CN112980954B

CN112980954B - 一种预测神经退行性疾病风险的试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN112980954B
Application number: CN202110234469.1A
Authority: CN
Inventors: 贾建平; 贾龙飞; 施予晴; 杨坚炜; 庞亚娜
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-03-03
Also published as: CN112980954A

Abstract

本申请公开了用于预测和/或诊断受试者是否患有神经退行性疾病的方法，以及用于所述方法的试剂盒。此外，本申请还公开了试剂盒用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的用途。本申请的试剂盒能够检测无症状期的AD，甚至能够在AD发病前5‑7年对受试者患AD的风险进行预测。

Description

一种预测神经退行性疾病风险的试剂盒及其用途

技术领域

本申请涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学诊断领域。本申请具体涉及一种用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的试剂盒，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)对全世界的医疗系统构成了巨大挑战，但是目前药物临床试验均宣告失败，这可能与AD的病理变化在AD症状出现前数年就已发生有关。因此，在AD出现症状前进行早期干预可能是更好方法。但由于缺乏症状或症状较轻，临床前AD很难识别。因此，生物标志物成为其鉴定的重要工具。但传统的腰椎穿刺检查脑脊液中的Aβ及tau为侵入性检查且成本昂贵，难以在临床实践中普遍应用。

外泌体是直径为30-100nm的纳米囊泡，可以从大多数活细胞中释放出来，且易于穿过血脑屏障。从血清中分离出的外泌体已被证明富含miRNA，更重要的是，许多miRNA是外泌体特异性的。因此，外泌体miRNA可能能够提供有关中枢神经系统病理变化的信息。miRNA水平的变化可能导致异常翻译，从而导致相应蛋白质表达异常。越来越多的证据表明miRNA与AD病理相关。miRNA调节淀粉样前体蛋白(APP)和与APP代谢相关的蛋白，例如α-分泌酶和β-分泌酶的表达。它们在淀粉样蛋白β(Aβ)清除中也起重要作用。另外，miRNA水平与脑中Tau蛋白的表达和磷酸化有关，并参与其他与AD相关的机制，例如线粒体功能障碍，自噬，神经递质释放、清除和突触可塑性等。其他研究报道，外泌体miRNA可能是AD的生物标志物。然而，很少有研究调查在临床前AD中外泌体miRNA水平是否发生改变，以及miRNA是否可以作为该疾病的预测生物标志物。

基于上述问题，AD的临床治疗急需一种能够有效诊断无症状期AD的方法。

发明内容

本申请发明人通过检测外周血神经元源性外泌体中6种microRNA(miRNA)的水平，建立了无症状期AD的诊断模型，并在4个独立的人群中验证了6种miRNA组合的诊断效力，证实了外泌体中miRNA对AD临床前阶段的预测作用，可在AD症状出现前的至少5年(例如5-7年)进行预测和诊断。

因此，在第一方面，本申请提供了一种用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的方法，其包括：

(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；

(2)测定生物样品中生物标志物的水平；和

(3)基于所述生物标志物的水平，预测受试者发生神经退行性疾病的风险；

其中，所述生物标志物为miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p，miR-485-5p，miR-138-5p和miR-342-3p。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清，血浆或脑脊液。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。在此类实施方案中，优选地，在进行步骤(2)之前，对所述生物样品进行预处理，以获得外泌体；然后进行步骤(2)，即，测定外泌体中生物标志物的水平。对生物样品(例如全血，血清和血浆)进行处理以获得外泌体的方法是本领域技术人员已知的。例如，可使用商业化的试剂盒(例如ExoQuick、Exoeasy)从生物样品(例如全血，血清和血浆)中分离获得外泌体。

在某些实施方案中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病(AD)或轻度认知功能障碍(MCI)。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过将所述生物标志物的水平与参考值进行比较，从而预测受试者发生神经退行性疾病的风险。

在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是miRNA的水平。在此类实施方案中，优选地，所述参考值是所述miRNA在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中，通过定量PCR来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，相对于参考值，外泌体中miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p，miR-485-5p的水平的升高表明，受试者具有发生神经退行性疾病(例如AD或MCI)的风险。在某些实施方案中，相对于参考值，外泌体中miR-138-5p和miR-342-3p的水平的降低表明，受试者具有发生神经退行性疾病(例如AD或MCI)的风险。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述6种生物标志物的水平进行岭回归，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者发生神经退行性疾病的风险。

