ES2630602T3 - Prueba de detección universal (PDU) basada en miRNA - Google Patents

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ES2630602T3 ES12774179.1T ES12774179T ES2630602T3 ES 2630602 T3 ES2630602 T3 ES 2630602T3 ES 12774179 T ES12774179 T ES 12774179T ES 2630602 T3 ES2630602 T3 ES 2630602T3
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Abstract

Un método de detección en un sujeto para determinar si cualquiera o todos los siguientes sistemas de órganos: el aparato digestivo (GI), el aparato respiratorio y el sistema nervioso central, tienen una enfermedad, en donde dicho método comprende: a. medir la concentración de los miRNA que son abundantes en el aparato digestivo (GI), de los miRNA que son abundantes en el aparato respiratorio y de los miRNA que son abundantes en el sistema nervioso central, en una muestra de líquido corporal recogida del sujeto; b. medir la concentración de los miRNA normalizadores en la misma muestra de líquido corporal recogida del sujeto; c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b); d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y e. (i) identificar que el sujeto está afectado por una enfermedad de un sistema de órganos determinado cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de órganos por sus correspondientes miRNA normalizadores, calculadas en la etapa (c), son más altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no está afectado por una enfermedad de dicho sistema de órganos cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de órganos por sus correspondientes miRNA normalizadores, calculadas en la etapa (c), no son más altas que las correspondientes razones de control, en donde los miRNA abundantes en el aparato digestivo medidos en la etapa (a) comprenden miR-215, miR-203, miR-192 o miR-194, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-30e-3p, miR-145 o miR-148a; los miRNA abundantes en el aparato respiratorio medidos en la etapa (a) comprenden miR-486-5p, miR-34b o miR- 192, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR- 409-3p; y los miRNA abundantes en el sistema nervioso central medidos en la etapa (a) comprenden miR-128, miR-132 o miR-874 y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141, o los miRNA abundantes en el sistema nervioso central medidos en la etapa (a) comprenden miR-134, miR-323-3p o miR- 382, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden mir-127 o miR-370.

Description

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DESCRIPCION
Prueba de deteccion universal (PDU) basada en miRNA Campo tecnico de la invencion
La presente invencion describe metodos para la deteccion no invasiva o mmimamente invasiva de cambios patologicos en sistemas de organos, determinados organos, tejidos y/o celulas con la cuantificacion, en los Ifquidos corporales, de miRNA abundantes en un sistema de organos, organo, tejido, o tipo de celula.
Antecedentes de la invencion
Esta bien aceptado que el tratamiento de cualquier enfermedad es mas facil y mas eficaz si la enfermedad subyacente se diagnostica lo antes posible. Para algunas enfermedades, el diagnostico precoz (preferiblemente antes de que aparezcan los smtomas clmicos claros) es cnticamente importante debido a la transicion de la enfermedad hacia un estadio mas avanzado, a veces irreversible. Por ejemplo, uno de los principales problemas para el desarrollo de farmacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de otras enfermedades neurodegenerativas es que su manifestacion y su diagnostico clmico son tardms debido a los altos potenciales compensatorios del cerebro. Como resultado, estas enfermedades normalmente se diagnostican cuando muchas neuronas ya estan muertas y, en la actualidad, la mejor situacion del caso es que se impida el empeoramiento de la enfermedad, pero no una verdadera recuperacion. El cancer es otro ejemplo, ya que el tratamiento de la etapa metastasica de la enfermedad es mucho mas problematica que el tratamiento del tumor primario. Hay muchas otras enfermedades de esta clase, pero, de nuevo, el tratamiento de cualquier enfermedad es mas eficaz si se realiza un diagnostico precoz.
Hay varios tipos basicos de pruebas clmicas: (i) las pruebas geneticas que ayudan a predecir la predisposicion a una enfermedad concreta; (ii) las pruebas de deteccion, que se aplican a una gran poblacion para la deteccion precoz de una enfermedad, preferiblemente antes de su manifestacion clmica; (iii) las pruebas diagnosticas, que se aplican cuando una persona tiene smtomas clmicos de una enfermedad o cuando se ha detectado la enfermedad mediante una prueba de deteccion; (iv) las pruebas moleculares predictivas que debenan predecir el desenlace de la enfermedad y la sensibilidad al farmaco.
Las pruebas de deteccion son lo mas importante para la deteccion precoz de una enfermedad. Esto es verdad no solo para las enfermedades espontaneas, sino tambien para las enfermedades de origen genetico, para las cuales se puede predecir una alta probabilidad de contraer una enfermedad mediante las pruebas geneticas. Idealmente, todo el mundo se debena someter a un cribado regular para todas las enfermedades potencialmente mortales y muchas otras. Se ha intentado muchas veces desarrollar pruebas para la deteccion precoz de diferentes enfermedades y en la actualidad se realizan diversas pruebas de deteccion para grupos de riesgo espedficos. Por ejemplo, se recomienda una colonoscopia periodica para las personas mayores de 50 anos, se recomiendan citologfas vaginales a las mujeres y pruebas del PSA a los hombres para la deteccion precoz del cancer de cuello uterino y del cancer de prostata, respectivamente. Una ventaja importante de estas pruebas es su especificidad de la enfermedad, pero al mismo tiempo es su desventaja mas grave, porque cada prueba se dirige solo a una enfermedad concreta. Sin embargo, hay cientos de enfermedades humanas y es diffcil imaginar que tales pruebas de deteccion espedficas se desarrollen para todas estas enfermedades. Ademas, incluso aunque se hayan desarrollado pruebas espedficas para la deteccion precoz de todas las enfermedades humanas, es muy poco probable que tales pruebas se utilizasen con propositos de deteccion sistematica, en especial para las enfermedades relativamente raras debido a factores economicos. Ya que las pruebas de deteccion para cada enfermedad concreta se dirigen a grandes poblaciones, su especificidad y valor predictivo positivo (VPP) son muy importantes. Por ejemplo, si una prueba de deteccion para una enfermedad relativamente frecuente (1:10.000) es sensible al 100% y espedfica al 99%, lo que es casi imposible de conseguir, y se criban 1 millon de personas, se detectanan correctamente 100 casos, pero aproximadamente 10.000 personas recibinan resultados positivos falsos. Obviamente, tal resultado causana un desasosiego emocional en estas personas y tendna una repercusion economica importante debido a las pruebas posteriores.
Compendio de la invencion
Tal y como se especifica en el apartado Antecedentes, mas arriba, hay una gran necesidad en la tecnica de nuevas pruebas de deteccion. De acuerdo con el paradigma actual para el desarrollo de pruebas de deteccion y su aplicacion clmica, una de las principales caractensticas de tal prueba debe ser su gran especificidad de la enfermedad. Sin embargo, tal y como se menciono mas arriba, hay cientos de enfermedades y la deteccion sistematica de cada enfermedad concreta es virtualmente imposible. La presente invencion propone un cambio de paradigma significativo: el desarrollo y la implantacion de uno o un pequeno numero de pruebas de deteccion universal (las PDU), que espedficamente detectanan una enfermedad de cualquier sistema de organos, organo, tejido y/o tipo de celula, sin que se diagnostique una enfermedad concreta. Tales PDU se debenan realizar periodicamente en cualquier sujeto dado en un estadio temprano, preferiblemente sin smtomas clmicos, y a continuacion se podran utilizar pruebas mas espedficas para un diagnostico mas espedfico. Las PDU, tal y como se describen en la presente memoria, mejoranan el diagnostico y el tratamiento de enfermedades, y reducinan
significativamente los costes medicos. De igual forma, las PDU, tal y como se describen en la presente memoria, hanan que pruebas para las enfermedades raras fueran mas dirigidas, ya que se aplicanan a poblaciones mucho mas pequenas seleccionadas previamente por la PDU y, por lo tanto, seran mas practicas desde el punto de vista economico.
5 Ya que las PDU se dirigiran a una poblacion grande (preferiblemente a todos), su primer rasgo importante es que la invasividad sea la minima. La presente invencion propone tomar nota de los diferentes procesos fisiologicos y patologicos en determinados organos, tejidos e incluso tipos de celulas mediante el analisis de los biomarcadores correspondientes en los lfquidos corporales que se pueden obtener mediante metodos no invasivos o mmimamente invasivos, tales como, p. ej., plasma/suero, orina o saliva. Segundo, las PDU no se pueden basar en el factor de 10 induccion ni en la patogenia de las enfermedades, ya que existen muchos. Tercero, para utilizarlas ampliamente, las PDU no deben ser muy caras, lo que, en particular, significa que se tiene que utilizar un numero pequeno de tipos de biomarcadores que puedan ser analizados con la misma tecnica.
Los biomarcadores utilizados para las PDU deben contar con un conjunto de parametros que los hacen idoneos para tal tipo de prueba.
15 1. Especificidad o abundancia significativa en alguna celula/tejido/organo (p. ej., una concentracion al menos 5
veces mayor que en otras celulas/tejidos/organos).
2. Capacidad para ser secretado al espacio extracelular y atravesar diferentes barreras dentro del organismo.
3. Presencia en cantidades detectables en los lfquidos corporales que se puede obtener con una invasividad minima.
20 4. Estabilidad
5. Que se puedan detectar con altas sensibilidad y especificidad a un coste relativamente bajo.
En las PDU se podnan utilizar las siguientes clases de moleculas:
1. Protemas
2. ARNm y fragmentos de ARNm
25 3. miRNA
4. Fragmentos de ADN
5. Metilacion del ADN
6. Lfpidos
7. Azucares
30 Sin embargo, algunos de estos posibles biomarcadores espedficos de tejido tienen importantes desventajas, que hace su uso poco practico o incluso imposible. Por ejemplo, la metilacion del ADN, los lfpidos y los azucares no son suficientemente espedficos para diferenciar entre diferentes tipos de tejidos y celulas. Ademas, los fragmentos de ADN aparecen en el espacio extracelular y en el torrente circulatorio proceden principalmente de las celulas que mueren (Lichtenstein et al., Ann. New York. Acad. Sci. 2001, 945: 239-249) y, asf pues, el ADN acelular en 35 circulacion no se puede utilizar para detectar el estadio de las enfermedades que no vayan acompanadas de la muerte celular. Las protemas y el ARNm son mejores candidatos para la PDU debido a su mayor especificidad o abundancia de tejido (Diez-Roux et al., PLOS Biology, 2011, 9: e1000582). No obstante, los ARNm son moleculas grandes que se degradan con facilidad por la accion de las nucleasas, por lo que solo aparecen en el torrente circulatorio fragmentos pequenos de estas moleculas. Esto no descarta su uso como biomarcadores para la PDU, 40 pero hace mas diffcil el desarrollo de las pruebas. Las protemas son buenos candidatos, pero los metodos actuales para su deteccion son significativamente menos sensibles que las tecnicas de deteccion de acidos nucleicos. De igual forma, muchas protemas son moleculas grandes y no consiguen atravesar la membrana celular ni otras barreras.
La presente invencion propone utilizar los miRNA biomarcadores en las PDU por las siguientes razones: los miRNA 45 son moleculas pequenas, aparecen en el espacio extracelular, atraviesan las barreras del cerebro, del rinon y de la placenta, aparecen en muchos lfquidos corporales, son estables, y los metodos actuales para su analisis son muy espedficos y sensibles. Lo mas importante es que los miRNA constituyen una clase enorme de moleculas diferentes, en la que al menos parte de los miRNA son muy abundantes en algunos sistemas de organos, organos, tejidos y/o celulas, lo que proporciona marcadores moleculares para todas las partes del cuerpo.
50 Los micro-ARN (miRNA) son una clase de ARN no codificantes cuyo producto final (miRNA maduro) es una
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molecula de ARN funcional de aproximadamente 22 nt. Desempena funciones importantes en la regulacion de los genes destinatarios al fijarse a regiones complementarias de los transcritos mensajeros para reprimir su traduccion o regular su degradacion (Griffiths-Jones Nucleic Acids Research, 2006, 34, numero de bases de datos: D140-D144). Con frecuencia, un miRNA puede actuar selectivamente sobre varios ARNm, y un ARNm puede ser regulado por varios miRNA que reconocen selectivamente diferentes regiones de la UTR en 3'. Una vez unido a un ARNm, el miRNA modula la expresion genica y la produccion de la protema al afectar a la traduccion y a la estabilidad del ARNm (p. ej., Baek et al., Nature. 2008, 455: 64; Selbach et al,. Nature. 2008, 455: 58; Ambros, Nature. 2004, 431: 350-355; Bartel, Cell. 2004, 116: 281-297; Cullen, Virus Research. 2004, 102: 3-9; He et al. Nat. Rev. Genet. 2004, 5: 522-531; y Ying et al., Gene. 2004, 342: 25-28). Hay otras clases de ARN pequenos menos caracterizados (revisado en Kim, Mol. Cells. 2005, 19: 1-15). Muchos de los miRNA son espedficos de determinados organos/tejidos/celulas o se sobreexpresan en ellos (vease, p. ej., Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129; 1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14: 35-42). Debido a su pequeno tamano, los miRNA consiguen atravesar la barrera hematoencefalica, del rinon y de la placenta en los lfquidos corporales en los que son suficientemente estables (Rosenfeld et al., Nature Biotech. 2008, 26: 462-469; Mitchell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105: 10513-10518; Chen et al., Cell Res. 2008, 18: 997-1006; Chim et al. Clin. Chem. 2008, 54: 482-490; De Smaele et al., Brain Res. 2010, 1338: 100-111; Fichstlscherer et al., Circ. Res. 2010, 107: 677-684; Scholer et al., Exp. Hematol. 2010, 38: 1126-1130). El analisis de los miRNA espedficos de celula o tejido en los lfquidos corporales se propuso para la deteccion de la muerte celular in vivo (publicacion de patente de los EE. UU. n.° 20090081640: Laterza et al., Clin Chem. 2009, 55: 1977-1983). En varios estudios se ha demostrado que en el torrente circulatorio se incrementa la concentracion de miRNA acelulares en circulacion que abundan en el hngado (Zhang et al., Clin. Chem. 2010, 56: 1830-1838; Xu et al., Mol. Carcinogenesis. 2011, 50: 136-142). Por ejemplo, la cantidad de miRNA-122a, que es abundante en el tngado, esta incrementada en el suero de los pacientes con hepatitis y carcinomas hepatocelulares, y los autores llegan a la conclusion que debido a esta inespecificidad para una enfermedad concreta, estos miRNA no se pueden utilizar como biomarcadores para el carcinoma hepatocelular (Zhang et al., Clin. Chem. 2010, 56: 1830-1838; Li et al. Cancer Res. 2010, 70: 9798-9807). En cambio, la presente invencion demuestra que tal inespecificidad de enfermedad de los miRNA que abundan en un organo/tejido/celula es una ventaja significativa cuando se utilizan como biomarcadores para el desarrollo de PDU.
La expresion y la concentracion de los miRNA estan reguladas mediante diferentes senales patologicas y fisiologicas. Algunos de los miRNA son caractensticos de una enfermedad concreta, tal como la hipoxia (Loscalzo, J. Clin. Invest.
2010, 120: 3815-3817; Pocock, Pflugers Arch. 2011, 461: 307-315), inflamacion (Tili et al., Int. Rev. Immunol. 2009, 28: 264-284; Davidson-Moncada et al., Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1183: 183-194; Roy y Sen, Physiol. Genomics.
2011, 43: 557-565) o carcinogenia (Budhu et al., J. Hematol. Oncol. 2010, 3: 37; Zen y Zhang, Med. Res. Rev. 2012, 32: 326-348). Este fenomeno hace razonable la inclusion de tales miRNA como biomarcadores en las PDU de la invencion. Un incremento de la concentracion de estos miRNA en los lfquidos corporales indicara la presencia de la correspondiente enfermedad general en el organismo, sin localizarla en un organo, tejido o tipo de celula concretos. En terminos generales, sena la misma estrategia que la propuesta mas arriba para los miRNA abundantes en un organo/tejido: el miRNA abundante en un organo/tejido ayudara a detectar una enfermedad en un organo o tejido concretos; por otra parte, un miRNA caractenstico de una enfermedad general concreta ayudara a detectar la presencia de esta enfermedad en algun lugar del organismo, sin indicar una implicacion de organos o tejidos concretos. Un uso combinado de los miRNA biomarcadores que abundan en un sistema de organos, organo, tejido y/o tipo de celula, y miRNA biomarcadores que son caractensticos de una enfermedad general concreta proporcionaran un diagnostico mas preciso, es decir, la presencia de una enfermedad concreta en un organo o tejido o tipo de celula concretos. Por ejemplo, el incremento de la concentracion del miRNA caractenstico de la hipoxia en el plasma, combinado con el incremento de la concentracion del miRNA abundante en el corazon, ofrecera un diagnostico mas espedfico de la isquemia de corazon obtenido por la PDU.
Asf pues, en un aspecto, la presente invencion da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en un sistema de organos de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de los miRNA abundantes en diversos sistemas de organos en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de los miRNA normalizadores seleccionados previamente en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidos en las etapas (a) y (b);
d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un sistema de organos concreto cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) son mas altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho sistema de organos cuando las razones de
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las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) no son mas altas que las correspondientes razones de control.
La invencion tambien da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en un sistema de organos de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho sistema de organos en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con la correspondiente razon de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de dicho sistema de organos cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) es mas alta que la correspondiente razon de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho sistema de organos cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) no es mas alta que la correspondiente razon de control.
El miRNA normalizador util en los dos metodos anteriores puede ser, por ejemplo, miRNA ubicuo, miRNA expresado en muchos organos, pero subexpresado en dicho sistema de organos, o miRNA seleccionado experimentalmente por ser abundante en dicho sistema de organos.
La razon de control de las concentraciones de los miRNA utilizados en los dos metodos anteriores puede ser un estandar predeterminado (p. ej., determinado con una poblacion de sujetos de control [p. ej., emparejados por edad con el sujeto diagnosticado] sin enfermedades en el correspondiente sistema de organos) o la razon de las concentraciones de los mismos miRNA en una muestra de lfquido corporal procesada del mismo modo, procedente del mismo sujeto y que habfa sido recogida con anterioridad.
En una realizacion, los metodos anteriores implican la determinacion de dos o mas razones de miRNA.
En una realizacion de los metodos anteriores, los miRNA abundantes en un sistema de organos se seleccionan de los miRNA recogidos en la tabla 2, que aparecera mas adelante.
En otra realizacion de los metodos anteriores, el sistema de organos es el sistema nervioso central y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 4, que aparecera mas adelante.
Aun en otra realizacion de los metodos anteriores, el sistema de organos es el aparto respiratorio y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 5, que aparecera mas adelante.
En otra realizacion mas de los metodos anteriores, el sistema de organos es el aparato digestivo (GI por sus iniciales en ingles “Gastrointestinal”) y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 7, que aparecera mas adelante.
En otro aspecto, la invencion da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en cualquier organo de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de los miRNA abundantes en diferentes organos en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de los miRNA normalizadores seleccionados previamente en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un organo concreto cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho organo por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) son mas altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho organo cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho organo por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) no son mas altas que las correspondientes razones de control.
La invencion tambien da a conocer un metodo para detectar una enfermedad de un organo en un sujeto, en donde
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dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho organo en una muestra de Kquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) con la correspondiente razon de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de dicho organo cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) es mas alta que la correspondiente razon de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho organo cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculados en la etapa (c) no es mas alta que la correspondiente razon de control.
El miRNA normalizador de utilidad en los dos metodos anteriores puede ser, por ejemplo, miRNA ubicuo, miRNA expresado en muchos organos, pero subexpresado en dicho organo, o miRNA seleccionado experimentalmente por ser abundante en dicho organo.
La razon de control de las concentraciones de los miRNA utilizados en los dos metodos anteriores puede ser un estandar predeterminado (p. ej., determinado con una poblacion de sujetos de control [p. ej., emparejados por edad con el sujeto diagnosticado] sin enfermedades en el correspondiente organo), o la razon de las concentraciones de los mismos miRNA en una muestra de lfquido corporal procesada del mismo modo, procedente del mismo sujeto y que habfa sido recogida con anterioridad.
En una realizacion, los dos metodos anteriores implican la determinacion de dos o mas razones de miRNA.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, los miRNA abundantes en un organo se seleccionan de los miRNA recogidos en las tablas 1 y 2, que apareceran mas adelante.
En otra realizacion de los dos metodos anteriores, el organo es un organo digestivo (GI) y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 9, que aparecera mas adelante.
En otro aspecto, la invencion da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en cualquier tejido de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir las concentraciones de los miRNA abundantes en diferentes tejidos en una muestra de tejido corporal recogida del sujeto;
b. medir las concentraciones de los miRNA normalizadores en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un tejido concreto cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho tejido por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) son mas altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho tejido cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho tejido por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) no son mas altas que las correspondientes razones de control.
La invencion tambien da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en un tejido de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho tejido en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) con la correspondiente
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razon de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de dicho tejido cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) es mas alta que la correspondiente razon de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho tejido cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) no es mas alta que la correspondiente razon de control.
El miRNA normalizador de utilidad en los dos metodos anteriores puede ser, por ejemplo, miRNA ubicuo, miRNA expresado en muchos tejidos, pero subexpresado en dicho tejido, o miRNA seleccionado experimentalmente por ser abundante en dicho tejido.
La razon de control de las concentraciones de los miRNA utilizados en los dos metodos anteriores puede ser un estandar predeterminado (p. ej., determinado con una poblacion de sujetos de control [p. ej., emparejados por la edad con el sujeto diagnosticado] sin enfermedades en el correspondiente tejido), o la razon de las concentraciones de los mismos miRNA en una muestra de lfquido corporal procesada del mismo modo, procedente del mismo sujeto y que habfa sido recogida con anterioridad.
