求13的试剂盒，其包括对检测选自由以下的至少一种生物标记物miRNA/标准物miRNA对特异的引物或探针：
(1)miR-194/miR-145、miR-194/miR148a、miR-194/miR-30e-3p、miR-215/miR-203、miR-203/miR-30e-3p、miR-203/miR148a、miR-192/miR-145、miR-192/miR148a、miR-192/miR-30e-3p；
(2)miR-34b/miR-155、miR-486b-5p/miR-146b-5p、miR-192/miR-146b-5p；
(3)miR-215/miR-30e-3p、miR-215/miR-194、miR-194/miR-192、miR-192/miR-203；
(4)miR-17-5p/miR-155、miR-192/miR-155、miR-215/miR-155、miR-155/miR-30e-3p、miR-146b-5p/miR-30e-3p。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其进一步包括miRNA分离或纯化手段。
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