在某些实施方案中，所述方法还包括，确定受试者的年龄、性别和ApoEε4基因型。在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述6种生物标志物的水平进行岭回归，并且用年龄、性别和/或ApoEε4基因型进行校正，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者发生神经退行性疾病的风险。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述miR-29c-5p的序列如SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，所述miR-143-3p的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些实施方案中，所述miR-335-5p的序列如SEQ ID NO:3所示。在某些实施方案中，所述miR-485-5p的序列如SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，所述miR-138-5p的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述miR-342-3p的序列如SEQ ID NO:6所示。

在某些实施方案中，所述方法能够预测受试者在5年或更长时间的范围内(例如5-7年内)发生神经退行性疾病的风险。

在第二方面，提供了一种用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p，miR-485-5p，miR-138-5p和miR-342-3p。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：用于确定受试者的miR-29c-5p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-335-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-138-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-342-3p水平的第六试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五和/或第六试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，所述杂交技术选自Northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法。

在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-29c-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-335-5p水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-138-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-342-3p的水平的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五和/或第六试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，所述扩增技术选自qPCR，RT-PCR，Stem-loop PCR，Poly APCR，RCA，测序。

在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-29c-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-335-5p水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-138-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-342-3p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂。

在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-29c-5p的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-335-5p水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-138-5p的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-342-3p的水平的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoE基因型的第七试剂。在某些实施方案中，所述第七试剂为检测ApoE基因型的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，其中，所述神经退行性疾病为AD。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于预测受试者在5年或更长时间的范围内(例如5-7年内)发生神经退行性疾病的风险。

在第三方面，提供了用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险；其中，所述生物标志物为miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p，miR-485-5p，miR-138-5p和miR-342-3p。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含用于确定受试者的miR-29c-5p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-335-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-138-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-342-3p水平的第六试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。

在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoE基因型的第七试剂。

在某些实施方案中，所述第七试剂为检测ApoE基因型的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，其中，所述神经退行性疾病为AD。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法预测受试者发生神经退行性疾病的风险。

术语解释

如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是一类进行性发展的疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征。主要包括帕金森病(PD)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知功能障碍(MCI)和肌肉萎缩侧缩硬化症(ALS)等。

如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病(AD)”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于AD的诊断可采用磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)和生物标志物诊断等方法。

如本文中所使用的，术语“外泌体(exosome)”是指直径大约为30-150nm的微小膜泡，由多种细胞分泌，含有特定的蛋白质(例如，外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族CD63,CD81和CD9)、脂质、细胞因子或遗传物质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

如本文中所使用的，术语“生物标志物(Biomarker)”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

如本文中所使用的，术语“参考值”是指生物标志物的预定值，其是根据对照样品(例如获自正常人群的生物样品)的生物标志物的水平得出的。参考值可以用作阈值，以区分可能存在疾病风险的受试者和不存在该疾病风险的受试者。参考值可以是相对值，有上限和下限的数值范围，平均值，中间值等。本领域技术人员根据现有技术中公开的方法可以选择合适的对照样品、测定并获得参考值。上述方法可以参见，例如，Burtis C.A.et al.,2008,Chapter 14,section“statistical treatment of reference values，其以全部引用方式并入本文。

如本文中所使用的，术语“ApoEε4基因型”是指ApoE基因的一种变异形式，APOE基因有多种可能的变异形式，例如，ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4。一些研究表明，携带APOE基因ε4变异体的人群在晚年更容易发展为阿尔茨海默病。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“APP(myloid beta(A4)precursor protein)基因”在早期老年痴呆的发病中起重要作用。目前发现，APP基因共有6种错义突变。

如本文中所使用的，术语“家族性阿尔茨海默病(Familial Alzheimer'sDisease,FAD)”是指家族中连续两代或以上、至少两位一级亲属患有阿尔茨海默病。