En una realizacion, los dos metodos anteriores implican la determinacion de dos o mas razones de miRNA.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, los miRNA abundantes en un tejido se seleccionan de los miRNA recogidos en las tablas 1 y 2 que apareceran mas adelante.
En otro aspecto, la invencion da a conocer un metodo para detectar una enfermedad en cualquier tipo de celula de un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir las concentraciones de los miRNA abundantes en diferentes tipos de celulas en una muestra de lfquido corporal del sujeto;
b. medir las concentraciones de los miRNA normalizadores en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un tipo de celulas concreto cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho tipo de celula por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) son mas altas que las correspondientes razones de los controles, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho tipo de celula cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho tipo de celula por sus correspondientes miRNA para normalizacion calculadas en la etapa (c) no son mas altas que las correspondientes razones de control.
La invencion tambien da a conocer un metodo para detectar una enfermedad de un tipo de celulas en un sujeto, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho tipo de celulas en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) con la correspondiente razon de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de dicho tipo de celula cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) es mas alta que la correspondiente razon de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho tipo de celulas cuando la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c) no es mas alta que la correspondiente razon de control.
El miRNA normalizador de utilidad en los dos metodos anteriores puede ser, por ejemplo, miRNA ubicuo, miRNA expresado en muchos tipos de celulas, pero subexpresado en dicho tipo de celulas, o miRNA seleccionado experimentalmente por ser abundante en dicho tipo de celulas.
La razon de control de las concentraciones de los miRNA utilizada en los dos metodos anteriores puede ser un estandar predeterminado (p. ej., determinado con una poblacion de sujetos de control [p. ej., emparejados por la
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edad con el sujeto diagnosticado] sin enfermedades del correspondiente tipo de celula), o la razon de las concentraciones de los mismos miRNA en una muestra de Kquido corporal procesada del mismo modo, procedente del mismo sujeto y que habfa sido recogida con anterioridad.
En una realizacion, los dos metodos anteriores implican la determinacion de dos o mas razones de miRNA.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, el miRNA abundante en un tipo de celula se selecciona de los miRNA recogidos en las tablas 1 y 2, que apareceran mas adelante.
Los metodos descritos anteriormente se pueden combinar. Por ejemplo, la deteccion de una enfermedad de un sistema de organos puede ir seguida de la determinacion del organo y/o tejido y/o tipo de celula, etc., afectado.
Cualquiera de los metodos descritos anteriormente tambien puede comprender la identificacion adicional de si la enfermedad es cancer o inflamacion, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA asociado al cancer en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de al menos un miRNA asociado la inflamacion en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en el sistema de organos, organo, tejido o tipo de celula implicado en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
d. medir la concentracion de al menos un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
e. calcular las razones por parejas de las concentraciones de los miRNA medidos en las etapas (a), (b), (c) y (d) (p. ej., razones a/b, a/c, a/d, b/c, b/d y c/d);
f. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (e) con las correspondientes razones predeterminadas caractensticas del cancer y de la inflamacion, y
g. (i) identificar que la enfermedad es cancer cuando las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (e) estan en el margen predeterminado caractenstico del cancer, o (ii) identificar que la enfermedad es inflamacion cuando las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (e) estan en un margen predeterminado caractenstico de la inflamacion.
En una realizacion del metodo anterior, los miRNA asociados al cancer y a la inflamacion se seleccionan de los miRNA recogidos en la tabla 3, que aparecera mas adelante.
En una realizacion del metodo anterior, la enfermedad tiene que ver con el pulmon y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 6, que aparecera mas adelante.
En una realizacion del metodo anterior, la enfermedad tiene que ver con el aparato digestivo (GI) y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 8, que aparecera mas adelante.
En una realizacion del metodo anterior, la enfermedad tiene que ver con el aparato respiratorio o el aparato digestivo (GI) y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 11, que aparecera mas adelante.
Un metodo parecido se puede aplicar para diferenciar el cancer, o la inflamacion, de la hipoxia.
Cualquiera de los metodos anteriores puede ir seguido de la administracion de una prueba diagnostica espedfica de a enfermedad en el sujeto.
Cualquiera de los metodos anteriores puede ir seguido de la administracion de un tratamiento terapeutico al sujeto al que se le ha diagnosticado que tiene una enfermedad.
Cualquiera de los metodos anteriores puede ir seguido de la incorporacion del sujeto a un ensayo clmico (esto se puede aplicar tanto a los sujetos a los que se ha diagnosticado una enfermedad como a los sujetos a los que se ha diagnosticado que no tienen ninguna enfermedad).
Los metodos de la invencion descritos mas arriba se pueden aplicar para la deteccion de enfermedades en cualquier sujeto, entre los que se incluyen los sujetos que no tienen smtomas clmicos indicativos de una enfermedad de dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula.
En un aspecto separado, la descripcion da a conocer un metodo para identificar un compuesto util para tratar o enlentecer la progresion de una enfermedad de un sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula, en donde dicho metodo comprende:
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a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula en una o varias muestras de Ifquidos corporales recogidas de un sujeto que tiene dicha enfermedad de dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula, en donde dicha una o varias muestras de lfquidos corporales se recoge antes de la administracion de un compuesto problema;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra o muestras de lfquidos corporales del sujeto recogidas antes de la administracion del compuesto problema;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b) para cada una de las muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto antes de la administracion del compuesto problema;
d. medir la concentracion del mismo miRNA que en la etapa (a) en una o varias muestras de lfquidos corporales del sujeto despues de la administracion del compuesto problema;
e. medir la concentracion del mismo miRNA normalizador que en la etapa (b) en la misma muestra o muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto despues de la administracion del compuesto problema;
f. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (d) y (e) para cada una de las muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto despues de la administracion del compuesto problema;
g. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en las etapas (c) y (f), y
h. (i) identificar que el compuesto problema es util para enlentecer la progresion o para tratar dicha enfermedad de dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula si la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (f) es mas baja que la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c); (ii) identificar que el compuesto problema no es util para enlentecer la progresion ni para tratar dicha enfermedad de dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula si la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (f) no es mas baja que la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c).
En una realizacion del metodo anterior, la enfermedad es cancer o inflamacion o hipoxia y el miRNA se selecciona de los miRNA recogidos en la tabla 3, que aparecera mas adelante.
En otro aspecto, la descripcion da a conocer un metodo para determinar la toxicidad de un compuesto (p. ej., un compuesto que se prueba en un ensayo clmico) o un factor ambiental (p. ej., alergeno, tabaquismo, UV, radiacion, amianto, etc.) en un sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula en un sujeto sin enfermedades de dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celulas, en donde dicho metodo comprende:
a. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula en una o varias muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto antes de que el sujeto haya quedado expuesto al compuesto o al factor ambiental;
b. medir la concentracion de un miRNA normalizador en la misma muestra o muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto antes de que el sujeto haya quedado expuesto al compuesto o al factor ambiental;
c. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en la etapas (a) y (b) para cada una de las muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto antes de que el sujeto haya quedado expuesto al compuesto o al factor ambiental;
d. medir la concentracion del mismo miRNA abundante en dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de
celula en una o varias muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto despues de que el sujeto haya quedado
expuesto al compuesto o al factor ambiental;
e. medir la concentracion del mismo miRNA para normalizacion en la misma muestra o muestras de lfquidos corporales recogidas del sujeto despues de que el sujeto haya quedado expuesto al compuesto o al factor ambiental;
f. calcular la razon de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (d) y (e) para cada una de las muestras de lfquidos corporales;
g. comparar la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en las etapas (c) y (f), y
h. (i) identificar que el compuesto o el factor ambiental no es toxico para dicho sistema de organos u organo o
tejido o tipo de celula si la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (f) no es mas alta que la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c); (ii) identificar que el compuesto o el factor ambiental es toxico para dicho sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula si la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (f) es mas alta que la razon de las concentraciones de los miRNA calculada en la etapa (c).
En una realizacion, los dos metodos anteriores implican la determinacion de las razones de dos o mas miRNA.
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En una realizacion de los dos metodos anteriores, el miRNA abundante en un sistema de organos u organo o tejido o tipo de celula se selecciona de los miRNA recogidos en las tablas 1 y 2, que apareceran mas adelante.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, el sistema de organos es sistema nervioso central y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 4, que aparecera mas adelante.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, el sistema de organos es el aparato respiratorio y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 5, que aparecera mas adelante.
En una realizacion de los dos metodos anteriores, el sistema de organos es el aparato digestivo (GI) y las parejas miRNA/normalizador se seleccionan de las recogidas en la tabla 7, que aparecera mas adelante.
Cada una de las etapas de medicion de los metodos descritos mas arriba no tiene que realizarse en el orden espedfico que se recoge mas arriba.
Los sujetos utilizados en los metodos de la presente invencion incluyen, p. ej., humanos, animales veterinarios y animales experimentales que sean modelos de enfermedades. Los ejemplos no limitantes de los miRNA biomarcadores y de los miRNA normalizadores que resultan utiles en los metodos descritos mas arriba de la presente invencion se dan a conocer, p. ej., en las tablas 1 a 11, que apareceran mas adelante.
Los ejemplos no limitantes de las muestras de lfquidos corporales que se pueden utilizar en los metodos de la invencion incluyen, p. ej., orina, plasma sangumeo y suero. Si se utiliza la orina, se prefiere que la orina de la muestra haya permanecido en la vejiga durante menos de 4 horas.
Los ejemplos no limitantes de los metodos para determinar la cantidad de miRNA en los metodos de la invencion incluyen, p. ej., hibridacion, RT-PCR y secuenciacion directa.
En algunas realizaciones, los metodos de la descripcion comprenden (p. ej., a modo de etapa inicial) la etapa de recoger una muestra de lfquido corporal del sujeto.
En una realizacion (aplicable a cualquiera de los metodos anteriores de la invencion), el metodo tambien incluye una etapa de reducir o eliminar la degradacion del miRNA. Ejemplos no limitantes de los metodos utiles para reducir o eliminar la degradacion de los miRNA incluyen, p. ej., anadir un inhibidor de ARNasas, tratamiento con cloruro de guanidina, tratamiento con isotiocianato de guanidina, tratamiento con A/-lauroilsarcosina, tratamiento con dodecilsulfato de sodio (SDS) y una combinacion de los mismos.
Junto con los metodos diagnosticos y de deteccion de mas arriba, la presente descripcion tambien da a conocer diferentes kits que comprenden uno o varios conjuntos de cebadores y/o sondas espedficos para la deteccion del miRNA deseado. Tales kits pueden ademas incluir conjuntos de cebadores y/o sondas espedficos para la deteccion del miRNA normalizador. Los ejemplos no limitantes de combinaciones de cebador o sonda en los kits son los que siguen:
1. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-1, 22, 30a-3p, 30e-3p, 133a, 133b, 197, 208a, 208b, 221, 222, 302a, 302c, 367, 378, 499-5p y 30e*.
2. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-1, 22, 95, 133a, 133b, 140 y 206.
3. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15b, 18b, 21, 34b, 126, 135b, 142-3p, 142-5p, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200c, 205, 211, 223, 224, 302b, 375, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 620, 650, 766 y 886-5p.
4. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-34b, 135b, 146, 146b, 147b, 155, 199b-5p, 200b, 200c, 205, 219-5p, 223, 302b y 375.
5. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 30e-3p, 122a, 130b, 136, 148a, 194, 376c, 455-3p, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d* y 194*.
6. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-10a, 10b, 30a-3p, 30c, 107, 135a, 135b, 184, 187, 190, 194, 196b, 200a, 204, 211, 324-5p, 489, 500, 501-5p, 502-3p, 502-5p, 503, 506, 508-3p, 508-5p, 509-3p, 509-5p, 510, 532-5p, 768-3p, 886-3p, 886-5p, 891a, 10b*, 30a*, 30c-2*, 30e*, 200a*, 200b*, 424* y 500*.
7. cebadores o sondas espedficos para al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- Let-7g, 18, 23b, 26a, 26b, 27b, 28, 106b, 143, 145, 152, 218, 221,223, 296, 374, 422b y 451.
6. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-10b, 30, 99a, 139-3p, 139-5p, 193a-5p, 196a, 224, 335, 365, 378/378*, 422b, 494, 518d-3p, 642a-3p, 708, 10b*
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y 335*.
7. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-let- 7a, 10b, 26a, 30a-3p, 30a-5p, 125b, 126, 145, 146, 195, 196a-2, 196b, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5p, 517c, 519c, 520g, 520h, 525 y 1246.
8. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7a, let-7b, let-7c, 10b, 17-3p, 26a, 100, 125a, 125b, 127, 195, 199a-5p, 202, 214, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 199a* y 202*.
9. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-10a, 10b, 31, 34b, 34c, 135a, 135b, 424 y 449.
10. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7c, 10b, 26a, 99a, 100, 125a-5p, 125b, 130a, 140, 143, 145, 195, 196b, 199b, 204, 214, 222, 939 y 199*.
11. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7a, let-7c, let-7g, 10b, 100, 101, 125a-5p, 125b, 130a, 134, 140, 143, 145, 186, 195, 196b, 197, 199a, 199b, 204, 214, 218, 222, 320, 424, 497, 154* y 199a*.
12. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7c, 1, 23b, 24, 27b, 28, 34a, 99a, 100, 125b, 130a, 143, 145, 147b, 187, 188-3p, 199b-5p, 205, 214, 222, 328, 373, 410, 455-5p y 490-3p.
13. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15b, 34a, 34b, 34c, 127, 134, 135a, 135b, 187, 202, 204, 370, 372, 376a, 382, 424, 449, 465a-5p, 465b-5p, 506, 508, 509, 510, 514, 517a, 517c, 871-5p, 871-3p, 888, 202* y 888*.
14. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en familia miR-Let-7, 10a, 17, 18a, 19a, 19b, 20a, 92, 21, 22, 23a, 24, 27a, 27b, 29a, 31, 34a, 98, 100, 106a, 126, 130a, 133a, 143, 145, 146a, 199a-3p, 210, 221, 222, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5p, 939, 27a*, 30a*, 30e*, 93*, 126*, 130b* y 222*.
15. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15a, 15b, 126, 139, 142-3p, 142-5p, 146, 150, 155, 181a, 181b, 181d, 223, 302b y 342.
16. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15a, 15b, 17-5p, 20b, 106a, 106b, 142-3p, 142-5p, 146, 149, 150, 155, 181a, 181b, 181c, 182, 183, 205, 213 y 342.
17. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 15a, 20b, 21, 106b, 140, 142-3p, 146, 146b, 150, 181b, 181d, 342 y 431.
18. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 9, 15a, 15b, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124a, 124b, 128a, 137, 142-3p, 146b-5p, 150, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 342-3p, 423, 431, 454, 484, 766, 27* y 223*.
19. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 142-3p, 146a, 155, 181a, 205, 223 y 424.
20. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-142, 150 y 342.
21. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7i, 1, 7, 135a, 135b, 206 y 345.
22. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 7, 15a, 26b, 27a, 99b, 124, 127, 132, 134, 137, 139, 152, 181a, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5p, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5p, 429, 431, 432, 455-5p, 483-5p, 514, 126*, 182* y 202*.
23. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 18a, 21, 29a, 34a, 103, 127-3p, 129-3p, 130b, 134, 135a, 135b, 136, 141, 148a, 182, 183, 184, 192, 193a- 3p, 193a-5p, 195, 199a-3p, 199a-5p, 200b, 200c, 204, 216a, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 375, 376a, 376c, 379, 382, 383, 429, 432, 451,455-5p, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b* y 493*.
24. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 9,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
21, 127-3p, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376a, 376c, 497, 939 y 493*.
25. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-31, 141, 143, 145, 147b, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200c, 200cN, 215, 219-2-3p, 321, 375, 378, 422a, 429, 450b-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 650, 801, 143* y 200b*.
26. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-31, 141, 143, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200c, 200cN, 215, 321, 375 y 429.
27. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-31, 106a, 106b, 143, 145, 148a, 203, 205, 210, 211 y 221.
28. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 26a, 26b, 29c, 31, 106a, 106b, 124b, 130b, 141, 145, 148a, 182, 188, 192, 197, 203, 375 y 650.
29. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7a, 7, 9, 96, 98, 99a, 103, 107, 124a, 125a, 125b, 127, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 149, 153, 154, 181a, 181b, 181c, 182, 183, 184, 204, 211, 212, 213, 218, 219, 221, 222, 299-3p, 299-5p, 323-3p, 324-5p, 328, 329, 330, 331, 335, 337, 338, 342, 346, 369-3p, 369-5p, 370, 379, 381, 382, 383, 409-3p, 411, 425, 432, 433-5p, 485-3p, 485-5p, 487b, 488, 491-5p, 494, 495, 496, 504, 539, 541, 543, 584, 656, 668, 758, 874, 889, 935, 939, 1193, 1197 y 9*.
30. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5p, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5p, 483-3p, 485-5p, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939 y 9*.
31. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 181c, 212, 213, 222, 330-3p, 338-5p, 342, 381, 382, 425, 433 y 491-5p.
32. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-9, 96, 99a, 103, 124a, 125b, 128a, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 212, 219, 221, 222, 324-5p, 328, 330, 331, 335-5p, 338, 369-3p, 381, 382, 383, 425, 433-5p, 485-5p y 491-5p.
33. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 124a, 128a, 132 y 212.
34. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-9, 103, 124a, 125b, 128, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 181c, 204, 212, 213, 218, 338, 381, 382, 425, 432 y 489.
35. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-103, 134, 138, 182, 183, 222, 323-3p, 369, 381 y 382.
36. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-218, 219, 338, 451 y 486.
37. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 132, 212, 213 y 328.
38. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-34b, 135b, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200c, 205, 223, 302b y 375.
39. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15b, 18b, 21, 126, 142-3p, 142-5p, 224, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 650, 766 y 886-5p.
40. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 147b, 200b y 219-5p.
41. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-31, 130b, 136, 141, 143, 145, 148a, 192, 203, 215, 375, 376c, 429, 455-5p y 650.
42. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 106a, 106b, 205 y 210, y 221.
43. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 26a, 26b, 26c, 106a, 106b, 124b, 182, 188 y 197.
44. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-194,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
200a, 200b, 200c y 321.
45. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 147b, 194, 200a, 200b, 200c, 219-3p, 378, 450-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 801, 143* y 200b*.
46. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR- 122a, 194, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d* y 194*.
47. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 18a, 21, 29a, 34a, 103, 127-3p, 129-3p, 134, 135a, 135b, 182, 183, 184, 193a-3p, 193a-5p, 195, 199a-3p, 199a-5p, 200b, 200c, 204, 216a, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 376a, 379, 382, 383, 432, 451, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b* y 493*.
48. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-1, 22, 95, 133a, 133b, 140 y 206.
49. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7a, 7, 9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 181a, 181c, 182, 184, 211, 212, 213, 218, 219, 222, 323-3p, 338-5p, 369, 381, 382, 425, 433-5p, 485-5p, 491-5p, 539, 541, 543, 656, 874, 935 y 9*.
50. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5p, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5p, 483-3p, 485-5p, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939 y 9*.
51. cebadores o sondas espedficos de miR-330-3p y miR-342.
52. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-96, 99a, 103, 181b, 221, 324-5p, 328, 330, 331, 335-5p y 383.
53. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-103, 181b, 204, 432 y 489.
54. cebadores o sondas espedficos de miR-103 y miR-183.
55. cebadores o sondas espedficos de miR-451 y miR-486.
56. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-22, 133a, 221, 222 y 30e*.
57. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-1, 30a-3p, 30e-3p, 133b, 197, 208a, 208b, 302a, 302c, 367, 378 y 499-5p.
58. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7, 10a, 17, 18a, 19a, 19b, 20a, 21, 23a, 24, 27a, 27b, 29a, 31, 34a, 92, 98, 100, 106a, 126, 130a, 143, 145, 146a, 199a-3p, 210, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5p, 939, 27a*, 30a*, 93*, 126*, 130b* y 222*.
59. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7a, Let-7c, 10b, 26a, 100, 125a, 125b, 130a, 140, 143, 145, 195, 196b, 199a, 199b, 204, 214, 222, 424, 517c y 199a*.
60. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-10a, 31, 34b, 34c, 135a, 135b y 449.
61. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7b, 127, 202, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p y 202*.
62. cebadores o sondas espedficos de miR-99a y miR-939.
63. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 101, 134, 186, 197, 218, 320, 497 y 154*.
64. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-126, 146, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5p, 519c, 520g, 520h, 525 y 1246.
65. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-7, 127 y 493*.
5
10
15
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25
30
35
40
45
66. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7i, 1, 135a, 135b, 206 y 345.
67. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 15a, 26b, 27a, 99b, 124, 132, 134, 137, 139, 152, 181a, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5p, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5p, 429, 431, 432, 455-5p, 483-5p, 514, 126*, 182* y 202*.
68. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-9, 21, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376a, 376c, 497 y 939.
69. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-15a, 15b, 142-3p, 142-5p, 146, 150, 181a, 181b, 181d, 205, 342 y 423.
70. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-126, 139, 155, 223 y 302b.
71. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-17- 5p, 20b, 106a, 106b, 149, 155, 181c, 182, 183 y 213.
72. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 20b, 21, 106b, 140, 146b y 431.
73. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-Let- 7g, 9, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124a, 124b, 128a, 137, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 431,454, 484, 766, 27* y 223*.
74. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-155, 223 y 424.
75. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en familia miR-Let-7, 10b, familia 17-92, 21, 29a, 31, 34a, 106a, 106b, 126, 146a, 146b, 155, 184, 195, familia 200/141, 210, 373, 375, 423-5p, 451 y 486.
76. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-21, 31, 34a, 125-5p, 125b, 126, 146a,b, 150, 155, 221,222 y 223.
77. cebadores o sondas espedficos de al menos dos miRNA seleccionados del grupo que consiste en miR-270, 373 y 424.
78. (i) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-128, miR-132 y miR-874, y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-9, miR-181a, miR-491-5p y miR-141.
79. (i) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-134, miR-323-3p y miR-382, y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-127 y miR-370.
80. (i) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-34b, miR-486-5p y miR-192, y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223 y miR-409-3p.
81. cebadores o sondas espedficos de miR-34b y miR-155.
82. cebadores o sondas espedficos de miR-146b-5p y al menos uno de miR-486b-5p y miR-192.
83. (i) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-192, miR-194, miR-203 y miR-215, y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-30e-3p, miR-145 y miR-148a.
84. (i) cebadores o sondas espedficos de miR-215 y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos un miRNA seleccionado del grupo que consiste en miR-30e-3p, miR-194 y miR-203.
85. (i) cebadores o sondas espedficos de miR-203 y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos uno de miR-148a y miR-192.
86. (i) cebadores o sondas espedficos de miR-194 y (ii) cebadores o sondas espedficos de al menos uno de miR-148a y miR-192.
5
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87. cebadores o sondas espedficos de al menos una pareja de miRNA seleccionada del grupo que consiste en miR-194/miR-145, miR-194/miR-148a, miR-194/miR-30e-3p, miR-215/miR-203, miR-203/miR-30e-3p, miR- 203/miR-148a, miR-192/miR-145, miR-192/miR-148a y miR-192/miR-30e-3p.
88. cebadores o sondas espedficos de al menos una pareja de miRNA seleccionada del grupo que consiste en miR-192/miR-126, miR-155/miR-126, miR-145/miR-126, miR-155/miR-30e-3p, miR-192/miR-30e-3p, miR- 155/miR-409-3p, miR-486-5p/miR-17-5p, miR-155/miR-17-5p, miR-192/miR-17-5p, miR-146b-5p/miR-31, miR-155/miR-31, miR-192/miR-31, miR-486-5p/miR-155, miR-192/miR-155, miR-145/miR-155, miR-146b- 5p/miR-155, miR-486-5p/miR-203, miR-192/miR-203, miR-145/miR-203, miR-192/miR-215 y miR-155/miR- 215.
89. cebadores o sondas espedficos de al menos una pareja de miRNA seleccionada del grupo que consiste en miR-17-5p/miR-155, miR-192/miR-155, miR-215/miR-155, miR-192/miR-30e-3p, miR-155/miR-30e-3p y miR-146b-5p/miR-30e-3p.
Los kits de la invencion pueden ademas comprender medios para el aislamiento y purificacion de los miRNA.
Los kits de la invencion pueden ademas comprender instrucciones de uso.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1A-C son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con trastorno cognitivo leve (TCL), con enfermedad de Alzheimer (EA), y controles emparejados por edad (CEE). La concentracion de miR-7 (A), miR-132 (B) y miR-874 (C) se normalizo por miR-141. Aqu y en las otras graficas de cajas y bigotes, la caja indica la distribucion del 50% de los resultados y la barra por encima y por debajo de la caja abarcan el 80% de los resultados. Los puntos senalan los valores del ensayo localizados fuera del 80% de los datos. La mediana del valor de los ensayos se indica mediante la lmea de dentro de la caja. Las concentraciones normalizadas de los miRNA se presentan en el eje de ordenadas en unidades relativas (escala logantmica).
Las figuras 2A-E son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con TCL, con EA (EA), y en los controles emparejados por edad. La concentracion de miR-7 (A), miR-128 (B), miR-132 (C), miR-382 (D) y miR-874 (E) se normalizo por miR-9.
Las figuras 3A-E son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con TCL, con EA, y en los controles emparejados por edad. La concentracion de miR-132 (A), miR-134 (B), miR-323-3p (C), miR-382 (D) y miR-874 (E) se normalizo por miR-127-3p.
Las figuras 4A-G son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con TCL, con EA, y en los controles emparejados por edad. La concentracion de miR-7 (A), miR-128 (B), miR-132 (C), miR-134 (D), miR323-3p (E), miR-382 (F) y miR-874 (G) se normalizo por miR-181a.
Las figuras 5A-H son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con TCL, con EA, y en los controles emparejados por edad. La concentracion de miR-7 (A), miR-125 (B), miR-128 (C), miR-132 (D), miR-134 (E), miR323-3p (F), miR-382 (G) y miR-874 (H) se normalizo por miR-370.
Las figuras 6A-H son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los miRNA en el plasma de pacientes con TCL, con EA, y en los controles emparejados por edad. La concentracion de miR-7 (A), miR-125 (B), miR-128 (C), miR-132 (D), miR-134 (E), miR323-3p (F), miR-382 (G) y miR-874 (H) se normalizo por miR-491-5p.
En las figuras 7A-C se presentan los analisis de curvas ROC (curvas de eficacia diagnostica) de la diferenciacion entre los pacientes con TCL (TCL) y los controles emparejados por edad (CEE) obtenidos con miR-128 (A), miR-132 (B) y miR-874 (C) normalizados por miR-491-5p. Se informa de las areas bajo la curva (ABC) ROC. La sensibilidad, especificidad y exactitud para cada pareja biomarcador/normalizador se calculan para el punto de «corte» (indicado como un punto en cada grafico); el punto de corte es la razon biomarcador/normalizador a la cual una muestra tiene la misma probabilidad de pertenecer al grupo de CEE o al de TCL.
En las figuras 8A-C se presentan los analisis de curvas ROC (curvas de eficacia diagnostica) de la diferenciacion entre los pacientes con TCL (TCL) y los controles emparejados por edad (CEE) obtenidos con miR-134 (A), miR- 323-3p (B) y miR-382 (C) normalizados por miR-370. Se informa de las areas bajo la curva (ABC) rOc. La sensibilidad, especificidad y exactitud de cada pareja biomarcador/normalizador se calculan para el punto de «corte» (indicado como un punto en cada grafico); el punto de corte es la razon biomarcador/normalizador a la cual una muestra tiene la misma probabilidad de pertenecer al grupo de CEE o al de TCL.
En las figuras 9A-F se presentan los analisis de la asociacion entre miR-128 y miR-132 (A), miR-128 y miR-874 (B), miR-132 y miR-874 (C), miR-134 y miR-323-3p (D), miR-134 y miR-382 (E), y miR-382 y miR-323-3p (F). Se compararon los valores de Ct de diferentes parejas de biomarcadores y se calcularon los coeficientes de correlacion de rangos de Spearman, r, con intervalos de confianza al 95% (MIN y MAX).
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Las figuras 10A-D son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los biomarcadores miR-34b y miR-486-5p, que abundan en los pulmones, en el plasma de pacientes con asma y neumoma frente a controles no fumadores (A y B) y en el plasma de pacientes con EPOC y CPNM frente a controles fumadores (C y D). La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por miR-409-3p, que se expresa en muchos organos, pero que esta subexpresado en el pulmon.
Las figuras 11A-H son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los biomarcadores miR-34b y miR-486-5p, que abundan en los pulmones, en el plasma de pacientes con neumoma y asma (PNA) frente a controles no fumadores. La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por otro miRNA abundante en el pulmon: A, B por miR-155; C, D por miR-146b-5p; E, F por miR-223; G, H por miR-l42-5p.
Las figuras 12A-H son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los biomarcadores miR-34b y miR-486-5p, que abundan en los pulmones, en el plasma de pacientes con EPOC y CPNM frente a controles fumadores. La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por miR-409-3p o por un miRNA abundante en el pulmon: A, B por miR-155; C, D por miR-146b-5p; E, F por miR-223; G, H por miR-142-5p; I, J por miR-409-3p.
Las figuras 13A-J son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de miR-192 en el plasma de pacientes con neumoma y asma (PNA) frente a controles no fumadores (A-E) y en el plasma de pacientes con EPOC y CPNM frente a controles fumadores (F-J). La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por miR-409-3p, que se expresa en muchos organos, pero que esta subexpresado en el pulmon, o por un miRNA abundante en el pulmon: A, F por miR-409-3p; B, G por miR-155; C, H por miR-146b-5p; D, I por miR-223; E, J por miR-142-5p.
Las figuras 14A-C son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los biomarcadores miR-34b (A), miR-486-5p (B) y miR-192 (C) en el plasma de pacientes con neumoma, asma (PNA), EPOC y CPNM frente a controles combinados (no fumadores y fumadores). La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por miR-409-3p (A), o por miR-223 (B) y miR-146b-5p (C) abundantes en el pulmon.
Las figuras 15A-C son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de los biomarcadores miR-34b, miR-486-5p y miR-192 en el plasma de todos los pacientes con enfermedades inflamatorias del pulmon (asma, neumoma y EPOC) frente a pacientes con CPNM. La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por diferentes miRNA abundantes en el pulmon: A por miR-155; B, C por miR-146b-5p.
Las figuras 16A-M son graficos que muestran la comparacion de la concentracion de miR-192 (A, E, I), miR-194 (B, F, J), miR-203 (C, G, K) y miR-215 (D, H, L), abundantes en organos de aparato digestivo (GI), en el plasma de pacientes con cancer de esofago (CE), cancer gastrico (CG), cancer colorrectal (CCR) y enfermedad de Crohn (EC) frente a los controles. La concentracion de los miRNA biomarcadores se normalizo por el miR-30e-3p ubicuo o por otros miRNA abundantes en el aparato digestivo: A-D por miR-30e-3p; E-H por miR-148a; I-L por miR-145. A-L: pacientes con las enfermedades indicadas frente a los controles; M: un grafico que muestra la comparacion de la concentracion de miR-203 y miR-192 en el plasma de los pacientes con enfermedades del aparato digestivo estudiadas (Enfermedad) frente a los controles. Todas las concentraciones se normalizaron por el miR-30e-3p ubicuo y se presentan en unidades relativas (escala logantmica).
Las figuras 17A-G son graficos que muestran la comparacion de diferentes razones de las concentraciones de miRNA en el plasma de todos los pacientes con cancer (cancer de esofago, gastrico y colorrectal) frente a los pacientes con la enfermedad de Crohn. A: miR-215/miR-30e-3p; B: miR-203/miR-148a; C: miR-194/miR-148a; D: miR-192/miR-203; E: miR-215/miR-203; F: miR-215/miR-194; G: miR-194/miR-192.
En las figuras 18A-I se muestra la comparacion de diferentes razones de las concentraciones de miRNA en el plasma de los pacientes con canceres de determinados organos digestivos. A-C: cancer de esofago (CE) frente a cancer gastrico (CG); D-F: cancer gastrico (CG) frente a cancer colorrectal (CCR); G-I: cancer de esofago (CE) frente a cancer colorrectal (CRC). A: miR-194/miR-145; B: miR-194/miR-148a; C: miR-194/miR-30e-3p; D: miR- 215/miR-203; E: miR-203/miR-30e-3p; F: miR-203/miR-148a; G: miR-192/miR-145; H: miR-192/miR-148a; I: miR- 192/miR-30e-3p.
Las figuras 19A-W son graficos que muestran la comparacion de diferentes razones de las concentraciones de miRNA en el plasma de todos los pacientes con enfermedades del aparato digestivo (GI) (enfermedad de Crohn y canceres de esofago, gastrico y colorrectal) frente a pacientes con enfermedades del aparato respiratorio (asma, neumoma, EPOC, CPNM). A-U: una pareja de miRNA biomarcador/normalizador (A: miR-192/miR-126; B: miR- 155/miR-126; C: miR-145/miR-126; D: miR-155/miR-30e-3p; E: miR-192/miR-30e-3p; F: miR-155/miR-409-3p; G: miR-486-5p/miR-17-5p; H: miR-155/miR-17-5p; I: miR-192/miR-17-5p; J: miR-146b-5p/miR-31; K: miR-155/miR-31; L: miR-192/miR-31; M: miR-486-5p/miR-155; N: miR-192/miR-155; O: miR-145/miR-155; P: miR-146b-5p/miR-155; Q: miR-486-5p/miR-203; R: miR-192/miR-203; S: miR-145/miR-203; T: miR-192/miR-215; U: miR-155/miR-215). V: un grafico que muestra la comparacion de las razones miR-486-5p/miR-155 y miR-145/miR-155 en el plasma de los pacientes con todas las enfermedades del aparato digestivo frente a las enfermedades pulmonares. W: analisis de curva ROC (curva de eficacia diagnostica) para la diferenciacion entre los pacientes con enfermedades del aparato digestivo y enfermedades pulmonares mediante el uso de las parejas de miRNA presentadas en la figura V. Se
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informa del area bajo la curva (ABC) ROC. La sensibilidad, especificidad y exactitud de cada pareja biomarcador/normalizador se calcula para el punto de «corte», que es la razon biomarcador/normalizador a la cual una muestra tiene la misma probabilidad de pertenecer al grupo de enfermedades del aparato digestivo o al de las pulmonares.
Las figuras 20A-H son graficos que muestran la comparacion de diferentes razones de concentraciones de miRNA en el plasma de todos los pacientes con enfermedades inflamatorias (asma, neumoma, EPOC y enfermedad de Crohn) frente a los pacientes con cancer (canceres de esofago, gastrico, colorrectal y de pulmon no microcftico). A-F: una pareja de miRNA biomarcador/normalizador (A: miR-17-5p/miR-155; B: miR-192/miR-155; C: miR-215/miR-155; D: miR-l92/miR-30e-3p; E: miR-155/miR-30e-3p; F: miR-146b-5p/miR-30e-3p. G: un grafico que muestra la comparacion de las razones miR-146b-5p/miR-155 y miR-146b-5p/miR-30e-3p en el plasma de pacientes con todas las enfermedades inflamatorias frente a todos los canceres. H: analisis de curvas ROC (curvas de eficacia diagnostica) para la diferenciacion entre los pacientes con canceres y con enfermedades inflamatorias mediante el uso de las parejas de miRNA presentadas en la figura G. Se informa del area bajo la curva (ABC) ROC. La sensibilidad, especificidad y exactitud de cada pareja biomarcador/normalizador se calcula para el punto de «corte», que es la razon biomarcador/normalizador a la cual una muestra tiene la misma probabilidad de pertenecer al grupo de pacientes con enfermedad inflamatoria o al de cancer.
Las figuras 21A-B son diagramas de flujo que muestran los procedimientos de entrenamiento (A) y clasificacion (B) de los biomarcadores para las enfermedades.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa en la idea del cambio de paradigma en el campo de la deteccion y el diagnostico clmicos a partir de las pruebas de deteccion espedficas de la enfermedad hasta la una o varias pruebas de deteccion universal (PDU), que detectaran la enfermedad de un sistema de organos determinado, tal como el aparato digestivo, el sistema nervioso, aparato circulatorio, etc., o de un organo o tejido o tipo de celula concretos, pero no sera espedfico de la enfermedad. Ademas, tal prueba sera capaz de diferenciar algunos tipos amplios de procesos patologicos, p. ej., enfermedades inflamatorias y tumores. Una vez que se detecta la enfermedad, se pueden aplicar las pruebas espedficas de la enfermedad para un diagnostico mas espedfico. Tales una o varias pruebas tambien se pueden utilizar para la deteccion selectiva de farmacos, asf como para evaluar la toxicidad de diferentes compuestos y factores ambientales (p. ej., durante el desarrollo de los farmacos o los ensayos clmicos). La presente invencion se basa en el uso de miRNA abundantes en sistema de organos, en organo, en tejido y/o en tipo de celulas que aparecen en los lfquidos corporales como biomarcadores de la enfermedad del organo y/o tejido y/o celula, la descripcion de los fundamentos para tal seleccion de miRNA y los metodos de interpretacion de la PDU. La PDU de la invencion tambien puede incluir miRNA biomarcadores para algunos procesos patologicos generales, tales como, p. ej., hipoxia, inflamacion, carcinogenia, etc.
La presente invencion da a conocer un nuevo metodo no invasivo o mmimamente invasivo para la deteccion precoz, preferiblemente antes de la manifestacion clmica, de los cambios patologicos (sin definir ninguna enfermedad espedfica) en un sistema de organos o en un organo/tejido/tipo de celula concretos en un sujeto, en donde dicho metodo comprende la determinacion de la concentracion de los miRNA abundantes en el sistema de organos/organo/tejido en un lfquido corporal (p. ej., plasma, orina, saliva u otro lfquido corporal) de dicho sujeto, en comparacion con un control. Espedficamente, el metodo comprende:
a. medir la concentracion de los miRNA abundantes en diferentes sistemas de organos/organos/tejidos/tipos de celulas en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
b. medir la concentracion de los miRNA normalizadores seleccionados previamente en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula concreto cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) son mas altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores calculadas en la etapa (c) no son mas altas que las correspondientes razones de control.
Si da positivo para una enfermedad, tal PDU debe ir acompanada de pruebas espedficas para diferentes enfermedades conocidas del sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula identificado por la PDU.
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La presente descripcion tambien da a conocer los metodos para seleccionar los posibles miRNA biomarcadores. Para reflejar los cambios patologicos de un sistema de organos, organo, tejido o tipo de celula concretos, tales biomarcadores deben ser, primero, abundantes en uno de esos sistemas de organos, organos o tejidos y, segundo, su concentracion en los lfquidos corporales debe ser suficientemente alta para que se pueda detectar. Aunque en la actualidad no se hayan identificado todos los miRNA y no se conozcan los perfiles de expresion de organo/tejido para muchos de ellos, los datos publicados (vease, p. ej., Hua et al. BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics, 2007, 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14; 35-42;
http://ferrolab.dmi.unict.it/miro;
http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/) son suficientes para formular los principales principios para la seleccion de los posibles biomarcadores:
1. Abundancia en el sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula. Aunque algunos miRNA son muy abundantes en un determinado organo o tejido, p. ej., miR-122 en el hngado y miR-124 en el cerebro, no se conoce ningun miRNA que sea espedfico al 100% de un organo o tejido. Por supuesto, cuanto mayor es la abundancia del miRNA en un sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula dado en comparacion con los otros sistemas de organos/organo/tejidos/tipos de celulas, mayores posibilidades tendra de convertirse en biomarcador. En la practica, si la concentracion de los miRNA en un organo es al menos 4-5 veces mas alta que en otros, se pueden seleccionar como posibles biomarcadores para la PDU. Para muchos organos, tales miRNA se pueden encontrar en la bibliograffa (vease, p. ej., Hua et al. BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007; 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA 2008, 14: 35-42;
http://ferrolab-dmi.unict.it/miro/;
http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/). La tabla 1 representa los miRNA abundantes en diferentes organos de acuerdo con los numerosos datos publicados. Se puede ver que algunos miRNA son abundantes en diferentes organos del mismo sistema de organos. Esto es especialmente caractenstico de los organos digestivos, nerviosos, reproductores y circulatorios (tabla 2). El uso de estos miRNA permite disenar una prueba que detectara la enfermedad en los sistemas, pero no en un organo concreto. Al mismo tiempo, hay miRNA abundantes en uno o dos organos de un sistema, y estos miRNA se pueden utilizar para pruebas que pueden definir la localizacion de la enfermedad de manera mas precisa. La lista de estos miRNA se presenta en la tercera columna de la tabla
2. Hay tambien miRNA abundantes en dos o incluso mas organos, que normalmente se desarrollan durante la embriogenesis desde los mismos tipos de celulas. En tales casos, el incremento de la concentracion de los miRNA en el lfquido corporal no se puede interpretar sin ambiguedad. No obstante, este problema se resuelve con la combinacion de varios miRNA abundantes en distintos conjuntos de organos, y la presente invencion tambien incluye un metodo computacional para el analisis de los datos obtenidos con varios miRNA. Tambien es importante destacar que la abundancia de los miRNA en el segundo organo no afectara de manera significativa a los resultados de la prueba, siempre que sea poco probable que estos miRNA aparezcan en los lfquidos corporales. Por ejemplo, muchos miRNA son abundantes (ademas de en otros organos) en la piel, pero si estos miRNA estan localizados en la epidermis, la probabilidad de que aparezcan en el torrente circulatorio de la piel es muy baja y el metodo de la invencion los utiliza.
2. Nivel de expresion del miRNA. El desarrollo de la prueba es mas facil y su sensibilidad es mas alta si la concentracion del posible o posibles miRNA biomarcadores en el sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula deseado es suficientemente alta, ya que se puede esperar que aparezcan mas moleculas de miRNA biomarcadores en los lfquidos corporales. Asf pues, si se puede elegir entre muchos miRNA biomarcadores posibles, se deben seleccionar los miRNA que no solo son abundantes en la diana, sino que tambien se expresen mucho (p. ej., > 1000 copias por celula). Esto es especialmente importante para los organos pequenos o sus partes o tipos de celulas espedficos dentro de los organos, tales como los islotes pancreaticos de celulas p. Esto no significa que este miRNA que no se expresa mucho no se pueda utilizar para el desarrollo de la PDU, sino que la deteccion del miRNA expresado en poca cantidad podna necesitar un mayor volumen de los lfquidos corporales y tecnicas mas sensibles para la cuantificacion del miRNA. Al mismo tiempo, ya que la concentracion del miRNA en un lfquido corporal tambien depende de la eficacia de su secrecion desde las celulas hacia un espacio extracelular y del transporte al lfquido corporal (vease el siguiente apartado), para la seleccion experimental de los biomarcadores mas prometedores se deben analizar tantos miRNA abundantes en el sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula como sea posible.