发明的有益效果

本申请的方法能够检测无症状期的AD(包括FAD)，甚至能够在AD发病前5-7年对受试者患AD(包括FAD)的风险进行预测。并且，本申请的方法仅取静脉血即可完成检测，相较传统的腰椎穿刺脑脊液检测，本申请方法具有以下有益技术效果：(1)具有几乎无创伤，低风险等优势；(2)具有成本低的优势，可在社区或简易的医疗机构完成，受检测人员无需住院；(3)可在大范围人群中筛查AD，使得大范围的老年人口筛查成为可能；(4)无需在医院或专业医疗机构完成；(5)成本低廉。

附图说明

图1显示了本研究的数据集，其中，图1A为本研究四个数据集的分组情况，图1B为临床前AD组与对照组的分划标准，图1C为AD组与对照组的分划标准。

图2显示了外泌体的检测结果，其中，图2A为外泌体透射电镜的检测结果，图2B为外泌体中Alix的蛋白质印迹法的检测结果，图2C为外泌体中L1CAM的检测结果。

图3显示了外泌体中CD9(图3A)、CD63(图3B)和CD81(图3C)的水平。

图4显示了13种上调的miRNA和5种下调的miRNA的热图。

图5显示了六种miRNA的诊断模型，其中，显示了数据集2中对照组和AD组的miR-485-5p(图5A)，miR-29c-5p(图5B)，miR-335-5p(图5C)，miR-143-3p(图5D)，miR-342-3p(图5E)，miR-138-5p(图5F)的量；图5G显示了六种miRNA组合的AUC的值，图5H显示了六种miRNA组合结合APOE基因型的AUC的值，图5I显示了APOE基因型的AUC的值。

图6显示了数据集中2中单个miRNA的操作特征曲线(ROC)分析，其分别显示了miR-485-5p(图6A)，miR-29c-5p(图6B)，miR-335-5p(图6C)，miR-143-3p(图6D)，miR-342-3p(图6E)，miR-138-5p(图6F)的ROC分析。

图7显示了数据集中3中对照组和pre-AD组的miR-485-5p(图7A)，miR-29c-5p(图7B)，miR-335-5p(图7C)，miR-143-3p(图7D)，miR-342-3p(图7E)，miR-138-5p(图7F)的量。

图8显示了六种miRNA的预测模型，其中，图8A显示了六种miRNA组合的AUC的值，图8B显示了六种miRNA组合结合APOE基因型的AUC的值，图8C显示了APOE基因型的AUC的值；图8D显示了六种miRNA组合在训练数据集的AUC值，图8E显示了六种miRNA组合在测试数据集的AUC值，图8F显示了六种miRNA组合结合APOE基因型在训练数据集的AUC值，图8G显示了六种miRNA组合结合APOE基因型在测试数据集的AUC值。

图9显示了数据集中3中单个miRNA的操作特征曲线(ROC)分析，其分别显示了miR-485-5p(图9A)，miR-29c-5p(图9B)，miR-335-5p(图9C)，miR-143-3p(图9D)，miR-342-3p(图9E)，miR-138-5p(图9F)的ROC分析。

图10显示了在数据集4中对预测模型的证实结果，其中，显示了数据集中4中对照组和突变组的miR-485-5p(图10A)，miR-29c-5p(图10B)，miR-335-5p(图10C)，miR-143-3p(图10D)，miR-342-3p(图10E)，miR-138-5p(图10F)的量；图10G显示了六种miRNA组合的AUC的值。

图11显示了数据集中4中单个miRNA的操作特征曲线(ROC)分析，其分别显示了miR-485-5p(图11A)，miR-29c-5p(图11B)，miR-335-5p(图11C)，miR-143-3p(图11D)，miR-342-3p(图11E)，miR-138-5p(图11F)的ROC分析。

本申请涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

SEQ ID NO:	描述	序列
			1	miR-29c-5p	UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC
2	miR-143-3p	UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC
			3	miR-335-5p	UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU
4	miR-485-5p	AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC
			5	miR-138-5p	AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG
6	miR-342-3p	UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：数据集与统计方法

1.1研究的数据集

本研究共纳入4个数据集(图1A)。

数据集1包括来自北京中心的前瞻性研究参与者的数据(n＝40例，其中包括20名患有AD的受试者和20名健康对照者)。

数据集2包括从山东，贵州，河南，河北，吉林，广西和内蒙古自治区的其他中心招募的参与者的数据(n＝188例，其中包括95名患有AD的受试者和93名健康对照者)。

数据集3包括来自一项纵向研究参与者的数据，这些参与者在本研究前5-7年(2012年至2014年之间)在基线时被确认为认知正常(图1B)。纵向队列的血液是在基线时抽取的，并储存在-80℃以便在本研究中可以收集外泌体。由于外泌体经长期存储(>5年)仍是稳定的，因此我们认为外泌体样本反映了5-7年前参与者的状况。在本研究的随访过程中，对所有参与者进行了CSF中Ap42，P-tau和T-tau水平的测量以及认知评估。AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会(National Institute on Aging-Alzheimer’s Association,NIA-AA)诊断标准；MCI的诊断依据Peterson诊断标准。此外，根据脑脊液P-tau/Aβ42(临界值取0.14)和T-tau/Aβ42(临界值取0.67)的比值确定AD和正常对照。根据结果，参与者分为两组：健康对照组和临床前AD。在203位受试者中，有102位是对照组，有101位患有临床前AD。临床前AD的受试者定义为：在基线时认知正常，但在本研究的随访中具有异常的P-tau/Ap42临界值和认知障碍。我们比较了临床前AD患者和健康对照者在非症状阶段的外泌体miRNA水平，以确定外泌体miRNA是否可以预测临床前AD。

数据集4包括来自FAD研究参与者的数据，这些参与者是近亲家族成员，其编码APP(APP)，早老素1(PSEH)或早老素2(PSEN2)的基因发生了突变。将该家族中非突变基因携带者作为对照。由于给定突变的发病年龄趋于一致，因此可以通过同一家族中个体的已知发病来计算突变携带者的估计症状发作年限(EYO)。FAD参与者是从中国家族性阿尔茨海默病网络(CFAN，http：//www.chinacfan.org/FrontPage/Index_En.aspx)招募的。总共招募了57个对照(对照组)和56个EYO为5-7年的突变携带者(突变组)。

AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会(NationalInstitute on Aging-Alzheimer’s Association,NIA-AA)诊断标准。根据脑脊液P-tau/Aβ42(临界值取0.14)及Aβ42(临界值500pg/ml)来区分患有AD的受试者和正常对照组。如图1C所示，P-tau/Aβ42大于0.14的样本判断为AD组，P-tau/Aβ42小于0.14的样本判断为正常对照组。所有参与者或其法定监护人均已得到充分知情并签署了书面同意书。这项研究得到了首都医科大学宣武医院的机构审查委员会的批准。

1.2统计分析

使用SPSS 22.0(IBM Corp.，Armonk，NY，美国)和GraphPad Prism 8(GraphPadSoftware，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计学分析。每个数据集的数据均进行独立分析。使用x2检验分析了分类数据中的组差异，包括性别，临床亚组和APOEε4携带者分布。使用Welch’s t检验分析了数字数据的组差异，例如生物标志物水平。在数据集2、3和4中，使用年龄，性别，受教育年限或APOEε4基因型作为协变量的二元logistic回归模型计算预测值，然后将其用于ROC曲线分析。每个miRNA之间的多重共线性是通过分析公差，VIF，特征值和条件指数来估算。在数据集3中，使用IBM SPSS Statistics for Windows版本22.0将样本随机分为训练数据集(总计0.67)和测试数据集(总计0.33)。所有测试均为两尾，显着性水平设置为P<0.05。

1.3受试者特征

本研究包括四个独立的数据集(图1)。在所有四个数据集中，AD组和对照组之间的年龄和男女比例均无差异。在数据集1、2和3中，患有AD的受试者与对照组之间的受教育年限，APOEε4携带的百分比和简易精神状态量表(简称MMSE，其是目前使用最广泛的痴呆认知筛查工具，筛查的认知领域主要包括记忆，定向，注意力，视空间及言语功能)得分存在显着差异。