3. Secrecion del miRNA. Hay muchas maneras de que un miRNA acelular aparezca en los lfquidos corporales (Hunter et al., PloS ONE. 2008, 3: e3694; Wang et al., Nucleic Acids Res. 2010, 38: 7248-7259; Pigati et al., PloS ONE. 2010, 5: e13515; Gupta et al., Circ. Cardiovasc. Genet. 2010, 3: 484-488; Iguchi et al., Commun. Integr. Biol. 2010, 3: 478-481; Kosaka et al., J. Biol. Chem. 2010, 285: 17442-17452). Los miRNA pueden aparecer en el espacio extracelular y a continuacion en los lfquidos corporales como resultado de: (i) la muerte celular y la permeabilizacion de la membrana celular; (ii) la destruccion de algunos compartimientos celulares, tales como axones, dendritas y espinas de las neuronas; (iii) la exocitosis (Skog et al. Nat. Cell. Biol. 2008, 10: 1470-1476); (iv) la zeiosis (Charras et al., Biophys J. 2008, 94: 1836-1853; Fackler, Grosse, J. Cell Biol. 2008, 181: 879-884); (v) la secrecion del miRNA libre o fijado a protemas (Wang et al., Nucleic Acids. Res. 2010, 38: 7248-7259). El ultimo mecanismo proporciona mas del 50% del miRNA acelular en el medio extracelular desde las celulas vivas. La secrecion de los miRNA es selectiva y las razones de diferentes concentraciones de los miRNA en las celulas y en el medio extracelular son diferentes. La
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selectividad de la secrecion de los miRNA es muy importante para seleccionar los posibles biomarcadores. Ya que no se han investigado los mecanismos de la secrecion de miRNA desde las celulas normales y durante el desarrollo de enfermedades (Rabinowits et al. Clin. Lung. Cancer, 2009, 10: 42-46), es necesario analizar mas miRNA, teniendo en cuenta que algunos de ellos, que parecen prometedores debido a su elevada expresion y a que abundan en un organo/tejido deseado, se pueden secretar a una concentracion baja y viceversa. Recientemente tambien se demostro que algunos miRNA, p. ej., miR-451 y miR-1246, que se secretan en muy poca cantidad desde las celulas normales, se pueden secretar con mucha mas eficacia desde las celulas enfermas (Pigati et al. PloS ONE, 2010, 5: e13515). Estos miRNA tambien se pueden analizar como posibles biomarcadores, aunque no sean muy abundantes en un sistema de organos, organo o tejido determinado, ya que su combinacion con mas miRNA espedficos de organo/tejido proporcionara mas informacion util para detectar una enfermedad.
Es importante recordar que aun no se han descubierto muchos miRNA y que no se ha analizado el perfil de expresion en diferentes tejidos de muchos miRNA descubiertos recientemente. Ademas, en muchos organos, tejidos y, en especial, tipos de celulas, no se ha analizado la expresion de los miRNA que ya se conocen. Asf pues, aunque el desarrollo de la PDU se puede iniciar sobre la base de datos ya publicados para muchos organos y tejidos, la busqueda adicional de nuevos biomarcadores incrementara el valor informativo de la PDU. Primero, se debe analizar el perfil de expresion de todos los miRNA conocidos en diferentes sistemas de organos/organos/tejidos/tipos de celulas para definir nuevos miRNA abundantes en el sistema de organos/organo/tejido (p. ej., por RT-PCR, que actualmente es la tecnica mas sensible y la menos variable para la medicion cuantitativa de los miRNA). Segundo, el perfil de expresion de cualquier miRNA nuevo recien descubierto se debe analizar tal y como esta descrito mas arriba. Tercero, como todos los organos estan compuestos por diferentes tipos de celulas, la expresion de los miRNA abundantes en determinados organos se debe tambien analizar para averiguar el tipo de celula en el cual son abundantes estos miRNA. En la actualidad, la mejor tecnica para tal estudio es la hibridacion in situ (ISH, por su nombre en ingles). Tal informacion, disponible en la actualidad para diferentes miRNA, se ha incluido en las tablas 1 y 2. Por ejemplo, se incluye la informacion sobre los miRNA abundantes en las celulas p pancreaticas, ademas de los miRNA abundantes en el pancreas, asf como la abundancia de algunos miRNA en las neuronas localizadas en diferentes regiones del encefalo.
Tabla 1. miRNA abundantes en diferentes organos y tejidos humanos
Organo/tejido/celula
miRNA abundante en el organo/tejido
Corazon
1, 22, 30a-3p, 30e-3p, 133a, 133b, 197, 208a, 208b, 221, 222, 302a, 302c, 367, 378, 499-5p, 30e*
Musculoesqueletico
1, 22, 95, 133a, 133b, 140, 206
Pulmon
15b, 18b, 21, 34b, 126, 135b, 142-3p, 142-5p, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200c, 205, 211, 223, 224, 302b, 375, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 620, 650, 766, 886-5p
Traquea
34b, 135b, 146, 146b, 147b, 155, 199b-5p, 200b, 200c, 205, 219-5p, 223, 302b, 375
Hfgado
30e-3p, 122a, 130b, 136, 148a, 194, 376c, 455-3p, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d*, 194*
Rinon
10a, 10b, 30a-3p, 30c, 107, 135a, 135b, 184, 187, 190, 194, 196b, 200a, 204, 211, 3245p, 489, 500, 501-5p, 502-3p, 502-5p, 503, 506, 508-3p, 508-5p, 509-3p, 509-5p, 510, 532-5p, 768-3p, 886-3p, 886-5p, 891a, 10b*, 30a*, 30c-2*, 30e*, 200a*, 200b*, 424*, 500*.
Vejiga
Let-7g, 18, 23b, 26a, 26b, 27b, 28, 106b, 143, 145, 152, 218, 221, 223, 296, 374, 422b, 451
Adiposo
10b, 30, 99a, 139-3p, 139-5p, 193a-5p, 196a, 224, 335, 365, 378/378*, 422b, 494, 518d- 3p, 642a-3p, 708, 10b*, 335*
Mama
let-7a, 10b, 26a, 30a-3p, 30a-5p, 125b, 126, 145, 146, 195, 196a-2, 196b, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5p, 517c, 519c, 520g, 520h, 525, 1246
Organo/tejido/celula
miRNA abundante en el organo/tejido
Ovario
Let-7a, let-7b, let-7c, 10b, 17-3p, 26a, 100, 125a, 125b, 127, 195, 199a-5p, 202, 214, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 199a*, 202*
Trompas de Falopio
10a, 10b, 31, 34b, 34c, 135a, 135b, 424, 449
Utero
Let-7c, 10b, 26a, 99a, 100, 125a-5p, 125b, 130a, 140, 143, 145, 195, 196b, 199b, 204, 214, 222, 939, 199*
Cuello uterino
Let-7a, let-7c, let-7g, 10b, 100, 101, 125a-5p, 125b, 130a, 134, 140, 143, 145, 186, 195, 196b, 197, 199a, 199b, 204, 214, 218, 222, 320, 424, 497, 154*, 199a*
Prostata
Let-7c, 1, 23b, 24, 27b, 28, 34a, 99a, 100, 125b, 130a, 143, 145, 147b, 187, 188-3p, 199b-5p, 205, 214, 222, 328, 373, 410, 455-5p, 490-3p
Testiculo
15b, 34a, 34b, 34c, 127, 134, 135a, 135b, 187, 202, 204, 370, 372, 376a, 382, 424, 449, 465a-5p, 465b-5p, 506, 508, 509, 510, 514, 517a, 517c, 871-5p, 871-3p, 888, 202*, 888*
Sistema vascular
Familia de Let-7, 10a, agrupamiento 17-92 (17, 18a, 19a, 19b, 20a, 92), 21, 22, 23a, 24, 27a, 27b, 29a, 31, 34a, 98, 100, 106a, 126, 130a, 133a, 143, 145, 146a, 199a-3p, 210, 221, 222, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5p, 939, 27a*, 30a*, 30e*, 93*, 126*, 130b*, 222*
Bazo
15a, 15b, 126, 139, 142-3p, 142-5p, 146, 150, 155, 181a, 181b, 181d, 223, 302b, 342
Timo
15a, 15b, 17-5p, 20b, 106a, 106b, 142-3p, 142-5p, 146, 149, 150, 155, 181a, 181b, 181c, 182, 183, 205, 213, 342
Ganglios linfaticos
Let-7g, 15a, 20b, 21, 106b, 140, 142-3p, 146, 146b, 150, 181b, 181d, 342, 431
Linfocitos perifericos
Let-7g, 9, 15a, 15b, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124a, 124b, 128a, 137, 142-3p, 146b-5p, 150, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 342-3p, 423, 431, 454, 484, 766, 27*, 223*
Linfocitos T
142-3p, 146a, 155, 181a, 205, 223, 424
Linfocitos B
142, 150, 342
Tiroides
Let-7i, 1, 7, 135a, 135b, 206, 345
Glandula suprarrenal
Let-7g, 7, 15a, 26b, 27a, 99b, 124, 127, 132, 134, 137, 139, 152, 181a, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5p, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5p, 429, 431, 432, 455-5p, 483-5p, 514, 126*, 182*, 202*
Pancreas
7, 18a, 21, 29a, 34a, 103, 127-3p, 129-3p, 130b, 134, 135a, 135b, 136, 141, 148a, 182, 183, 184, 192, 193a-3p, 193a-5p, 195, 199a-3p, 199a-5p, 200b, 200c, 204, 216a, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 375, 376a, 376c, 379, 382, 383, 429, 432, 451, 455-5p, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b*, 493*
Celulas p pancreaticas
7, 9, 21, 127-3p, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376a, 376c, 497, 939, 493*
Intestino grueso (colon)
31, 141, 143, 145, 147b, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200c, 200cN, 215, 219-2-3p, 321, 375, 378, 422a, 429, 450b-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 650, 801, 143*, 200b*
Intestino delgado
31, 141, 143, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200c, 200cN, 215, 321, 375, 429
Organo/tejido/celula
miRNA abundante en el organo/tejido
Esofago
31, 106a, 106b, 143, 145, 148a, 203, 205, 210, 211,221
Estomago
7, 26a, 26b, 29c, 31, 106a, 106b, 124b, 130b, 141, 145, 148a, 182, 188, 192, 197, 203, 375, 650
Cerebro
Let-7a, 7, 9, 96, 98, 99a, 103, 107, 124a, 125a, 125b, 127, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 149, 153, 154, 181a, 181b, 181c, 182, 183, 184, 204, 211,212, 213, 218, 219, 221, 222, 299-3p, 299-5p, 323-3p, 324-5p, 328, 329, 330, 331, 335, 337, 338, 342, 346, 3693p, 369-5p, 370, 379, 381, 382, 383, 409-3p, 411, 425, 432, 433-5p, 485-3p, 485-5p, 487b, 488, 491-5p, 494, 495, 496, 504, 539, 541, 543, 584, 656, 668, 758, 874, 889, 935, 939, 1193, 1197, 9*
Cerebro, abundante en sinapsis, axones, dendritas, espinas
7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5p, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5p, 483-3p, 485-5p, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939, 9*
Corteza
9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 181c, 212, 213, 222, 330-3p, 338-5p, 342, 381, 382, 425, 433, 491-5p
Hipocampo
9, 96, 99a, 103, 124a, 125b, 128a, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 212, 219, 221, 222, 324-5p, 328, 330, 331, 335-5p, 338, 369-3p, 381, 382, 383, 425, 433-5p, 485-5p, 491-5p
Hipotalamo
7, 124a, 128a, 132, 212
Cerebelo
9, 103, 124a, 125b, 128, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 181c, 204, 212, 213, 218, 338, 381, 382, 425, 432, 489
Amygdala
103, 134, 138, 182, 183, 222, 323-3p, 369, 381, 382
Medula espinal
218, 219, 338, 451, 486
Hipofisis
7, 132, 212, 213, 328
Se pueden hacer varios niveles o generaciones de PDU. El primero se puede desarrollar para los sistemas del cuerpo humano (aparato digestivo, aparato genitourinario, cerebro, aparato circulatorio, etc.). El siguiente nivel de pruebas se puede centrar en organos, tejidos, tipos de celulas, etc. Segun las necesidades clmicas y las ventajas 5 economicas, hay al menos dos versiones posibles de PDU y de sus aplicaciones practicas: (i) primero, se puede realizar la PDU para los sistemas del cuerpo humano y a continuacion, si se ha detectado una enfermedad en uno o varios sistemas, se realizaran las pruebas para los organos/tejidos de esos sistemas; (ii) segundo, la PDU de organo/tejido/tipo de celula se puede aplicar directamente con propositos de deteccion.
Todos los organos y tejidos consisten en varios tipos de celulas con diferentes origen, funcion y posibles 10 enfermedades. Aunque la presente invencion se centra principalmente en el nivel de los organos y tejidos, y sus sistemas, se puede utilizar la misma estrategia para desarrollar una PDU que cubra diferentes tipos de celulas, cuando se dispone de suficiente informacion sobre los perfiles de expresion de los miRNA en diferentes tipos de celulas. En la actualidad, se ha obtenido tal informacion para las celulas p pancreaticas (tablas 1 y 2), lo que hace factible que la PDU incluya los miRNA abundantes en las celulas p, por ejemplo, para la deteccion precoz de la 15 diabetes de tipo 1. Los miRNA marcadores para los linfocitos B y T tambien estan disponibles y su inclusion en la PDU ayudara a la deteccion precoz de las enfermedades en las que intervienen estos tipos de celulas.
Tabla 2. miRNA abundantes en los sistemas de organos y solo en determinados organos
Sistemas del cuerpo humano
miRNA biomarcadores Abundante en el organo
Aparato respiratorio
34b, 135b, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200c, 205, 223, 302b, 375 Pulmon: 15b, 18b, 21, 126, 142-3p, 142-5p, 224, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 650, 766, 886-5p Traquea: 147b, 200b, 219-5p
Aparato digestivo (Gastrointestinal)
31, 130b, 136, 141, 143, 145, 148a, 192, 203, 215, 375, 376c, 429, 455-5p, 650 Esofago: 106a, 106b, 205, 210, 221 Estomago: 7, 26a, 26b, 26c, 106a, 106b, 124b, 182, 188, 197 Intestino delgado: 194, 200a, 200b, 200c, 321 Intestino grueso: 147b, 194, 200a, 200b, 200c, 2193p, 378, 450-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 5743p, 622, 801, 143*, 200b* Hfgado; 122a, 194, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d*, 194* Pancreas: 7, 18a, 21, 29a, 34a, 103, 127-3p, 129-3p, 134, 135a, 135b, 182, 183, 184, 193a-3p, 193a-5p, 195, 199a-3p, 199a-5p, 200b, 200c, 204, 216a, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 376a, 379, 382, 383, 432, 451, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b*, 493*
Aparato locomotor
1, 22, 95, 133a, 133b, 140, 206
Sistema nervioso miRNA, abundante en sinapsis, axones, dendritas, espinas
Let-7a, 7, 9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 181a, 181c, 182, 184, 211, 212, 213, 218, 219, 222, 323-3p, 3385p, 369, 381, 382, 425, 433-5p, 485-5p, 491-5p, 539, 541, 543, 656, 874, 935, 9* 7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5p, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5p, 483-3p, 485-5p, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939, 9* Corteza: 330-3p, 342 Hipocampo: 96, 99a, 103, 181b, 221, 324-5p, 328, 330, 331, 335-5p, 383 Hipotalamo: no se ha hallado ningun miRNA espedfico Cerebelo: 103, 181b, 204, 432, 489 Amfgdala: 103, 183 Medula espinal: 451, 486 Hipofisis: 328
Aparato circulatorio (cardiovascular)
22, 133a, 221, 222, 30e* Corazon: 1, 30a-3p, 30e-3p, 133b, 197, 208a, 208b, 302a, 302c, 367, 378, 499-5p Sistema vascular: Let-7, 10a, 17, 18a, 19a, 19b, 20a, 21, 23a, 24, 27a, 27b, 29a, 31, 34a, 92, 98, 100, 106a, 126, 130a, 143, 145, 146a, 199a-3p, 210, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5p, 939, 27a*, 30a*, 93*, 126*, 130b*, 222*
Aparato urinario
No se ha encontrado ningun miRNA abundante ni en el rinon ni en la vejiga
Sistemas del cuerpo humano
miRNA biomarcadores Abundante en el organo
Aparato reproductor (femenino)
Let-7a, Let-7c, 10b, 26a, 100, 125a, 125b, 130a, 140, 143, 145, 195, 196b, 199a, 199b, 204, 214, 222, 424, 517c, 199a* Trompas de Falopio: 10a, 31, 34b, 34c, 135a, 135b, 449 Ovario: Let-7b, 127, 202, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 202* Utero: 99a, 939 Cuello uterino: Let-7g, 101, 134, 186, 197, 218, 320, 497, 154* Mama: 126, 146, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5p, 519c, 520g, 520h, 525, 1246
Sistema endocrino
7, 127, 493* Tiroides: Let-7i, 1, 135a, 135b, 206, 345 Glandula suprarrenal: Let-7g, 15a, 26b, 27a, 99b, 124, 132, 134, 137, 139, 152, 181a, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5p, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5p, 429, 431,432, 455-5p, 483-5p, 514, 126*, 182*, 202* Celulas p pancreaticas: 9, 21, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376a, 376c, 497, 939
Aparato circulatorio
15a, 15b, 142-3p, 142-5p, 146, 150, 181a, 181b, 181d, 205, 342, 423 Bazo: 126, 139, 155, 223, 302b Timo: 17-5p, 20b, 106a, 106b, 149, 155, 181c, 182, 183, 213 Ganglios linfaticos: Let-7g, 20b, 21, 106b, 140, 146b, 431 Celulas mononucleares perifericas: Let-7g, 9, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124a, 124b, 128a, 137, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 431, 454, 484, 766, 27*, 223* Linfocitos T: 155, 223, 424 Linfocitos B: no se ha encontrado ningun miRNA espedfico
Aunque la presente invencion se centra en el desarrollo de la PDU y su uso para la deteccion precoz de enfermedades con independencia de su naturaleza, pero espedficas de un determinado sistema organos, organo, tejido y/o tipo de celula, tal o tales pruebas tambien pueden incluir miRNA biomarcadores, cuyo incremento de la 5 expresion es caractenstico de las enfermedades generales mas frecuentes, tales como hipoxia, inflamacion y cancer (tabla 3). Se espera que se describan pronto muchos mas posibles miRNA biomarcadores para estas enfermedades.
Tabla 3. Lista de miRNA cuyos cambios de concentracion son caractensticos de enfermedades amplias
miRNA
Enfermedad*
Familia Let-7
Cancer
10b
Cancer
Familia 17-92
Cancer
miRNA
Enfermedad*
21
Cancer, inflamacion
29a
Cancer
31
Cancer, inflamacion
34a
Cancer, inflamacion
106a,b
Cancer
125a-5p
Inflamacion
125b
Inflamacion
126
Cancer, inflamacion
146a,b
Cancer, inflamacion
150
Inflamacion
155
Cancer, inflamacion
184
Cancer
195
Cancer
Familia 200/141
Cancer
210
Cancer
221
Inflamacion
222
Inflamacion
223
Inflamacion
270
Hipoxia
373
Cancer, hipoxia
375
Cancer
423-5p
Cancer
424
Hipoxia
451
Cancer
486
Cancer
*Referencias:
1. Osada H., Takahaslii T., Carcinogenesis 2007, 28, 2-12.
2. SchOlerN. elal,, Expll, Hematology 2010, 38, 1126-1130.
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6. Wang Q. et al„ Exptl. Biol. Med., 2012, [Epub Feb 16],
7. Oglesby IK etal., Respiratory Res., 2010, 11,148.
8. Lcidinger P, et al,, Frontiers in Genetics, 2012, 2, 104,
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10. Yu D.-C., et al., Int. J. Mol. Sci., 2012, 12,2055-2063.