实施例2：外周血神经元源性外泌体miRNA的收集和检测

2.1外泌体的收集

采集所有受试者的清晨空腹(禁食12小时)静脉血20ml，采集管使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的聚丙烯管。为获取神经元源性外泌体，全血样本在首都医科大学宣武医院的中央实验室进行处理。在北京以外其他地区采集的血样，需立即将样品在室温下以4200×g离心10分钟以获得血浆，然后储存在4℃下，使用干冰保存在12小时内运送到宣武医院中央实验室。对于数据集1和数据集2，血样送达中央实验室后便立即进行处理，根据已发表方案的方法分离出特定的神经元源性外泌体(参见Jia L,Qiu Q,Zhang H,et al.Concordancebetween the assessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau in peripheral bloodneuronal-derived exosomes and cerebrospinal fluid.Alzheimers Dement 2019；15(8):1071-80.PMID:31422798)。对于数据集3和数据集4，将血浆样本保存在-80℃下，直至分离外泌体。外泌体的分离首先使用ExoQuick外泌体沉淀溶液(EXOQ；SystemBiosciences，CA)从血清中收集总的外泌体，然后使用小鼠抗人神经细胞粘附分子(NCAM)抗体(购自Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-7326)通过免疫共沉淀法分离神经元源性外泌体，并通过EZ-Link sulfo-NHS-生物素系统(Thermo Fisher Scientific)进行生物素标记。

2.2外泌体的验证

通过透射电镜(TEM)和蛋白质印迹法以确认外泌体收集成功。对于蛋白质印迹，我们使用了针对外泌体标记物Alix(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，美国)的抗体。根据已发表的方案，采用透射电镜(TEM)和蛋白质印迹法明确外泌体分离结果。并通过检测L1细胞粘附分子(L1CAM)的水平以明确神经元源性外泌体的富集(参见Jia L,Qiu Q,Zhang H,et al.Concordance between the assessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau in peripheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinalfluid.Alzheimers Dement 2019；15(8):1071-80.PMID:31422798)。

外泌体样品通过透射电子显微镜(TEM)，蛋白质印迹和L1细胞粘附分子(L1CAM)测量得到确认(图2)。来自患有AD的受试者的外泌体的代表性TEM图像描绘了外泌体(图2A)。蛋白质印迹分析表明，Alix(其作为外泌体或者细胞外囊泡的标志物)在外泌体样品中高度表达，但在上清液中却没有表达(图2B)。与未免疫沉淀的外泌体相比，免疫沉淀的外泌体中的L1CAM水平提高了约10倍(图3C)。这些数据证实了神经元来源的外泌体的成功收集。然后，我们测量了所有样品中CD9，CD63和CD81的水平(图3)。CD9(图3A)，CD63(图3B)和CD81(图3C)水平在AD受试者与对照之间没有显着差异。

2.3脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)的采集

根据国际标准，在采血后立即采集脑脊液。在进行腰穿时，受试者取左侧卧位，选择L3-L5椎间盘间隙作为穿刺部位，用20号无创伤针头收集15毫升CSF，并在室温下以2000xg离心10分钟。将CSF样品在-80℃下储存在聚丙烯管中。腰穿后至少监测所有受试者12小时。

2.4蛋白检测

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量CSF中Ap42，T-tau和P-T181-tau的水平。还测量了外泌体中的CD9，CD63和CD81。所有最终数据均在ELISA试剂盒的检测范围内。所有测量均以盲法进行。

2.5miRNA的提取

根据制造商的方案，使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Germantown，MD，美国)从外泌体中提取并纯化总RNA。使用Small RNA试剂盒(Agilent)，通过Agilent 2100生物分析仪分析了总外泌体RNA的产量，组成和质量。在RNA提取过程中，用合成的秀丽隐杆线虫miR-39(Qiagen)，作为RNA提取，逆转录和miRNA扩增的外部校准。

2.6RNA测序

使用总RNA 1μg制备测序文库，并用Nano Drop 8000(Thermo FisherScientific)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉)进行定量。通过使用15％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行电泳分离来纯化总RNA。将小RNA连接到腺苷酸化的3个衔接子上，退火后的衔接子具有独特的分子标识符，随后是5'衔接子的连接。随后，使用SuperScript II逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)将衔接子连接的小RNA转录为互补的脱氧核糖核酸(cDNA)。接下来，进行PCR扩增以富集cDNA片段。用PAGE凝胶纯化PCR产物，并溶解在溴化乙锭溶液中。通过Agilent Technologies 2100生物分析仪确认双链PCR产物，然后进行热变性并用夹板寡核苷酸序列环化。将单链环状DNA格式化为最终文库。该文库用phi29扩增以生成DNA纳米球，然后将其装载到图案化的纳米阵列上，并通过组合探针-锚合成法生成单端50个碱基的读数。使用BGISEQ-500平台(BGI，中国深圳)对最终的连接PCR产物进行测序。

2.7miRNA数据分析

原始测序数据根据以下程序进行处理：去除了低质量和5'-引物污染标签；其余标签被映射到参考基因组NCBI GRCh38和其他数据库，包括带有Bowtie2的miRbase。Rfam使用Cmsearch进行映射。miRDeep2通过探索二级结构预测了新的miRNA。通过使用独特的分子识别符计算分子的绝对数量来计算miRNA的表达水平。使用DEseq2进行差异表达分析。Q值<0.001和Log2Ratio的绝对值>1被用作确定表达差异的显着性的阈值。

2.8qRT-PCR分析

使用qRT-PCR证实了通过RNA测序改变的miRNA。使用NCode^TMVILO^TMmiRNA qRT-PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量miRNA的水平，并针对合成的cel-miR-39-3p(Thermo Fisher Scientific)进行标准化。在三个独立的实验中，所有qRT-PCR反应均一式三份进行。2-AACt方法用于定量miRNA水平。

2.9试验研究结果

在一项相对较小的样本(数据集1)的预实验中，RNA测序结果显示患有AD和对照的受试者血液中有853个miRNA。读数计数低于100的miRNA被排除在后续分析之外。选择患有AD的受试者与对照组之间的倍数变化大于1.2或小于0.83的那些miRNA作为具有显着差异的miRNA。最终，我们在AD组中发现了13个上调的miRNA和5个下调的miRNA(图4)。

实施例3：利用外泌体miRNA组合进行诊断

招募了一个相对较大的样本(数据集2)以评估在患有AD的受试者和对照组之间表达差异的miRNA。在初步研究中，所有13个上调的miRNA和5个下调的miRNA在数据集2中得到确认，这支持了测序数据的重要性。然后，我们进行了逻辑分析，以评估其性能，以区分患有AD的受试者和对照组。总共包括18个miRNA作为协变量，诊断(AD或对照)作为因变量。在调整了年龄，性别，受教育年限和APOEε4基因型后，发现六种miRNA(上调：miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p和miR-485-5p；下调：miR-138-5p和miR-342-3p)与AD相关(图3A-C)。年龄，性别和受教育年限在logistic模型中显示P值>0.05，因此不再进行进一步分析。我们进行了分析，以估计受试者中六种miRNA之间的多重共线性。所有公差均>0.1，方差膨胀因子(variance inflation factors,VIF)<10，特征值>0，条件指数<30，表明这六种miRNA之间没有显着的多重共线性。使用logistic分析中的预测值，通过接受者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析评估了单独或与APOE基因型结合使用的6个miRNA组合的诊断能力。我们的数据显示，六种miRNA组合本身(AUC＝0.910，P＝2.6x10^-22，图5G)和结合APOE基因型的六种miRNA组合(AUC＝0.926，P＝2.2x10^-24，图5H)的曲线下面积(AUC)值都非常高，表明单独使用6种miRNA组合或结合APOE基因型可以成功地区分患有AD的受试者和对照组。此外，还独立分析了APOE基因型的ROC曲线，显示AUC为0.614(图5I)，表明仅APOE基因型并不是诊断AD的有效因素。我们还检查了单个miRNA的诊断能力，结果显示较差的AUC(0.651-0.790，图6)，表明六种miRNA的组合对于获得有效的诊断是必要的。