En las tablas que aparecen a continuacion se recogen los diferentes miRNA biomarcadores y normalizadores de utilidad que se describen en los ejemplos que vienen mas adelante:
5 Tabla 4: parejas biomarcador/normalizador para TCL/EA
Numero
Biomarcador Normalizadores
1
miR-128 miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
2
miR-132 miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
3
miR-874 miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
4
miR-134 miR-127, miR-370
5
miR-323-3p miR-127, miR-370
6
miR-382 miR-127, miR-370
7
Todos los miRNA biomarcadores Media de varios o todos los miRNA normalizadores
Tabla 5: parejas biomarcador/normalizador para enfermedades pulmonares
Numero
Biomarcador Normalizadores
1
miR-34b miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
2
miR-486-5p miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
3
miR-192 miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
Tabla 6: parejas biomarcador/normalizador inflamatorias
para diferenciar entre el CPNM y las
Numero
Biomarcador Normalizadores
1
miR-34b miR-155
2
miR-486b-5p miR-146b-5p
Numero
Biomarcador Normalizadores
3
miR-192 miR-146b-5p
Tabla 7: parejas biomarcador/normalizador para las enfermedades digestivas
Numero
Biomarcador Normalizadores
1
miR-192 miR-30e-3p, miR-145, miR-148a
2
miR-194 miR-30e-3p, miR-145, miR-148a
3
miR-203 miR-30e-3p, miR-145, miR-148a
4
miR-215 miR-30e-3p, miR-145, miR-148a
Tabla 8: parejas biomarcador/normalizador para diferenciar entre la enfermedad de Crohn y los canceres digestivos
Numero
Biomarcador Normalizadores
1
miR-215 miR-30e-3p, miR-194, miR-203
2
miR-203 miR-148a
3
miR-194 miR-148a, miR-192
4
miR-192 miR-203
5
Tabla 9: parejas de miRNA cuya razon diferencia entre los canceres de diferentes organos digestivos
Numero
Canceres comparados Parejas de miRNA
1
Esofagico frente a gastrico miR-194/miR-145, miR-194/miR-148a, miR-194/miR-30e-3p
2
Gastrico frente a colorrectal miR-215/miR-203, miR-203/miR-30e-3p, miR-203/miR-148a
3
Esofagico frente a colorrectal miR-192/miR-145, miR-192/miR-148a, miR-192/miR-30e-3p
Tabla 10: parejas de miRNA cuya razon diferencia entre las enfermedades de los aparatos respiratorio y digestivo
Numero
Parejas de miRNA
1
miR-192/miR-126
2
miR-155/miR-126
3
miR-145/miR-126
4
miR-155/miR-30e-3p
Numero
Parejas de miRNA
5
miR-192/miR-30e-3p
6
miR-155/miR-409-3p
7
miR-486-5p/miR-17-5p
8
miR-155/miR-17-5p
9
miR-192/miR-17-5p
10
miR-146b-5p/miR-31
11
miR-155/miR-31
12
miR-192/miR-31
13
miR-486-5p/miR-155
14
miR-192/miR-155
15
miR-145/miR-155
16
miR-146b-5p/miR-155
17
miR-486-5p/miR-203
18
miR-192/miR-203
19
miR-145/miR-203
20
miR-192/miR-215
21
miR-155/miR-215
Tabla 11: parejas de miRNA cuya razon diferencia entre las enfermedades inflamatorias y los canceres de los aparatos respiratorio y digestivo
Numero
Parejas de miRNA
1
miR-17-5p/miR-155
2
miR-192/miR-155
3
miR-215/miR-155
4
miR-192/miR-30e-3p
5
miR-155/miR-30e-3p
6
miR-146b-5p/miR-30e-3p
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Los ejemplos de metodos utiles para medir la concentracion de los miRNA en los Kquidos corporales incluyen la hibridacion con sondas selectivas (p. ej., mediante transferencia de tipo Northern, citometna de flujo basada en perlas, microchips [micromatrices] de oligonucleotidos o ensayos de hibridacion en solucion, tal como el kit de deteccion de miRNA mirVana de Ambion), deteccion basada en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa acoplada a la retrotranscripcion de horquillas [RT-PCR], metodo matricial basado en la RT-PCR cuantitativa [matriz de qPCR]), o secuenciacion directa mediante una de las tecnologfas de secuenciacion de nueva generacion (p. ej., secuenciacion de ARN pequeno de Helicos, BeadArray para miRNA (Illumina), Roche 454 (FLX-Titanium) y ABI SOLiD). Para una revision de otras tecnicas que se pueden aplicar, vease, p. ej., Chen et al., BMC Genomics, 2009, 10: 407; Kong et al., J Cell Physiol. 2009; 218: 22-25. Ya que muchos miRNA espedficos de tejidos/organos estan presentes en los lfquidos corporales a una concentracion mucho mas baja que el miRNA ubicuo, y que una prueba de deteccion debe proporcionar la deteccion precoz de los cambios asociados a la enfermedad, que pueden ser relativamente bajos, es importante utilizar, al menos en la etapa de demostracion preliminar, la tecnica mas sensible, y que menos vane, para medir las concentraciones de los miRNA. En la presente invencion, se utilizo a lo largo del estudio la RT-PCR, que detecta cantidades mayores de miRNA en el plasma y que es significativamente mas robusta que las diferentes tecnicas de matrices. Esto no excluye el uso de otras tecnicas de analisis de miRNA en una prueba clmica resultante.
En algunas realizaciones, los miRNA se purifican antes de la cuantificacion. Los miRNA se pueden aislar y purificar de los lfquidos corporales mediante diferentes metodos, que incluyen el uso de kits comerciales (p. ej., kit miRNeasy [Qiagen], kit de aislamiento de ARN MirVana [Ambion/ABI], miRAcLE [Agilent], kit de aislamiento de miRNA High Pure [Roche] y kit de purificacion de miRNA [Norgen Biotek Corp.]), extraccion con Trizol (vease el ejemplo 1 que aparecera mas adelante), concentracion y purificacion en intercambiadores de aniones, perlas magneticas recubiertas con sustancias que se fijan al ARN, o absorcion de determinados miRNA sobre oligonucleotidos complementarios.
En algunas realizaciones, se reduce o se elimina la degradacion de los miRNA de las muestras de lfquidos corporales y/o durante la purificacion de los ARN pequenos. Los metodos utiles para reducir o eliminar la degradacion de los miRNA incluyen, sin limitacion, la adicion de inhibidores de las ARNasas (p. ej., Rnasin Plus [Promega], SUPERase-In [ABI], etc.), uso del cloruro de guanidina, isotiocianato de guanidina, A/-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de sodio (SDS), o una combinacion de los mismos. De igual forma, cuando se trabaja con muestras de orina, se puede conseguir un riesgo mas bajo de degradacion del miRNA cuando la muestra se ha mantenido en la vejiga durante un tiempo mas breve (p. ej., menos de 4 horas). La reduccion de la degradacion de los miRNA en las muestras de lfquidos corporales es particularmente importante cuando se requiere el almacenamiento y el transporte de las muestras antes de cuantificar el miRNA.
La presente descripcion tambien da a conocer varias estrategias para la normalizacion de la concentracion de los miRNA detectados en los lfquidos corporales. Se podran emplear en la presente invencion diversos metodos de normalizacion de datos experimentales para explicar las posibles perdidas de un miRNA dado durante la purificacion, la posible inhibicion de la RT-PCR, los miRNA contaminantes procedentes de celulas muertas o danadas de la sangre o de la orina durante el aislamiento y el tratamiento de la muestra, variaciones de la filtracion de los rinones, etc. Por ejemplo, en le presente invencion se pueden utilizar uno o varios de los siguientes metodos de normalizacion:
a) Se pueden sintetizar oligonucleotidos de miRNA sinteticos (p. ej., miRNA ausente en las celulas humanas) y utilizarlos como controles para las perdidas durante la purificacion y la inhibicion de la RT-PCR (al anadirlos a las muestras de lfquidos corporales antes de la purificacion de los miRNA).
b) La concentracion de un miRNA deseado se puede normalizar por uno de los miRNA ubicuos (p. ej., miR-16, miR-30e, miR-103 y otros), por los ARN nucleolares pequenos (snoRNA), o por el ARN nuclear pequeno U6 (U6 snRNA).
c) Otra estrategia se basa en la normalizacion de la concentracion de los miRNA deseados que se expresan en numerosos tejidos, pero no en uno deseado. Por ejemplo, el miR-10a y el miR-141 se expresan en el cerebro en mucha menor cantidad que en otros organos, y el miR-409-3p se expresa en el pulmon en una cantidad mucho mas baja que en otros tejidos. Esta estrategia disminuye la posibilidad de que un miRNA normalizador cambie debido a una enfermedad concreta.
d) La concentracion de un miRNA deseado tambien se puede normalizar por un miRNA de otros organos (p. ej., el miRNA abundante en el corazon se puede normalizar por el miRNA abundante en el colon o en el cerebro, y viceversa).
e) La normalizacion de un miRNA deseado por otro miRNA abundante en el mismo organo, tejido o sistema de organos puede ser eficaz si un el miRNA biomarcador y el miRNA normalizador se expresan en diferentes tipos de celulas o en diferentes organos del mismo sistema.
f) La normalizacion de un miRNA deseado por otro miRNA del mismo organo o tejido si su expresion y/o secrecion se ven afectadas de manera diferente por una enfermedad.
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g) La normalizacion de un miRNA deseado por un miRNA abundante en el tejido es util cuando, por ejemplo, los cambios de la expresion y/o secrecion de un miRNA deseado son caractensticos de una enfermedad concreta (cancer, inflamacion, etc.), pero el miRNA no es abundante en el organo/tejido de interes. En tal caso, la normalizacion por un miRNA abundante en el tejido sera de ayuda para relacionar una enfermedad con un determinado organo o sistema de organos.
h) La normalizacion por la media de varios miRNA normalizadores o, si se analizan muchos miRNA, p. ej., mas de 15, la normalizacion por la media de todos los miRNA analizados.
i) Para explicar las variaciones de filtracion del rinon (cuando se trabaja con las muestras de orina), la concentracion del miRNA en la orina se puede normalizar por la concentracion de creatinina y/o albumina.
El calculo de la normalizacion junto con el procesamiento adicional de los datos se puede realizar mediante el programa informatico de la PDU, que consiste en tres partes:
• Sistema de gestion de bases de datos (SGBD) utilizado para acceder y mantener la K-base y la I-base. Puede ser uno de los sistemas estandares de la industria, como, pero sin limitarse a ellos, SQL Server, Oracle, mySQL, etc.
• Aplicacion para el desarrollo de pruebas de deteccion a utilizar en la etapa de investigacion. Las funciones de esta aplicacion incluyen la seleccion del miRNA adecuado y la construccion de conjuntos de datos, creacion de conjuntos de enfermedades, etc. La aplicacion es de tipo escritorio e incluye: (i) interfaz de usuario para introducir/inspeccionar datos en la K-base y en la I-base, y para controlar la ejecucion de los algoritmos; (ii) procesamiento de los datos para el aprendizaje y la clasificacion en la etapa de desarrollo; (iii) programas de servicio para comprobar la coherencia de los conjuntos de datos, etc.; (iv) archivos de ordenes para la creacion/verificacion/modificacion de las tablas de la K-base y de la I-base. El algoritmo para el procesamiento de datos (algoritmo 1) incluye las partes de aprendizaje y clasificacion.
• Aplicacion para el procesamiento de las pruebas de deteccion en el uso clmico de la PDU. Las funciones de esta aplicacion incluyen el entrenamiento con una gran cantidad de datos y la clasificacion sobre los datos reales de las pruebas de deteccion. La aplicacion puede ser de tipo escritorio, o una aplicacion web, e incluye: (i) interfaz de usuario para introducir/inspeccionar los datos de la I-base y para controlar la ejecucion de los algoritmos; (ii) procesamiento de los datos para el aprendizaje y/o la clasificacion de los datos del sujeto; (iii) archivos de ordenes para la creacion/verificacion/modificacion de las tablas de la K- base y de la I-base; estas tablas son diferentes de las de la aplicacion para el desarrollo de pruebas de deteccion. El algoritmo para el procesamiento de los datos (algoritmo 2), al igual que el algoritmo 1, incluye el aprendizaje y la clasificacion, que podran ser diferentes a los del algoritmo 1.
Tal y como se explica en detalle a continuacion en los ejemplos, la estrategia propuesta se valido mediante el analisis de los miRNA del plasma de pacientes con diferentes enfermedades de varios organos.
1. Sistema nervioso:
a) Trastorno cognitivo leve (TCL);
b) Enfermedad de Alzheimer (EA)
2. Aparato digestivo:
a) Cancer de esofago
b) Cancer gastrico
c) Cancer de colon
d) Enfermedad de Crohn
3. Aparato respiratorio:
a) Asma
b) Neumoma
c) Enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC)
d) Cancer de pulmon
Para la seleccion de los miRNA biomarcadores y normalizadores, se analizaron por RT-PCR las concentraciones en el plasma de muchos miRNA abundantes en los organos y sistemas de organos correspondientes. Los miRNA
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ubicuos y los miRNA expresados en numerosos organos, pero subexpresados en los organos de interes, tambien se analizaron como posibles normalizadores. Se les comprobo a todos los miRNA analizados en sus correspondientes organos o sistemas de organos su potencialidad como biomarcadores y normalizadores, y se seleccionaron como las mas prometedoras las combinaciones que proporcionaron una diferenciacion estadfsticamente significativa entre una enfermedad y los correspondientes controles.
Sistema nervioso
La deteccion precoz del trastorno cognitivo leve (TCL) y la enfermedad de Alzheimer (EA) se utilizo para validar la estrategia propuesta para el desarrollo de una prueba de deteccion para el sistema nervioso. La EA es la enfermedad neurodegenerativa mas frecuente, que comprende un gran grupo de enfermedades ocasionadas por cambios metabolicos de las celulas del cerebro, perdida de sinapsis y otros compartimentos de las neuronas y, finalmente, la muerte neuronal (para una revision, vease Neurodegenerative Diseases: From Molecular Concepts to Therapeutic Targets. Editores: R. von Bernhardi, N. C. Inestrosa, Nova Publishers, 2008). La EA se caracteriza por la retraccion de los axones, defectos en el transporte por el axon, disfuncion sinaptica, perdida de sinapsis y, finalmente, la muerte neuronal en varias zonas del cerebro espedficas de la enfermedad, tales como el hipocampo y la corteza (vease, p. ej., Crews, Masliah, Human Mol Gen., 2010, 19: R12-R20; Bredesen, Molecular Neurodegeneration 2009, 4: 27; Nimmrich y Ebert, Rev. Neurosci. 2009, 20: 1-12; Yoshiyama et al., Neuron. 2007, 53: 337-351; Wishartet et al., J. Neuropathol Exp. Neurol. 2006, 65: 733-739; Gylys et al., Neurochem Int. 2004, 44: 125-131; Conforti et al., Trends Neurosci. 2007. 30: 159-166; Revuelta et al. Am J. Alzheimers Dis Other Demen 2008, 23: 97-102).
La primera etapa sintomatica de la EA que se manifiesta con smtomas clmicos leves es el TCL, que se suele definir como un estado intermedio entre el envejecimiento normal y la demencia (DeCarli, Lancet Neurol., 2003, 2: 15-21; Stephan et al., Alzheimer's Res Therapy, 2009; 1: 1-9; Apostolova et al., Human Brain Mapping ,2010, 31: 786-797). El TCL es un smdrome heterogeneo que puede abocar en diferentes desenlaces. Hasta el 40% de los pacientes con un TCL revierten al estado normal (Larrieu et al., Neurology, 2002, 59: 1594-1599; Brooks, Loewenstein, Alzheimer's Res Therapy, 2010, 2: 28-36), y los estudios de autopsias demuestran que un porcentaje importante de pacientes con TCL no tienen indicios de EA (Jicha et al., Arch Neurol. 2006, 63: 674-681; Khan, Alkon, Neurobiol. Aging. 2010, 31: 889-900). Aproximadamente el 60% de los pacientes con TCL se convierten en demencia a un ritmo del 10% al 15% al ano (Petersen et al., Arch. Neurol. 2001, 58: 1985-1992; Apostolova et al., Human Brain Mapping, 2010, 31: 786-797). Aunque la EA sea la causa mas frecuente de demencia, a aproximadamente el 20% de los pacientes con TCL que progresan a demencia no se les diagnostica la EA, sino otras enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad vascular, cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y otras demencias (Jicha et al., Arch Neurol. 2006, 63: 674-681; Stephan et al., Alzheimer's Res Therapy, 2009, 1: 1-9).
Asf pues, la deteccion del TCL y de la EA mediante el analisis de los miRNA en circulacion apoya la idea de desarrollar una prueba espedfica del organo/sistema para diferentes enfermedades. Tal y como se explica en detalle en los ejemplos, para la seleccion de miRNA biomarcadores y normalizadores se analizaron por RT-PCR la concentracion de muchos miRNA abundantes en el cerebro, entre ellos los abundantes en axones y sinapsis, en el plasma de los pacientes con TCL y EA, y en el grupo de control emparejado por edades. Se comprobaron todos los miRNA seleccionados como posibles biomarcadores y normalizadores, y se identifico que las mas prometedoras eran las combinaciones que proporcionaron una diferenciacion estadfsticamente significativa entre los pacientes con TCL y los controles emparejados por edades. Los datos han demostrado que los posibles biomarcadores mas eficaces son los miRNA de los axones y las sinapsis, y que los normalizadores mas eficaces son otros miRNA abundantes en el cerebro, aunque tambien se pueden utilizar otros miRNA para la normalizacion. Dos familias de biomarcadores, la familia de miR-132 y la familia de miR-134, y varios normalizadores han mostrado la sensibilidad (84%-92%) y la especificidad (84%-90%) mas altas para la deteccion del TCL. La elevada correlacion entre los miembros de la familia de miR-134 se puede explicar con facilidad por el hecho de que todos los miembros de esta familia, a saber miR-134, miR-323-3p y miR-382, pertenecen al mismo agrupamiento y se expresan en los mismos tipos de celulas. No se habfa descrito antes la estrecha relacion entre los miembros de la familia de miR-132, a saber, miR-128, miR-132 y miR-874. Tambien es interesante que las familias de biomarcadores de miR-132 y miR- 134 producen los mejores resultados con diferentes normalizadores. La familia de miR-132 funciona mejor que la familia de miR-134 con los normalizadores miR-491-5p, miR-181a, miR-9 y miR-141. Por otra parte, la familia de miR-134 muestra mejores resultados que la familia de miR-132 con los normalizadores miR-370 y miR-127.
Asf pues, el smdrome heterogeneo de TCL y la EA se pueden detectar mediante el analisis de los miRNA abundantes en el cerebro que circulan fuera de las celulas en el plasma.
Ya que en las diferentes enfermedades neurodegenerativas estan implicadas diferentes regiones cerebrales que conducen al desarrollo de la demencia (Geldmacher y Whitehouse, Neurology. 1997, 48: S2-9, Levy y Chelune, J. Geriatr Psychiatry Neurol. 2007, 20: 227-238; Gong y Lippa, Am J. Alzheimer's Dis Other Demen, 2010, 25: 547-555) y debido a los diferentes perfiles de expresion de los miRNA en diferentes regiones cerebrales (Landgraf et al. Cell. 2007, 129: 1401-1414; The miR-Ontology Data Base:
http://ferrolab.dmi.unict.it/micro), el analisis de otro miRNA abundante en el cerebro sena util para diferenciar los cambios y los procesos ocasionados por diferentes enfermedades neuronales en el cerebro.
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Aparato digestivo
Las muestras de plasma de pacientes con canceres en los estadios 1 y 2 de tres organos digestivos (GI) (esofago, estomago y colon) y con la enfermedad de Crohn (una enfermedad inflamatoria del intestino que podna afectar a cualquier parte del tubo digestivo) se utilizaron para validar la estrategia propuesta para el desarrollo de una prueba de deteccion para el aparato digestivo. Se midio la concentracion en el plasma de los miRNA abundantes en el aparato digestivo o en determinados organos digestivos, p. ej., el miR-215, que es muy abundante en el colon y en el intestino delgado, y el miR-203, que es abundante en el esofago y en menor grado en el estomago, asf como del ubicuo miR-30e-3p. Se calculo la razon de todas las posibles parejas de miRNA para encontrar las combinaciones biomarcador/normalizador mas prometedoras. Los datos obtenidos han demostrado que miR-192, miR-194, miR-203 y miR-215 son los biomarcadores mas eficaces, y que miR-145, miR-148a y miR-30e-3p son los normalizadores mas eficaces. Las razones biomarcador/normalizador diferencian con eficacia entre los pacientes con todas las enfermedades estudiadas y los controles. El mR-203, que es muy abundante en el esofago y en el estomago, es especialmente eficaz a la hora de detectar un cancer de estos organos, y el miR-215, que es muy abundante en la columna, es mas eficaz a la hora de diferenciar a los pacientes con el cancer de colon y la enfermedad de Crohn de los controles. La combinacion de dos o mas razones biomarcador/normalizador se puede utilizar para incrementar la especificidad y la sensibilidad. Por ejemplo, los miR-192 y miR-203 normalizados por miR-30e-3p diferencian con eficacia entre los pacientes con todas las enfermedades del aparato digestivo y los controles, con una sensibilidad del 94% y una especificidad del 100%. Es importante que todos los tumores analizados esten en el estadio 1 o 2, lo que significa que la estrategia propuesta puede utilizarse con eficacia para la deteccion y el diagnostico precoz. A continuacion, se compararon con mayor detalle las parejas de diferentes canceres, asf como la enfermedad de Crohn frente a todos los canceres del aparato digestivo. Como resultado, se ha hallado que las siguientes razones biomarcador/normalizador son capaces de diferenciar enfermedades concretas:
1. Enfermedad de Crohn frente a los canceres de esofago, gastrico y colorrectal: miR-194/miR-148; miR- 215/miR-30e-3p; miR-215/miR-194; miR-203/miR-148a; miR-192/miR-203; miR-215/miR-203 y miR- 194/miR-192.
2. Cancer de esofago frente a cancer gastrico: miR-194/miR-145; miR-194/miR-148a; miR-194/miR-30e-3p.
3. Cancer de esofago frente a cancer colorrectal: miR-192/miR-145; miR-192/miR-148a; miR-192/miR-30e-3p.
4. Cancer gastrico frente a cancer colorrectal: miR-203/30e-3p; miR-203/miR-148a; miR-215/miR-203.
Asf pues, el analisis de la concentracion en el plasma que presentan los miRNA abundantes en los organos del aparato digestivo es eficaz para: (i) la deteccion de los tumores y afecciones inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn, en el esofago, estomago y colon; (ii) la diferenciacion entre una enfermedad inflamatoria y los canceres; (iii) la diferenciacion de los canceres localizados en diferentes organos del aparato digestivo.
Aparato respiratorio
Las muestras de plasma de pacientes con cuatro enfermedades, a saber, asma, neumoma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y carcinoma pulmonar no microcftico (CPNM, estadios 1 a 4) se utilizaron para validar la estrategia propuesta para el desarrollo de una prueba de deteccion para el aparato respiratorio. Ya que los pacientes que participan con asma y neumoma eran no fumadores, y que los pacientes con EPOC y CPNM eran fumadores, las muestras de plasma tambien se recogieron de dos grupos de control bien diferenciados: fumadores y no fumadores. Se midio la concentracion en el plasma de los miRNA abundantes en el pulmon y del miR-409-3p, que esta presente en muchos organos, pero que esta subexpresado en el pulmon. De nuevo, tal y como se describe mas arriba para el aparato digestivo, las razones de todas las posibles parejas de miRNA se calcularon para encontrar las combinaciones biomarcador/normalizador mas prometedoras.