实施例4：临床前AD的外泌体miRNA预测模型

我们推测在临床前AD中外泌体miRNA水平可能会改变。因此，我们测量了数据集3中的六种miRNA的水平，包括认知障碍症状发作前5到7年的临床前AD患者。我们的数据表明，与数据集2中的发现一致，miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p和miR-485-5p被上调，而miR-138-5p和miR-342-3p被下调(图7)。更重要的是，逻辑分析表明，六种miRNA组合与临床前AD有关。从逻辑分析生成的预测值用于建立ROC曲线。如预期的那样，我们的数据显示出显着较高的AUC值(仅6个miRNA组合：AUC＝0.852，P＝4.2x10^-18，图8A；6个miRNA组与APOE基因型组合：AUC＝0.876，P＝2.1x10^-20，图8B)。单独的APOE基因型的ROC分析显示AUC为0.615(图8C)，表明仅APOE基因型不能预测临床前AD。这些数据表明，六种miRNA组成的组合可以在认知障碍发生之前的5-7年的无症状阶段预测临床前AD。我们还分析了单个miRNA的ROC曲线，数据显示出较差的AUC值(0.581-0.690，图9。数据集3随机分为训练(总计0.67)和测试(总计0.33)数据集，并且在训练数据集中生成了预测模型并将其应用于测试数据集。六种miRNA组合在训练数据集(图8D)的AUC分别为0.852，在测试数据集为0.847(图8E)，六种miRNA组合结合APOE基因型在训练数据集的AUC为0.876(图8F)，在测试数据集为0.874(图8G)。为了进一步确认预测模型，我们纳入了数据集4。与数据集3中的发现类似，基因突变型患者的六种miRNA中的每种miRNA水平都发生了变化(图10A-F)。我们将临床前AD数据集生成的6种miRNA组合的预测模型应用于家族性AD(FAD)，发现AUC为0.862(图10G)，表明该预测模型在FAD突变携带者中具有较高的性能。还分析了单个miRNA的ROC曲线，数据显示出较差的AUC值(0.599-0.669，图11)。因此可以认为，由六种外泌体miRNA(miR-29c-5p,miR-143-3p,miR-335-5p,miR-485-5p,miR-138-5p,miR-342-3p)组合构建的预测模型，有助于认知障碍发生之前5至7年对AD进行预测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 一种预测神经退行性疾病风险的试剂盒及其用途

<130> IDC210031

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ugaccgauuu cuccuggugu uc 22

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ugagaugaag cacuguagcu c 21

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

agaggcuggc cgugaugaau uc 22

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

agcugguguu gugaaucagg ccg 23

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ucucacacag aaaucgcacc cgu 23

Claims

1.用于确定生物样品中由miR-29c-5p，miR-143-3p，miR-335-5p，miR-485-5p，miR-138-5p和miR-342-3p组成的生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预测受试者在5-7年内发生阿尔茨海默病(AD)的风险。

2.权利要求1的用途，其中，所述试剂盒包含用于确定受试者的miR-29c-5p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-335-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-138-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-342-3p水平的第六试剂或试剂组合。

3.权利要求1或2所述的用途，其中，所述试剂通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

4.权利要求3所述的用途，其中，所述杂交技术选自Northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法。

5.权利要求4所述的用途，其中，所述试剂盒具有下列特征：

(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-29c-5p的水平的引物和/或探针；

(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针；

(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-335-5p水平的引物和/或探针；

(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针；

(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-138-5p的水平的引物和/或探针；

(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-342-3p的水平的引物和/或探针。

6.权利要求5所述的用途，其中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。

7.权利要求6所述的用途，其中，所述用于捕获生物标志物的工具位于尼龙膜或微球上。

8.权利要求1或2所述的用途，其中，所述试剂通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

9.权利要求8所述的用途，其中，所述扩增技术选自qPCR，RT-PCR，Stem-loop PCR，PolyA PCR，RCA，测序。

10.权利要求9所述的用途，其中，所述试剂盒具有下列特征：

11.权利要求10所述的用途，其中，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂。

12.权利要求11所述的用途，其中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

13.权利要求12所述的用途，其中所述酶为核酸聚合酶。

14.权利要求12所述的用途，其中，所述离子为Mg²⁺。

15.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoE基因型的第七试剂。

16.权利要求15所述的用途，其中，所述第七试剂为检测ApoE基因型的引物和/或探针。

17.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。

18.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

19.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品包含外泌体。

20.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

21.权利要求20所述的用途，其中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

22.权利要求17所述的用途，其中，所述受试者为人。