Se ha encontrado que miR-34b y miR-486-5p, que son muy abundantes en el pulmon, son biomarcadores eficaces que se normalizaron por miR-409-3p para diferenciar los pacientes con asma y neumoma de los controles no fumadores, y los pacientes con EPOC y CPNM de los controles fumadores. Otros normalizadores eficaces son miR- 142-5p, miR-146b-5p, miR-155 y miR-223, abundantes en el pulmon, posiblemente debido a que estan reprimidos en las enfermedades de pulmon (Liu X. et al., Clin. Cancer Res. 2009, 15; 1177-1183; Miko E. et al., Exp. Lung Res. 2009, 35: 646-664; Halappanavar S. et al. Toxicology 2011, 285: 133-141; Heegaard N. H. et al., Int. J. Cancer, 2012, 130; 1378-1386). De modo inesperado, el miR-192 tambien se comporto como un biomarcador eficaz para las enfermedades pulmonares. Ya que tambien se demostro que este miRNA era un biomarcador eficaz para las enfermedades del aparato digestivo, es razonable sugerir que la expresion y/o secrecion de miR-192 se incrementa debido a la inflamacion o a los procesos de desarrollo de los tumores (Benjamin H. et al., J. Mol. Diagn. 2010, 12: 771-779; Lan H. Y. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 28 de diciembre de 2011 [Epub anterior a la version impresa]; Luzna P. et al. Diagn. Pathol. 2011, 6: 114; Wu Q. et al. J. Biomed. Biotechnol. 2011, Epub, 26 de mayo; Zhou J. et al., J. Clin. Oncol. 2011,29: 4781-4788).
Ya que las razones miRNA biomarcador / miRNA normalizador no eran diferentes para los controles de fumadores y de no fumadores, las cuatro enfermedades se compararon con los controles combinados (sujetos fumadores y no
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fumadores). Los datos obtenidos demuestran que los pacientes con las cuatro enfermedades analizadas se pueden diferenciar con eficacia de tales controles combinados mediante diferentes conjuntos de miRNA biomarcadores y normalizadores, p. ej., miR-34b normalizado por miR-409-3p, miR-486-5p normalizado por miR-223, o miR-192 normalizado por miR-155. Tambien ha^a otros conjuntos eficaces de miRNA biomarcadores y normalizadores.
Tambien se analizo la capacidad que tienen diferentes combinaciones de miRNA biomarcadores y normalizadores para diferenciar entre el CPNM y las enfermedades inflamatorias tales como asma, neumoma y EPOC. Los resultados demostraron que los pacientes con CPNM se diferenciaban con eficacia de los pacientes con enfermedades inflamatorias mediante el uso de las razones de miR-34b por miR-155, de miR-486-5p por miR-146b- 5p o por miR-142-5p, de miR-192 por miR-146b-5p. Habfa otras combinaciones eficaces de miRNA biomarcadores y normalizadores.
Asf pues, las enfermedades del aparato respiratorio se pueden detectar con eficacia mediante el analisis de los miRNA acelulares en circulacion por el plasma, si los miRNA abundantes en el pulmon se utilizan como biomarcadores o normalizadores, o ambos. Algunas combinaciones de biomarcador/normalizador tambien pueden diferenciar con eficacia entre los pacientes con cancer y los pacientes con enfermedades pulmonares inflamatorias.
Distincion de enfermedades en diferentes sistemas de organos
Para validar la idea de que una prueba basada en el analisis de los lfquidos corporales en busca de miRNA abundantes en un organo es capaz de detectar los sujetos con una enfermedad de un determinado sistema de organos, es necesario demostrar que hay combinaciones de miRNA capaces de diferenciar las enfermedades de diferentes sistemas de organos. Tal y como se describe en detalle en los ejemplos, los miRNA se purificaron de las muestras de plasma obtenidas de los pacientes con enfermedades del aparato digestivo (enfermedad de Crohn y cancer de esofago, gastrico y colorrectal) y del aparato respiratorio (asma, neumoma, EPOC y CPNM). Se analizo la concentracion de los miRNA abundantes en el pulmon y abundantes en el aparato digestivo, asf como varios miRNA, implicados en procesos patologicos de diferentes organos. Ademas, en el estudio se incluyeron como posibles normalizadores los ubicuos miR-30e-3p y miR-409-3p. La concentracion de cada miRNA se normalizo por miR-30e- 3p y miR-409-3p, asf como entre ellos, se convirtio en la cantidad relativa (CR) del miRNA de acuerdo con el protocolo de ABI (2-aCt), y se compararon los perfiles caractensticos de los miRNA de los pacientes con las enfermedades de los aparatos respiratorio y digestivo. Los datos demostraron que muchas parejas de miRNA diferenciaban con eficacia los pacientes con enfermedades de los aparatos respiratorio y digestivo: miR-192/miR- 126; miR-155/miR-126; miR-l45/miR-126; miR-155/miR-30e-3p; miR-192/miR-30e-3p; miR-155/miR-409-3p; miR- 486-5p/miR-17-5p; miR-155/miR-17-5p; miR-192/miR-17-5p; miR-146b-5p/miR-31; miR-155/miR-31; miR-l92/miR- 31; miR-486-5p/miR-155; miR-192/miR-155; miR-145/miR-155; miR-146b-5p/miR-155; 486-5p/miR-203; miR- 192/miR-203; miR-145/miR-203; miR-192/miR-215; miR-155/miR-215. La combinacion de dos parejas de miRNA incrementa la exactitud de la prueba. Por ejemplo, la combinacion de las razones miR-145/miR-155 y miR-486- 5p/miR-155 diferencio los pacientes con todas las enfermedades del aparato digestivo entre los pacientes con enfermedades pulmonares con una sensibilidad del 95%, especificidad del 90% y exactitud del 93%.
Distincion de diferentes enfermedades en distintos sistemas de organos
Debido a los cambios caractensticos de la expresion y de la secrecion de algunos miRNA durante las enfermedades inflamatorias y el desarrollo del cancer en diferentes organos, se planteo que el analisis de su concentracion en los lfquidos corporales se podna utilizar para diferenciar entre estas enfermedades. Se utilizaron las mismas muestras plasmaticas para la purificacion de los miRNA y se analizaron los mismos miRNA que se describieron en el apartado anterior. En este estudio, se analizo la capacidad que tienen las diferentes combinaciones de miRNA para diferenciar entre los pacientes con enfermedades inflamatorias (asma, neumoma, EPOC y enfermedad de Crohn) y los pacientes con diferentes canceres (de esofago, gastrico, colorrectal y pulmonar no microcftico). Los datos demuestran que varias parejas de miRNA diferencian con eficacia entre los pacientes con enfermedades inflamatorias y los pacientes con cancer: miR-17-5p/miR-155; miR-192/miR-155; miR-215/miR-155; miR-146b- 5p/miR-155; miR-192/miR-30e; miR-146b-5p/miR-30e-3p; miR-155/miR-30e-3p. Hay menos parejas de miRNA que diferencian entre las enfermedades inflamatorias y los canceres que las parejas de miRNA capaces de diferenciar entre las enfermedades del aparato respiratorio y las enfermedades del aparato digestivo. Primero, los cambios de expresion de muchos miRNA son caractensticos de ambos tipos de enfermedad. Segundo, en muchos casos, la carcinogenia viene acompanada por una inflamacion relativamente prominente. La combinacion de dos parejas de miRNA incrementa la exactitud de la prueba. Por ejemplo, la combinacion de las razones miR-146b-5p/miR-155 y miR-146b-5p/miR-30e-3p distinguio todos los pacientes con enfermedades inflamatorias entre los pacientes con cancer con una sensibilidad del 80%, especificidad del 98% y exactitud del 89%.
Asf pues, los resultados de los experimentos presentados en la presente invencion apoyan sus principales ideas. El analisis de la concentracion en el plasma que presentan los miRNA abundantes en un sistema de organos o en un organo determinados, diferencia entre: (i) las enfermedades del sistema de organos y los controles; (ii) las enfermedades de tres organos del aparato digestivo; (iii) las enfermedades del aparato respiratorio y digestivo; (iv) los canceres y las enfermedades inflamatorias.
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Kits
Junto con los metodos diagnosticos y de deteccion de mas arriba, la presente descripcion da a conocer diferentes kits que comprenden uno o varios conjuntos de cebadores y/o sondas espedficos para la deteccion del miRNA deseado. Tales kits pueden ademas incluir conjuntos de cebadores y/o sondas espedficos para la deteccion del miRNA normalizador. Las combinaciones de cebadores o sondas de los kits se pueden basar, por ejemplo, en diferentes combinaciones de las moleculas recogidas en las tablas 1 a 11.
Tales kits pueden ser utiles para dirigir la deteccion de los miRNA en las muestras de lfquidos corporales aislados de los pacientes o se pueden utilizar en las muestras de ARN purificado.
Un kit de la descripcion tambien da a conocer reactantes para la extension de cebadores y para las reacciones de amplificacion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el kit podna ademas incluir uno o varios de los siguientes componentes: una enzima retrotranscriptasa, una enzima aDn polimerasa (tal como, p. ej., una ADN polimerasa termoestable), un tampon para la reaccion en cadena de la polimerasa, un tampon para la retrotranscripcion y trifosfatos de desoxinucleosidos (dNTP). Como alternativa (o ademas), un kit puede incluir reactantes para realizar un ensayo de hibridacion. Los agentes de deteccion pueden incluir analogos de nucleotidos y/o un resto de marcacion, p. ej., un resto detectable directamente, tal como un fluoroforo (fluorocromo) o un isotopo radiactivo, o un resto detectable de forma indirecta, tal como un miembro de una pareja de fijacion, tal como biotina, o una enzima capaz de catalizar una reaccion colorimetrica o luminometrica insoluble. Ademas, el kit podna ademas incluir al menos un envase que contiene reactivos para detectar acidos nucleicos en electroforesis. Tales reactivos incluyen los que detectan directamente acidos nucleicos, tales como un agente intercalante fluorescente o reactivos de tincion con plata, o los reactivos encargados de detectar acidos nucleicos marcados, tales como, pero sin limitarse a ellos, reactivos de ECL. Un kit puede ademas incluir medios de aislamiento o purificacion de miRNA, asf como controles negativos y positivos. Un kit tambien puede incluir una advertencia asociada a el en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de los kits para diagnostico. Tambien podnan venir con el kit las instrucciones detalladas para el uso, conservacion y solucion de problemas. Un kit tambien se puede dar a conocer opcionalmente en una carcasa adecuada que es preferiblemente util para la manipulacion robotizada en un contexto de altas prestaciones.
Los componentes del kit se podnan dar a conocer como polvos secos. Cuando los reactivos y/o componentes se dan a conocer como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir por la adicion de un solvente idoneo. Se contempla que el solvente tambien se puede dar a conocer en otro envase. El envase incluira por lo general al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringuilla y/u otros medios de contencion en los que se coloca el solvente, opcionalmente distribuido en alfcuotas. Los kits tambien podnan comprender un segundo envase que contenga un tampon farmaceuticamente aceptable y esteril y/u otro solvente.
Cuando hay mas de un componente en el kit, el kit tambien contendra por lo general un segundo, tercero o mas envases adicionales dentro de los que se podnan colocar por separado los componentes adicionales. Sin embargo, diferentes combinaciones de componentes podnan estar comprendidos en un envase.
Tales kits tambien podnan incluir componentes que conservan o mantienen el ADN o el ARN, tales como reactantes que protegen de la degradacion a los acidos nucleicos. Tales componentes podnan estar, por ejemplo, libres de nucleasas o ARNasas, o proteger de las ARNasas. Cualquiera de las composiciones o reactantes descritos en la presente memoria podnan ser componentes en un kit.
Definiciones
El termino «prueba de deteccion» se utiliza en la presente memoria para referirse a una prueba que se utiliza para la deteccion precoz de una enfermedad, preferiblemente antes de su manifestacion clmica. En la presente memoria se describen principalmente dos tipos de pruebas de deteccion: (i) las pruebas de deteccion que detectan una enfermedad en un sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula determinado, y (ii) las pruebas de deteccion que detectan cambios patologicos generales concretos, tales como, p. ej., hipoxia, inflamacion o carcinogenia, pero que no localizan esta enfermedad en un sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula determinado. La terminologfa «prueba de deteccion universal (PDU)» se refiere a una o a las dos pruebas de deteccion mencionadas mas arriba.
La terminologfa «sistema de organos» se refiere a un grupo de organos relacionados que trabajan juntos para desempenar una determinada tarea. Por ejemplo, esofago, estomago, duodeno, intestino delgado e intestino grueso son organos del aparato digestivo. Las glandulas salivales, el pancreas y el hugado son tambien componentes del aparato digestivo. Al mismo tiempo, los islotes p del pancreas, que secretan hormonas, tambien estan relacionados con el sistema endocrino.
Dentro del significado de la presente invencion, la terminologfa «miRNA abundante en organo/tejido/tipo de celula» se refiere a todo miRNA que esta presente en mayor cantidad (p. ej., concentraciones al menos 5 veces mas altas) en un organo, tejido o tipo de celula correspondiente, en comparacion con otros organos, tejidos o tipos de celula, y puede ser una fuente de cantidades detectables del miRNA en un lfquido corporal que hay que analizar. La terminologfa «miRNA abundante en el sistema de organos» se refiere a todo miRNA que esta presente en mayor
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cantidad (p. ej., concentraciones al menos 5 veces mas altas) en todos, o al menos varios, organos del correspondiente sistema de organos, en comparacion con otros sistemas de organos, organos, tejidos o tipos de celulas, y puede ser una fuente de cantidades detectables de miRNA en un Kquido corporal que hay que analizar. Para ser util en los metodos para diagnostico de la presente invencion, tales miRNA abundantes en el sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula deben ser detectables en los lfquidos corporales como resultado de su liberacion desde las celulas y de su transporte a dichos lfquidos corporales.
El termino «una enfermedad» se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a una enfermedad inespedfica que implica cambios metabolicos y/o estructurales en un organo, tejido o tipo de celula correspondiente que esta asociado a su disfuncion y/o destruccion parcial y/o perdida. El termino «asociado a» se utiliza para abarcar cualquier correlacion, concomitancia y cualquier relacion de causa y efecto.
Los terminos «micro-ARN» o «miRNA», tal y como se utilizan en la presente memoria, hacen referencia a una clase de moleculas de ARN, maduras, no codificantes y de tan solo aproximadamente 22 nt de largo. Desempenan funciones importantes en la regulacion de sus genes diana mediante la fijacion a regiones complementarias de los mensajeros transcritos (ARNm) para reprimir su traduccion y regular su degradacion (Griffiths-Jones, Nucleic Acids Research, 2006, 34, numero de bases de datos: D140-D144). Con frecuencia, un miRNA puede actuar selectivamente sobre muchos ARNm y un ARNm puede estar regulado en varias regiones diferentes de la UTR en 3' sobre las que actuan selectivamente los miRNA. Una vez fijado a un ARNm, un miRNA puede modular la expresion del gen y la produccion de la protema al afectar, p. ej., a la traduccion y estabilidad del ARNm (Back et al., Nature 455 (7209): 64 (2008); Selbach et al., Nature 455 (7209): 58 (2008); Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355: Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research, 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; y Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28). Ejemplos de miRNA abundantes en organo/tejido/celula de utilidad para los metodos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, los miRNA recogidos en la tabla 1. Los ejemplos de miRNA abundantes en sistemas de organos que resultan para los metodos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, los miRNA recogidos en la tabla 2, columna 2. Los ejemplos del miRNA abundantes en organo/tejido/tipo de celula que resultan para la localizacion mas precisa de una enfermedad en los metodos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, los miRNA recogidos en la tabla 2, columna 3.
La informacion mas actual sobre los miRNA conocidos se puede hallar en la base de datos de miRNA miRBase (disponible por la web en mirbase.org). Vease tambien Burside et al., BMC Genomics 9: 185 (2008); Williams et al., BMC Genomics 8: 172 (2007); Landgraf et al., Cell 129: 1401 (2007).
El termino «matriz de miRNA», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una tecnologfa multiplex utilizada en la biologfa molecular y en la medicina. Consiste en una serie ordenada de varias (p. ej., miles) impresiones microscopicas de oligonucleotidos, cada una con una secuencia espedfica (sonda) complementaria a un miRNA diana determinado. Despues de la hibridacion entre la sonda y la diana en condiciones muy rigurosas, los dbridos resultantes se suelen detectar y cuantificar mediante la cuantificacion de las dianas marcadas con fluoroforos, plata o quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa del miRNA. En los metodos de la presente invencion se pueden utilizar tanto las matrices de miRNA disponibles en el mercado como las fabricadas por encargo. Los ejemplos no limitantes de matrices de miRNA utiles y disponibles en el mercado (basadas en diferentes metodos de marcacion de dianas, deteccion de hfbridos y analisis) incluyen las matrices producidas por Agilent, Illumina, Exiqon, Invitrogen, Febit y LC Sciences.
La terminologfa «tecnologfas de secuenciacion de nueva generacion», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia en lmeas generales a los metodos de secuenciacion en los que se generan muchas reacciones de secuenciacion en paralelo. Esto permite un enorme incremento de la produccion y rendimiento de los datos. Los ejemplos no limitantes de las plataformas de secuenciacion de nueva generacion que se utilizan con frecuencia incluyen la secuenciacion de ARN pequenos de Helicos, miRNA BeadArray (Illumina), Roche 454 (FLX-Titanium) y ABI SOLiD.
Un «individuo» o «sujeto» o «animal», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a humanos, animales veterinarios (p. ej., gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc.) y modelos de animales experimentales de enfermedades neurodegenerativas u otras enfermedades neuronales (veanse los ejemplos que apareceran mas adelante). En una realizacion preferida, el sujeto es un humano.
El termino «vfas urinarias» hace referencia a los organos y conductos que participan en la secrecion y eliminacion de la orina del cuerpo.
El termino «purificado», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un material que se ha aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales sin relacion, a saber, contaminantes, que incluyen materiales nativos de los cuales se obtiene el material. Por ejemplo, la purificacion del ARN incluye la eliminacion de protemas, lfpidos, sales y otros compuestos sin relacion presentes en los lfquidos corporales.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminologfa «sustancialmente libre» se utiliza operativamente en el contexto de las pruebas analtticas del material. Preferiblemente, el material purificado sustancialmente libre de contaminantes es puro al menos al 50%; mas preferiblemente, puro al menos al 90%; y aun mas preferiblemente
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puro al menos al 99%. La pureza se puede evaluar por cromatograffa, electroforesis en gel, analisis de la composicion, ensayo biologico y otros metodos conocidos en la tecnica.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminologfa «procesado de la misma forma» hace referencia a que las muestras (p. ej., muestras de lfquidos corporales o ARN purificados) se han obtenido con el mismo protocolo.
La terminologfa «una concentracion de control», tal y como se utiliza en la presente memoria, abarca estandares predeterminados (p. ej., un valor publicado en una referencia), asf como las concentraciones determinadas experimentalmente en muestras de sujetos de control procesadas de la misma forma (p. ej., sujetos sanos emparejados por edad y sexo). Ya que en la presente invencion se describen las pruebas de deteccion que se pueden realizar para el mismo paciente de forma periodica, los datos previos del mismo individuo se pueden utilizar como una «concentracion de control».
Para distinguir entre dos enfermedades, tales como el cancer y la inflamacion, o el cancer de esofago y el cancer colorrectal, las razones de las concentraciones de los miRNA en el plasma no se compararan con las razones de los controles determinados previamente, sino con los margenes ya determinados de las razones de las concentraciones de los miRNA en el plasma, que son caractensticas de las enfermedades correspondientes. Para definir estas razones, se incorporaran varios cientos de pacientes y las concentraciones de los miRNA de interes se mediran en las muestras de los plasmas. A continuacion, se calcularan las razones de las concentraciones de diferentes parejas de miRNA, lo que proporcionara el margen de razones caractenstico de la correspondiente enfermedad y que cubrira, por ejemplo, del 100%, 99% o 95% de los casos de la enfermedad. El margen predeterminado utilizado en el contexto clmico real se determinara segun las necesidades de sensibilidad y especificidad de la prueba.
La terminologfa «unos» o «aproximadamente» significa que esta dentro de un margen estadfsticamente significativo de un valor. Tal margen puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50%, mas preferiblemente dentro del 20%, aun mas preferiblemente dentro del 10%, e incluso mas preferiblemente dentro del 5%, de un valor o margen dados. La variacion permitida abarcada por el termino «unos» o «aproximadamente» depende del sistema concreto en estudio, y el experto en la tecnica lo apreciara con facilidad.
De acuerdo con la presente invencion, se pueden emplear tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa y ADN recombinante dentro de la metodologfa de la tecnica. Tales tecnicas se explican en detalle en la bibliograffa. Vease, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (en la presente memoria «Sambrook et al., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, volumenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames y S. J. Higgings eds. (1985)]; Transcription and Translation [B. D. Hames y S, J. Higgings, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney. ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel, F. M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. 1994. Estas tecnicas incluyen la mutagenesis dirigida espedfica de sitio, tal y como se describe en Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985), patente de los EE. UU. n.° 5.071.743, Fukuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim y Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh y Guengerich, BioTech. 24: 428-431 (1998); Ray y Nickoloff, BioTech, 13: 342346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang y Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu y Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), patentes de los EE. UU. n.os 5.789.166 y 5.932.419, Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001), patentes de los EE. UU. n.os 5.702.931, 5.780.270 y 6.242.222, Angag y Schutz, BioTech. 30: 486-488 (2001), Wang y Wilkinson, BioTech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel y McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch y Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem y Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996), Boles y Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995), Barrenttino et al., Nucl. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier y Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237, y Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218.
El termino «datos etiquetados» utilizado para el conjunto de datos de entrenamiento se refiere a los resultados de analisis obtenidos en las muestras clmicas de personas con un diagnostico conocido. Por ejemplo, para los datos etiquetados para los miRNA con destino en el hfgado, los datos se deben recoger de personas con enfermedades hepaticas (etiqueta «l"ngado» y, p. ej., «hepatitis» o «carcinoma hepatocelular») y sin ninguna enfermedad hepatica (etiqueta «control»).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el termino «conjunto de datos» se refiere a un conjunto de miRNA (biomarcadores) seleccionados para detectar una enfermedad en un sistema de organos/organo/tejido/tipo de celula determinado. Cada conjunto de datos comprende al menos un biomarcador, pero tfpicamente mas biomarcadores, y algunos biomarcadores son miembros de mas de un conjunto de datos.
El termino «K-base» se refiere a una base de datos que contiene el conocimiento sobre todos los tipos de pruebas de deteccion y sus componentes. La informacion se agrupa en el conjunto de tablas independientes, tales como:
• lista de todas las pruebas de deteccion desarrolladas hasta la fecha;
• lista de todas las enfermedades cubiertas por esas pruebas;
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• lista de los miRNA utilizados (y que se supone que podran usar);
• lista de conjuntos de datos para todas las pruebas de deteccion;
• relaciones entre el tipo de pruebas de deteccion, los conjuntos de datos y los miRNA;
• tablas que contienen constantes de cada miRNA utilizado en los correspondientes conjuntos de datos.
Estas tablas se han de rellenar en la etapa de aprendizaje de los algoritmos y utilizarse para los calculos en la parte de clasificacion del algoritmo.
Esta base de datos se modifica y se expande con la llegada de nuevos datos de investigacion verificados.
El termino «I-base» se refiere a una base de datos que contienen datos reales de las pruebas de deteccion en los individuos, que incluye listas de sujetos e informacion relevante, historia de las pruebas de deteccion, sus datos brutos y los resultados procesados, etc.
Ambas bases de datos, junto con los programas y los algoritmos que se implementan para el aprendizaje y la clasificacion, son parte de la presente invencion.
El termino «iteracion» se utiliza en la descripcion del algoritmo. Se refiere al cuerpo del bucle de programacion, que se ejecuta de forma dclica.
Ejemplos
La presente invencion tambien se describe y se demuestra por medio de los ejemplos que vienen a continuacion. Sin embargo, el uso de estos y otros ejemplos en cualquier parte de la especificacion solo es con fines ilustrativos y en ningun modo limita el alcance ni el significado de la invencion ni de cualquier termino de ejemplo. Asimismo, la invencion no se limita a ninguna realizacion preferida concreta que se describa aqrn. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invencion podnan resultar evidentes para los expertos en la tecnica despues de leer esta especificacion, y tales variaciones se pueden realizar sin alejarse del espmtu ni del alcance de la invencion. Por lo tanto, la invencion esta limitada solo mediante los terminos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance total de las equivalencias que estas reivindicaciones tendran derecho a exigir.
Ejemplo 1: comparacion de los diferentes metodos utilizados para la purificacion de los miRNA desde el suero y desde el plasma
Hay muchos kits comerciales para aislar los miRNA, entre ellos el kit miRNeasy (Qiagen), el kit de aislamiento de ARN MirVana (Ambion/ABI), miRACLE (Agilent), kit de aislamiento del miRNA High Pure (Roche) y kit de purificacion de miRNA (Norgen Biotek Corp.). Ademas, se utilizan con frecuencia las tecnicas de uso interno basadas en el empleo de Trizol (Invitrogen). Despues de la desproteinizacion con Trizol, se precipita el ARN con alcohol isopropflico o se purifica adicionalmente en columnas de sflice. En algunos experimentos, el ARN purificado se trata con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, ABI, Invitrogen u otro). Las preparaciones de miRNA obtenidas mediante diferentes metodos se comparan por RT-PCR.
El miRNA se purifico de muestras de plasma y de suero obtenidas de los mismos 5 donantes sanos. Se enriquecieron con 107 copias del miR-159a de Arabidopsis thaliana (ath-miR-159a) por cada mililitro de plasma o de suero despues de anadir una solucion que contiene guanidina para evaluar el rendimiento de los miRNA. Se compararon dos tecnicas, una basada en el kit Pans MirVana (Ambion/ABI) y la otra basada en la desproteinizacion con Trizol (Invitrogen) y la posterior purificacion en columnas de sflice. Despues de la purificacion del ARN, se midio la concentracion del miRNA enriquecido y de miR-9, miR-16 y miR-134, endogenos de humano, en las preparaciones finales por RT-PCR. El kit Paris MirVana fue mas eficaz a la hora de aislar el miRNA que la tecnica basada en Trizol y se selecciono para futuros experimentos. Aunque todos los miRNA analizados eran detectables en el suero y en el plasma, y ambos tipos de muestras eran idoneas para las pruebas de miRNA, los valores de Ct finales de la PCR eran aproximadamente 2 ciclos mas bajos para el plasma, y esto ultimo se utilizo para los posteriores experimentos. Basandose en la medicion cuantitativa del enriquecimiento en ath-miR-159a, la produccion media de miRNA aislados del plasma con el kit MirVana era el 71,4%.
Ejemplo 2: Seleccion de los miRNA para la prueba
Los posibles miRNA biomarcadores (tabla 1) se seleccionaron inicialmente basandose en los datos de la bibliograffa sobre su abundancia en diferentes organos y tejidos (vease, p. ej., Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics, 2007, 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA, 2008, 14: 35-42;
http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/;
http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir. A continuacion, los miRNA comunes de varios organos del mismo sistema de organos se seleccionaron como posibles biomarcadores para el correspondiente sistema (tabla 2, columna 2). Los miRNA que son abundantes en un organo, pero no en otros organos del sistema, se identificaron como posibles biomarcadores para una localizacion mas precisa de la
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enfermedad (tabla 2, columna 3). Para la normalizacion, ademas del miRNA no humano sintetico enriquecido, p. ej., ath-miR-159a, y los miRNA ubicuos, tal como miR-16 y miR-30e-3p, se seleccionaron los miRNA expresados en numerosos tejidos, pero no en un tejido deseado. Por ejemplo, miR-10b y miR-141 se pueden utilizar para normalizar los biomarcadores del cerebro y miR-409-3p para los biomarcadores del aparato respiratorio, etc. Se seleccionaron experimentalmente otros normalizadores prometedores, que son abundantes en los tejidos, organos y sistemas analizados.
Todos estos biomarcadores tienen que incluirse como un correspondiente conjunto de datos en la K-base, segun se describe en el ejemplo 8, mas adelante.
Ejemplo 3: Deteccion de un incremento de la concentracion de los miRNA abundantes en el cerebro en el suero/plasma de los pacientes diagnosticados con enfermedades neurologicas
En el estudio se utilizaron muestras de plasma de pacientes amnesicos con TLC y EA, y CEE, 20 en cada grupo. El ARN se aislo de dos alfcuotas de 200 pl de muestras de plasma mediante el metodo de Trizol-sflice de acuerdo con el procedimiento de Asuragen. La qRT-PCR de una sola diana se realizo con el kit de retrotranscripcion TaqMan® y los cebadores ahorquillados (Applied Biosystems) espedficos de los miRNA. La etapa de RT se realizo por triplicado y en la PCR final estaban presentes 2 pl equivalentes del plasma.
Los datos presentados en las figuras 1 a 6 demuestran el incremento de 2 a 5 veces de la mediana de la concentracion de los miRNA de los axones y de las sinapsis (miR-7, miR-125b, miR-128, miR-132, miR-134, miR- 323-3p, miR-382, miR-874) en el plasma de pacientes con TLC y EA cuando se compararon con los controles emparejados por edad. El efecto es mas prominente cuando la normalizacion se realiza por un miRNA abundante en el cerebro, tal como miR-9, miR-127, miR-181a, miR-370 y miR-491-5p.
Dos familias de biomarcadores, las familias de miR-132 y miR-134, y varios normalizadores han mostrado la sensibilidad y especificidad mas altas. Las curvas de eficacia diagnostica (ROC) para estas combinaciones de biomarcadores y un normalizador se presentan en las figuras 7A-C y 8A-C. Los biomarcadores miR-128, miR-132 y miR-874 («familia de miR-132») mostraron una sensibilidad del 84 al 92% y una especificidad del 84 al 90% cuando se normalizaron por miR-491-5p. El area bajo la curva (ABC) ROC para miR-128, miR-132 y miR-874 es de 0,95, 0,93 y 0,95, respectivamente. El segundo conjunto prometedor de biomarcadores consiste en miR-134, miR-323-3p y miR-382 («familia de miR-134») y muestra una sensibilidad del 78% al 91% y una especificidad del 85% al 87% cuando se normalizo por miR-370. El ABC para miR-134, miR-323-3p y miR-382 es de 0,91, 0,94 y 0,92, respectivamente.
El analisis de correlacion mostrado en las figuras 9A-F demuestra que miR-128, miR-132 y miR-874 forman una familia de biomarcadores (los valores r de la prueba de Spearman en la comparacion por parejas estan en el margen de 0,93 a 0,95) y miR-134, miR-323-p y miR-382 forman otra familia de biomarcadores (los valores r de la prueba de Spearman en la comparacion por parejas estan en el margen de 0,87 a 0,93). La alta correlacion entre los miembros de la familia de miR-134 se puede explicar con facilidad por el hecho de que todos los miembros de esta familia, a saber, miR-134, miR-323-3p y miR-382, pertenecen al mismo agrupamiento y se expresan en los mismos tipos de celulas (
http://www.diana.pcbi.upebnn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Cluster.cgi). La estrecha relacion entre los miembros de la familia de miR-132, a saber, miR-128, miR-132 y miR-874, no se habfa descrito antes. Es tambien interesante que las familias de biomarcadores miR-132 y miR-134 producen los mejores resultados con diferentes normalizadores. La familia de miR-132 funciona mejor que la familia de miR-134 con los normalizadores miR-491-5p, miR-181a, miR-9 y miR-141. Por otra parte, la familia de miR-134 muestra mejores resultados que la familia de miR- 132 con los normalizadores miR-370 y miR-127. La correlacion entre las familias de biomarcadores de miR-132 y de miR-134 es relativamente baja (los valores de r en la prueba de Spearman de la comparacion por parejas estan en el margen de 0,56 a 0,79), lo que indica que reflejan diferentes procesos patologicos, o bien que estan localizados en diferentes areas del cerebro.
Ejemplo 4: Deteccion de un incremento de la concentracion de los miRNA abundantes en el pulmon en el suero/plasma de pacientes con enfermedades pulmonares
Las muestras de plasma se obtuvieron de pacientes a los que se les diagnostico diferentes enfermedades pulmonares, tales como asma, neumoma, enfermedad obstructiva pulmonar cronica (EPOC) y carcinoma pulmonar no microcftico (CPNM), 10 en cada grupo. Ya que los pacientes participates que sufnan asma y neumoma no eran fumadores y los pacientes con EPOC y CPNM eran fumadores, tambien se recogieron muestras de plasma de dos grupos de control, fumadores y no fumadores, 10 en cada grupo. El ARN se aislo de dos alfcuotas de 200 pl de las muestras de plasma mediante el metodo de Trizol-sflice de acuerdo con el procedimiento de Asuragen. La qRT-PCR de una sola diana se realizo con el kit de retrotranscripcion TaqMan® y los cebadores ahorquillados espedficos del miRNA (Applied Biosystems). La etapa de RT se realizo por triplicado y en la PCR final estaban presentes 2 pl equivalentes del plasma para medir la concentracion de miR-34b, miR-142-5p, miR-146-5p, miR-155, miR-223, miR- 486-5p, abundantes en el pulmon, asf como la concentracion de miR-192 y miR-409-3p ubicuos y abundantes en el aparato digestivo. Los ultimos son esencialmente ubicuos, pero estan subexpresados en el pulmon. La concentracion de cada miRNA abundante en el pulmon se normalizo por miR-409-3p y miR-192, asf como entre sf,
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se convirtieron en la cantidad relativa (CR) de miRNA de acuerdo con el protocolo ABI (2 act) y se compararon con los perfiles de miRNA de los controles.
Tal y como se esperaba, se encontro que miR-34b y miR-486-5p, que son muy abundantes en el pulmon, son biomarcadores eficaces, y que miR-409-3p es un normalizador eficaz (figura 10A-D). Otros normalizadores eficaces que abundan en el pulmon son miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155 y miR-223 (figuras 11A-H y 12A-H) lo que, al menos en algunos casos, se podna explicar por su represion en las enfermedades pulmonares (Liu X. et al. Clin. Cancer Res. 2009, 15: 1177-1183; Miko E. et al., Exp. Lung Res. 2009, 35: 646-664; Halappanavar S. et al. Toxicology 2011, 285: 133-141; Heegaard NH et al. Int. J. Cancer, 2012, 130: 1378-1386). Inesperadamente, el miR- 192 tambien se comporto como un biomarcador eficaz (figura 13A-J). Ya que este miRNA tambien se demostro que era un biomarcador para las enfermedades del aparato digestivo, resulta razonable sugerir que se incrementa la expresion y/o secrecion de este miRNA debido a la inflamacion o al desarrollo de tumores (Benjamin H. et al., J. Mol. Diagn. 2010, 12: 771-779; Lan H. Y. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 28 de diciembre de 2011 [Epub anterior a la version impresa]; Luzna P. et al. Diagn. Pathol. 2011, 6: 114; Wu Q. et al. J. Biomed. Biotechnol. 2011, Epub, 26 de mayo; Zhou J. et al., J. Clin. Oncol. 2011, 29: 4781-4788).
Las razones miRNA biomarcador/miRNA normalizador no eran diferentes para los controles de fumadores y de no fumadores. Asf pues, se pudieron comparar diferentes enfermedades con los controles combinados (sujetos fumadores y no fumadores). La figura 14A-C muestra que las cuatro enfermedades analizadas se diferencian con eficacia de tales controles combinados mediante diferentes conjuntos de miRNA biomarcadores y normalizadores, p. ej., miR-34b normalizado por miR-409-3p, miR-486-5p normalizado por miR-223 o miR-192 normalizado por miR- 155. Tambien habfa otros conjuntos eficaces de miRNA biomarcadores y normalizadores.
Tambien se analizo la capacidad que tienen diferentes combinaciones de miRNA biomarcadores y normalizadores para diferenciar entre el CPNM y las enfermedades inflamatorias, tales como el asma, la neumoma y la EPOC. La figura 15A-C muestra que los pacientes con CPNM se diferencian de los pacientes con enfermedades inflamatorias gracias al uso de las razones de miR-34b por miR-155, miR-486-5p por miR-146b-5p o miR-192 por miR-146b-5p. Habfa otras combinaciones eficaces de miRNA biomarcadores y normalizadores.
Ejemplo 5: Deteccion de un incremento de la cantidad de los miRNA abundantes en el aparato digestivo en el suero y plasma de pacientes con enfermedades del aparato digestivo
Las muestras de plasma se obtuvieron de pacientes a los que se les diagnostico diferentes enfermedades del aparato digestivo, tales como el cancer de esofago, gastrico y de colon, y una afeccion inflamatoria, la enfermedad de Crohn, 10 en cada grupo. El ARN se aislo de dos alfcuotas de 200 pl de muestras de plasma mediante el metodo de Trizol-sflice de acuerdo con un procedimiento de Asuragen. La qRT-PCR de diana unica se realizo con el kit de retrotranscripcion TaqMan® y los cebadores ahorquillados espedficos del miRNA (Applied Biosystems). La etapa de RT se realizo por triplicado y en la PCR final estaban presentes 2 pl equivalentes del plasma para medir la concentracion de miR-145, miR-148a, miR-192, miR-194, miR-203 y miR-215, abundantes en los organos del aparato digestivo, asf como la concentracion del ubicuo miR-30e-3p. La concentracion de cada miRNA abundante en el aparato digestivo se normalizo por el miR-30e-3p asf como entre sf, se convirtieron en la cantidad relativa (CR) de miRNA de acuerdo con el protocolo de ABI (2-aCt) y se compararon con los perfiles de miRNA de los controles. La figura 16A-L muestra claramente que miR-192, miR-194, miR-203 y miR-215 son biomarcadores eficaces, y que miR-145, miR-148a y miR-30e-3p son normalizadores eficaces. Las razones biomarcador/normalizador diferencian con eficacia entre los pacientes con todas las enfermedades estudiadas y los controles. El miR-203, muy abundante en el esofago y en el estomago, es especialmente eficaz a la hora de detectar canceres de estos organos, y el miR- 215, muy abundante en la columna, es mas eficaz para diferenciar entre los pacientes con cancer de colon o la enfermedad de Crohn y los controles. La combinacion de miR-192 y miR-203 normalizada por miR-30e-3p diferencia con eficacia entre los pacientes con todas las enfermedades del aparato digestivo y los controles (figura 16M) con una sensibilidad del 94% y una especificidad del 100% calculadas como se describe en el ejemplo 8. Es importante que todos los tumores esten en el estadio 1 o 2, lo que significa que la estrategia propuesta se puede utilizar con eficacia para la deteccion sistematica y el diagnostico precoz.
Ademas, se compararon diferentes canceres entre sf, y la enfermedad de Crohn se comparo con todos los canceres del aparato digestivo. Como resultado, se hallaron las siguientes razones de biomarcador/normalizador capaces de diferenciar determinadas enfermedades:
1. Enfermedad de Crohn frente a los canceres de esofago, gastrico y colorrectal: miR-194/miR-148a; miR- 215/miR-30e-3p; miR-215/miR-194; miR-203/miR-148a; miR-192/miR-203; miR-215/miR-203 y miR- 194/miR-192 (figura 17A-G).
2. Cancer de esofago frente a cancer gastrico: miR-194/miR-145; miR-194/miR-148a; miR-194/miR-30e-3p (figura 18A-C).
3. Cancer gastrico frente a cancer colorrectal: miR-203/miR-30e-3p; miR-203/miR-148a; miR-215/miR-203 (figura 18D-F).
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4. Cancer de esofago frente a cancer colorrectal: miR-192/miR-145; miR-192/miR-148a; miR-192/miR-30e-3p (figura 18G-I).
Asf pues, el analisis de la concentracion en el plasma de los miRNA abundantes en los organos del aparato digestivo es eficaz para: (i) la deteccion de la enfermedad de Crohn y tumores en el esofago, estomago y colon; (ii) la diferenciacion entre una enfermedad inflamatoria y los canceres; (iii) la diferenciacion de los canceres localizados en diferentes organos del aparato digestivo.
Ejemplo 6: Diferenciacion de las enfermedades de diferentes sistemas de organos
Se utilizaron en el estudio las preparaciones de miRNA purificados de muestras de plasma obtenidas de los pacientes descritos en los ejemplos 4 y 5. Se estudio la capacidad que tienen las diferentes combinaciones de miRNA para diferenciar entre los pacientes con enfermedades del aparato digestivo (enfermedad de Crohn y cancer de esofago, gastrico y colorrectal) y los pacientes con enfermedades de aparato respiratorio (asma, neumoma, EPOC y CPNM). Se incluyeron en el estudio miR-126, miR-146b-5p, miR-155 y miR-486-5p abundantes en el pulmon, y miR-145, miR-192, miR-203 y miR-215 abundantes en el aparato digestivo. La expresion de algunos de estos miRNA (tabla 3) se sabe que esta desregulada en las enfermedades de diferentes organos. Ademas, se analizaron miR-17-5p y miR-31, implicados en procesos patologicos de diferentes organos, asf como miR-30e-3p y miR-409-3p, que se utilizaron como normalizadores en los experimentos 4 y 5. El ARN se aislo de dos alfcuotas de 200 |jl de las muestras de plasma mediante el metodo de Trizol-sflice de acuerdo con un procedimiento de Asuragen. Los ensayos de qRT-PCR TaqMan® (Applied Biosystems) de una sola diana para miRNA se realizaron por triplicado con 2 |jl equivalentes del plasma en un volumen de reaccion de 10 jl para la PCR final. Las concentraciones de cada miRNA se normalizaron por miR-30e-3p y miR-409-3p asf como entre sf, se convirtieron en cantidad relativa (CR) de miRNA de acuerdo con el protocolo de ABI (2-aCt), y se compararon los perfiles de miRNA caractensticos de los pacientes con las enfermedades de los aparatos respiratorio y digestivo. Las figuras 19A-U demuestran que muchas parejas de miRNA distinguen con eficacia entre los pacientes con enfermedades de los aparatos respiratorio y digestivo: miR-192/miR-126; miR-155/miR-126; miR-145/miR-126; miR-155/miR-30e-3p; miR-192/miR-30e-3p; miR-155/miR-409-3p; miR-486-5p/miR-17-5p; miR-155/miR-17-5p; miR-192/miR-17-5p; miR-146b-5p/miR-31; miR- 155/miR-31, miR-192/miR-31; miR-486-5p/miR-155; miR-192/miR-155; miR-145/miR-155; miR-146b-5p/miR-155; 486-5p/miR-203; miR-192/miR-203; miR-145/miR-203; miR-192/miR-215; miR-155/miR-215.
La combinacion de dos parejas de miRNA incrementa la exactitud de la prueba. Las figuras 19V y 19W proporcionan un ejemplo con la combinacion de las razones miR-145/miR-155 y miR-486-5p/miR-155, que diferencian los pacientes con todas las enfermedades del aparato digestivo entre los pacientes con enfermedades pulmonares con una sensibilidad del 95%, una especificidad del 90% y una exactitud del 93%.
Ejemplo 7: Diferenciacion entre los canceres y las enfermedades inflamatorias
Las mismas muestras de plasma que se estudiaron en el ejemplo 6 se utilizaron para la purificacion del ARN y se analizaron los mismos miRNA. En este estudio se exploro la capacidad que tienen las diferentes combinaciones de miRNA para diferenciar entre los pacientes con enfermedades inflamatorias (asma, neumoma, EPOC y enfermedad de Crohn) y los pacientes con diferentes canceres (cancer de esofago, gastrico, colorrectal y pulmonar no microcftico). Las figuras 20A-F muestran que varias parejas de miRNA diferencian con eficacia entre los pacientes con enfermedades inflamatorias y los pacientes con diferentes canceres: miR-17-5p/miR-155; miR-192/miR-155; miR-215/miR-155; miR-192/miR-30e; miR-146b-5p/miR-30e-3p; miR-155/miR-30e-3p. Hay menos parejas de miRNA que diferencian entre las enfermedades inflamatorias y los canceres que parejas de miRNA capaces de diferenciar entre las enfermedades del aparato respiratorio y las enfermedades del aparato digestivo. Primero, los cambios de expresion de muchos miRNA son caractensticos de ambos tipos de enfermedad. Segundo, en muchos casos, la carcinogenia viene acompanada por una inflamacion relativamente prominente.
La combinacion de dos parejas de miRNA incrementa la exactitud de la prueba. Las figuras 20G y 20H dan a conocer un ejemplo con la combinacion de las razones de miR-146b-5p/miR-155 y miR-146b-5p/miR-30e-3p, que distinguen a todos los pacientes con enfermedades inflamatorias entre los pacientes con cancer con una sensibilidad del 80%, especificidad del 98% y una exactitud del 89%.
Asf pues, los resultados de los experimentos presentados mas arriba apoyan las principales ideas de la presente invencion. El analisis de la concentracion en el plasma de los miRNA abundantes en un sistema de organos, o en un organo, determinado diferencia entre: (i) las enfermedades de sistemas de organos y los controles, (ii) las enfermedades de tres organos del aparato digestivo; (iii) las enfermedades del aparato respiratorio y del digestivo; (iv) los canceres y las enfermedades inflamatorias.
Ejemplo 8: Un metodo para el analisis de varios miRNA y su uso para la seleccion de biomarcadores y la deteccion de un sistema de organos o un organo concreto con cambios patologicos
Se utilizaron dos aplicaciones diferentes para el desarrollo de la PDU (en fase de investigacion) y su uso clmico (procesamiento de los datos para deteccion). Los algoritmos de ambas aplicaciones contienen partes de entrenamiento y de clasificacion, pero son significativamente diferentes.
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El algoritmo utilizado para el desarrollo de la prueba de deteccion
En la descripcion del algoritmo que aparecera mas adelante y las figuras relacionadas, el termino «biomarcador» define una pareja de miRNA, marcador y normalizador, utilizada para el diagnostico de la enfermedad y mas en general para diferenciar diferentes grupos de sujetos. El termino «RoC» significa curva de eficacia diagnostica, que es la prueba estadfstica utilizada en la clasificacion.
El algoritmo propuesto se basa en las siguientes suposiciones simplificadas:
• Para cualquier biomarcador o combinacion de biomarcadores, esta disponible un pequeno numero, p. ej., <20, de experimentos;
• La respuesta de cualquier biomarcador a una enfermedad determinada se puede explorar de forma independiente y no se debe conectar a la combinacion «final» de biomarcadores asignados a un conjunto de datos concreto;
• Los algoritmos deben ser probabilfsticos, lo que permite una estimacion del mejor resultado.
La primera parte del algoritmo esta relacionada con el entrenamiento a partir de los datos etiquetados para una enfermedad de un sistema de organos, organo, tejido o tipo de celula correspondiente. La figura 21A esboza las operaciones de esta parte del algoritmo.
Esta parte supone un dialogo intenso, practicamente en cada etapa, con la persona que realiza los experimentos. La primera etapa siempre incluye alguna operacion manual, o escribir valores de muestras, o realizar operaciones para importar los datos, de forma parcial o completa, desde algunos documentos estandares. El tipo de documento puede ser, pero sin limitarse a ellos, una hoja de calculo para Excel, o un archivo de texto delimitado por tabuladores. Las demas etapas se pueden realizar de forma automatica, con solo la confirmacion manual, como «siguiente», o puede tener algunas correcciones manuales. Por ejemplo, en la etapa de normalizacion se debe proporcionar el mejor tipo de normalizacion o realizar todo el procesamiento con varios tipos de normalizaciones. Algunas muestras pueden tener valores fuera de un determinado margen estadfsticamente razonable. Como norma, este margen es un multiplo de la desviacion estandar, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, dos o tres veces la desviacion estandar, segun la distribucion del valor (cuan proxima esta a la normalidad, etc.), se puede tomar una decision sobre si descartar estas muestras de la estadfstica, etc. El analisis estadfstico incluye el calculo del valor de P para la separacion entre esperado y control, y los parametros de la curva ROC (curva de eficacia diagnostica). La ultima etapa del algoritmo (tomar la decision de anadir el marcador) puede incluir partes (bucle interno) del algoritmo de clasificacion, que se describe mas adelante. En esta etapa, los parametros calculados se aplican al conjunto de entrenamiento. La decision de utilizar este marcador se basa en el nivel del exito de la clasificacion. Esta decision se puede reconsiderar en la etapa de clasificacion.
La parte de clasificacion del algoritmo se muestra en la figura 21B.
La segunda parte del algoritmo, la clasificacion, se utiliza principalmente para el proceso con los datos de validacion. De igual forma, una parte de el, el bucle interno, se puede utilizar en la ultima etapa del algoritmo de entrenamiento. En general, en la etapa de investigacion, estas partes (el procedimiento de entrenamiento y el procedimiento de clasificacion) se utilizan de manera iterativa, es decir, se repiten varias veces, para que la prueba alcance una exactitud aceptable desde el punto de vista clmico.
El procedimiento de clasificacion contiene dos bucles de iteracion anidados, a traves de conjuntos de datos (bucle externo) y biomarcadores en cada conjunto de datos (bucle interno).
Las etapas de iteracion a lo largo del bucle interno de biomarcadores incluyen:
Etapa 1. normalizacion de los biomarcadores del conjunto de datos
La normalizacion puede incluir una normalizacion general de la prueba de deteccion (una por prueba) basada en el miRNA enriquecido, y una normalizacion espedfica para un conjunto de datos concreto, de tipo b), c) o d) (vease el apartado Descripcion detallada de la invencion, mas arriba) o mas de uno de ellos. La version de la normalizacion espedfica utilizada para cada biomarcador se incluye en la K-base como una descripcion del conjunto de datos. Asf pues, si un biomarcador es un miembro de mas de un conjunto de datos, se debe normalizar en consonancia en cada conjunto.
Etapa 2. Calculo de probabilidades de los biomarcadores
La concentracion de los biomarcadores para una persona concreta se tiene que mapearse entre dos posibilidades: tener la enfermedad o no tenerla. La operacion de mapeo utiliza dos funciones de probabilidad, basandose en el procesamiento de los datos de los biomarcadores de dos poblaciones: con enfermedad y sin enfermedad (control). Cada funcion de probabilidad es una curva ajustada a una lmea, que va de 1 a 0 para la poblacion de control, y de 0 a 1 para la poblacion con la enfermedad deseada. La descripcion de cada curva se almacena, recupera y actualiza
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Etapa 3. Uso de la historia (puntos espaciados en el tiempo)
Las partes significativas de las curvas de la diana y del control estan solapadas. Si un valor real esta dentro de este area de solapamiento, es necesario tomar una decision sobre como interpretar el resultado. Esta se basa, pero sin limitarse a ello, en la comparacion de la probabilidad de tener la enfermedad y de estar libre de ella; analizar los datos de los biomarcadores existentes para la misma persona si tales datos se han tornado y almacenado en la I- base.
Esto es el final de las iteraciones de los biomarcadores.
Etapas de iteracion para el bucle del conjunto de datos (etapas de datos externos)
Etapa 1. Calculo de la probabilidad de la diana
En muchos casos, los biomarcadores, que estan incluidos en un conjunto de datos concreto, son estadfsticamente independientes, esto es, la probabilidad que el valor de la concentracion concreta pertenezca al grupo control o al grupo diana no depende significativamente del valor o valores de otros biomarcadores del conjunto de datos. En ese caso, se ha calculado la suma ponderada de las probabilidades para los biomarcadores que comprenden este conjunto de datos. Por defecto, todas las ponderaciones son iguales, p. ej., para tres biomarcadores, cada ponderacion es 1/3. No obstante, las ponderaciones individuales se pueden almacenar en la K-base para cada biomarcador dentro de este conjunto de datos. Se pueden basar en algunos parametros de la curva ROC de los biomarcadores, como sensibilidad, especificidad o ABC (area bajo la curva). La suma de las ponderaciones para todos los biomarcadores de cualquier conjunto de datos debe ser 1.
En el caso de una interdependencia significativa de algunos biomarcadores en un conjunto de datos concreto, la K- base contiene una descripcion de la superficie multidimensional de probabilidades para este grupo, en donde hay tantas dimensiones como numero de biomarcadores dependientes en el grupo. Mediante el uso de esta descripcion, cada combinacion de valores de los biomarcadores se mapea a dos posibilidades. Si el conjunto de datos contiene tambien biomarcadores independientes, las probabilidades de los conjuntos de datos se calculan con la suma ponderada de probabilidades para el grupo o grupos de biomarcadores dependientes, y la cada uno de los biomarcadores independientes.
Etapa de datos 2. Tomar una decision
Como norma, el resultado debe presentarse como POSITIVO o NEGATIVO para la enfermedad deseada. En casos especiales, tambien se puede utilizar el resultado INDETERMINADO con un porcentaje adjunto. Los parametros para la toma de decisiones se deben definir y almacenar en la K-base con anterioridad. Pueden ser para toda la deteccion, o espedficos de la diana (sistema de organos/organo/tejido) y aplicarse a las probabilidades, calculadas en la etapa anterior (etapa de datos 1). Estos parametros se pueden aplicar a cada una de dos probabilidades (PP: probabilidad de patologfa, PC: probabilidad de control) o, con mas frecuencia, para diferenciar las dos. Ejemplos: (i) el parametro de la diferencia es 0, a saber, PP > PC significa POSITIVO, PP < significa NEGATIVO; (ii) PP - PC < 0,25 es NEGATIVO, PP - PC > 0,35 POSITIVO, e INDETERMINADO si esta entre ellos; (iii) PP > 0,6 es POSITIVO, PC > 0,7 es NEGATIVO, todo lo demas es INDETERMINADO.
Etapa de datos 3. Registro
Se muestran los resultados y se guardan en la I-base, junto con los datos de identificacion, tales como el numero de la prueba, estampas de fecha y hora, identificacion del paciente, etc.
El algoritmo para el ensayo clmico y su uso
Cuando ha terminado la etapa de investigacion, la K-base contiene todos los componentes de la PDU y sus versiones: biomarcadores, conjuntos de datos y constantes para la clasificacion. En la siguiente etapa se llevan a cabo estudios clmicos mas grandes con el uso de estas herramientas.
Basandose en el resultado obtenido, se realizan la verificacion y la evaluacion de los biomarcadores y de los conjuntos de datos, asf como algunas modificaciones del algoritmo y/o constantes. Por ejemplo, se pueden utilizar un algoritmo de clasificacion diferente, como la regresion logfstica multinominal (Hosmer D. W., Lemeshow S. Applied logistic regression. Wiley, 2000; Allison P. D. Logistic regression using the SAS system: theory and application. Wiley, 2008) o las maquinas de soporte vectorial (Cristianini N, Shawe-Taylor J. An introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-based Learning Methods. Cambridge Press, 2000; Abe S. Support Vector Machines for Pattern Classification. Springer, 2010). La K-base recibe algunos cambios en consonancia. Despues de tales cambios, se realizaran los ensayos clmicos.
En el uso clmico, el algoritmo de clasificacion utiliza constantes y parametros de la K-base y los datos problema reales se almacenan en la I-base. La K-base permanece intacta hasta la siguiente revision, a saber, la llegada de
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nuevos datos verificados de investigacion.
En general, cualquiera de los algoritmos, operaciones funcionales o asunto importante descritos en esta especificacion se pueden implantar en un circuito electronico digital o en un programa informatico, microcodigo o equipo informatico, lo que incluye las estructuras descritas en esta especificacion y sus equivalencias estructurales o en combinaciones de uno o varios de ellos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o varios aparatos de procesamiento de datos pueden formar parte de un modulo que se puede instalar en un ordenador y configurarse para que ejecute algoritmos para seleccionar y/o detectar biomarcadores para enfermedades, asf como ejecutar algoritmos para la clasificacion de una o varias enfermedades. En algunas realizaciones, uno o varios aparatos de procesamiento de datos pueden ser parte de un modulo que puede estar instalado en un ordenador y estar configurado para realizar el algoritmo de clasificacion presentado en el ejemplo 8, que incluye los bucles de iteracion anidados (p. ej., bucle de biomarcadores y bucle de conjuntos de datos). Por ejemplo, se pueden configurar uno o varios aparatos de procesamiento de datos para que ejecuten una o varias de las operaciones mostradas en las figuras 2lA y 21B. En algunas realizaciones, los algoritmos pueden estar implementados como uno o varios productos de programa informatico, a saber, uno o varios modulos de instrucciones de programa informatico codificados en un medio legible por ordenador para la ejecucion mediante el aparato de procesamiento de datos o para el control de la operacion del mismo.
El medio legible por ordenador puede ser un dispositivo de almacenamiento legible en una maquina, un sustrato de almacenamiento legible en una maquina, un dispositivo de memoria o una combinacion de uno o varios de ellos. La terminologfa «aparato de procesamiento de datos» engloba cualquier aparato, dispositivo y maquina para el procesamiento de datos, entre ellos, a modo de ejemplo, un procesador programable, un ordenador o numerosos procesadores u ordenadores. El aparato puede incluir, ademas del equipo informatico, un codigo que crea un entorno de ejecucion para el programa informatico en cuestion, p. ej., un codigo que constituya un microcodigo del procesador, una pila de protocolos, un sistema de administracion de bases de datos, un sistema operativo, un entorno de ejecucion o una combinacion de uno o varios de ellos. El aparato incluye codigo para crear, verificar y/o modificar las tablas de la K-base o de la I-base. En algunas realizaciones, la K-base y la I-base se pueden mantener en un sistema de administracion de bases de datos, tales como SQL para servidores, Oracle, MySQL, entre otros.
Un programa informatico (tambien conocido como programa, soporte logico, aplicacion con soporte logico, archivo de ordenes o codigo) se puede escribir en cualquier forma de lenguaje de programacion, que incluye lenguajes compilados o interpretados, y se puede poner en funcionamiento en cualquier forma de implementacion utilizada corrientemente, que presente una unidad idonea para ser usada en un entorno computacional. Un programa informatico no se corresponde necesariamente con un archivo en un sistema de archivos. Un programa se puede almacenar en una porcion de un archivo que contiene otros programas o datos (p. ej., uno o varios archivos de ordenes almacenados en un documento con lenguaje de analisis formal de documentos) en un solo archivo dedicado al programa en cuestion, o en varios archivos coordinados (p. ej., archivos que almacenan uno o varios modulos, subprogramas o porciones de codigo). Un programa informatico se puede implementar para ser ejecutado en un ordenador o en varios ordenadores que estan localizados en un sitio o distribuidos a traves de muchos sitios e interconectados mediante una red de comunicacion.
Los procesos descritos en esta especificacion se pueden realizar mediante uno o varios procesadores que ejecutan uno o varios programas informaticos para realizar funciones al operar sobre datos de entrada y generar una salida. Los procesadores idoneos para ejecutar un programa informatico incluyen, a modo de ejemplo, microprocesadores de proposito tanto general como especial, y uno o varios procesadores de cualquier clase de ordenador digital.
En algunas realizaciones, un usuario introduce a mano, a traves de uno o varios dispositivos, los datos obtenidos de las pruebas de deteccion en la etapa de investigacion o en la etapa clmica. En algunas realizaciones, un usuario puede observar o recibir, desde uno o varios dispositivos, los datos de salida, tales como, pero sin limitarse a ellos datos de clasificacion de biomarcadores y datos relativos a las detecciones de los cambios de concentracion de los biomarcadores. Tambien se pueden utilizar otra clase de dispositivos para proporcionar la interaccion con un usuario; por ejemplo, la retroalimentacion proporcionada al usuario puede ser cualquier forma de retroalimentacion sensitiva, p. ej., retroalimentacion visual o retroalimentacion auditiva; y la entrada que aporta el usuario se puede recibir en cualquier forma, entre ellas la entrada acustica, oral o tactil.
Las realizaciones del asunto importante descritas en esta especificacion se pueden implementar en un sistema informatico que incluye un componente interno de respaldo, p. ej., un servidor de datos, o que incluye un componente de programa intermedio, p. ej., un servidor de la aplicacion, o que incluye un componente de interfaz, p. ej., un cliente computacional que tiene una interfaz grafica de usuario o un navegador web a traves del cual un usuario puede interaccionar con una implementacion del asunto importante descrito en esta especificacion, o cualquier combinacion de uno o varios de tales componentes internos de respaldo, programa intermedio o interfaz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema puede incluir una interfaz de usuario/interfaz web grafica que permite a un usuario introducir y/o inspeccionar los datos de la K-base y de la I-base. Como alternativa, o ademas, la interfaz puede permitir al usuario controlar, modificar o manipular una ejecucion del algoritmo. En algunas realizaciones, el sistema puede recuperar o extraer datos de otros sistemas y/o componentes conectados a la red.
La presente invencion no ve limitado su alcance por las realizaciones espedficas descritas en la presente memoria. De hecho, diferentes modificaciones de la invencion, ademas de las descritas en la presente memoria, resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Se pretende que tales modificaciones esten dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (4)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de deteccion en un sujeto para determinar si cualquiera o todos los siguientes sistemas de organos: el aparato digestivo (GI), el aparato respiratorio y el sistema nervioso central, tienen una enfermedad, en donde dicho metodo comprende:
    a. medir la concentracion de los miRNA que son abundantes en el aparato digestivo (GI), de los miRNA que son abundantes en el aparato respiratorio y de los miRNA que son abundantes en el sistema nervioso central, en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
    b. medir la concentracion de los miRNA normalizadores en la misma muestra de lfquido corporal recogida del
    sujeto;
    c. calcular las razones de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a) y (b);
    d. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (c) con las correspondientes razones de control, y
    e. (i) identificar que el sujeto esta afectado por una enfermedad de un sistema de organos determinado cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores, calculadas en la etapa (c), son mas altas que las correspondientes razones de control, o (ii) identificar que el sujeto no esta afectado por una enfermedad de dicho sistema de organos cuando las razones de las concentraciones de los miRNA abundantes en dicho sistema de organos por sus correspondientes miRNA normalizadores, calculadas en la etapa (c), no son mas altas que las correspondientes razones de control,
    en donde los miRNA abundantes en el aparato digestivo medidos en la etapa (a) comprenden miR-215, miR-203, miR-192 o miR-194, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-30e-3p, miR-145 o miR-148a;
    los miRNA abundantes en el aparato respiratorio medidos en la etapa (a) comprenden miR-486-5p, miR-34b o miR- 192, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-l55, miR-223, miR- 409-3p;
    y los miRNA abundantes en el sistema nervioso central medidos en la etapa (a) comprenden miR-128, miR-132 o miR-874 y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141, o los miRNA abundantes en el sistema nervioso central medidos en la etapa (a) comprenden miR-134, miR-323-3p o miR- 382, y los miRNA normalizadores de la etapa (b) comprenden mir-127 o miR-370.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende medir los miRNA abundantes en al menos un sistema de organos adicional seleccionado del grupo que consiste en aparato locomotor, aparato circulatorio, aparato reproductor (femenino), sistema endocrino y sistema hematico.
  3. 3. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que ademas comprende identificar si la enfermedad es cancer o inflamacion, en donde dicho metodo comprende:
    a. medir la concentracion de al menos un miRNA asociado al cancer en una muestra de lfquido corporal recogida del sujeto, en donde dicho miRNA asociado al cancer se selecciona preferiblemente de los miRNA recogidos en la tabla 3;
    b. medir la concentracion de al menos un miRNA asociado a la inflamacion en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto, en donde el miRNA asociado a la inflamacion se selecciona preferiblemente de los miRNA recogidos en la tabla 3;
    c. medir la concentracion de al menos un miRNA abundante en el sistema de organos implicado, en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
    d. medir la concentracion de al menos un miRNA normalizador en la misma muestra de lfquido corporal recogida del sujeto;
    e. calcular las razones emparejadas de las concentraciones de los miRNA medidas en las etapas (a), (b), (c)
    y (d);
    f. comparar las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (e) con las correspondientes razones predeterminadas caractensticas del cancer y de la inflamacion, y
    g. (i) identificar que la enfermedad es cancer cuando las razones de las concentraciones de los miRNA
    calculadas en la etapa (e) estan en el margen predeterminado caractenstico del cancer, o (ii) identificar que la enfermedad es inflamacion cuando las razones de las concentraciones de los miRNA calculadas en la etapa (e) estan en el margen predeterminado caractenstico de la inflamacion.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde
    10
    (1) la enfermedad esta relacionada con el pulmon y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 6, o
    (2) la enfermedad esta relacionada con el aparato digestivo (GI) y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 8, o
    (3) la enfermedad esta relacionada con el aparato respiratorio o el aparato digestivo (GI), y las parejas de miRNA se seleccionan de las recogidas en la tabla 11.
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