CN110249061A - 与阿尔茨海默病风险相关的apoe启动子单核苷酸多态性及其用途 - Google Patents

与阿尔茨海默病风险相关的apoe启动子单核苷酸多态性及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可用于阿尔茨海默病风险预测的单核苷酸多态性(SNP)。SNP是rs405509，基于人类基因组图谱GRCh38.p7位于染色体19,44905579上。本发明提出rs405509的T等位基因起到进一步增加APOE E4/E4痴呆风险的作用。APOE基因型之间的大脑皮层厚度和海马体积比较结果表明，亚洲人E4/E4的收缩大于E3/E3。在具有E4/E4基因型的高加索人中，具有rs405509T/T基因型的人的大脑皮质更严重地萎缩。因此，本发明能够确认rs405509T/T多态性以及APOE E4/E4，因此可用于阿尔茨海默病和/或阿尔茨海默病所致痴呆的诊断或风险预测。

Description

与阿尔茨海默病风险相关的APOE启动子单核苷酸多态性及其 用途
技术领域
本发明涉及用于早期诊断阿尔茨海默病和预测阿尔茨海默病风险的单核苷酸多态性。此外，本发明涉及使用单核苷酸多态性的早期诊断阿尔茨海默病和预测阿尔茨海默病风险的方法。本发明基于通过执行研究阿尔茨海默氏症痴呆特异性脑损伤的任务和基于MRI构建脑图而获得的结果，其已得到韩国的科学、信息和通信技术及未来规划部的脑科学源技术开发项目的支持。
背景技术
阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其特征在于大脑中的认知衰退和老年斑块。阿尔茨海默病是老年人痴呆症的最常见原因，占老年痴呆症的60％至80％(Barnesand Yaffe，2011)。据估计，约有13％的65岁或以上的老年人和约45％的85岁或以上的老年人患有阿尔茨海默病。阿尔茨海默病(AD)是一种复杂的神经退行性疾病，不仅会引起记忆丧失和其他认知障碍，还会引起大脑的结构变化(Ballard等，2011；Forero等，2006)。AD患者在后扣带皮质层(posterior cingulate cortex，PCC)，内侧前额叶皮层和脑中的海马体中表现出增加的淀粉样蛋白斑块，并且海马体积减少。此外，患者表现出CSF中tau和p-tau水平升高和β-淀粉样蛋白水平降低(Jack，2012；Trojanowski等，2010)。
阿尔茨海默氏痴呆的治疗剂正在开发中，但直到现在还没有值得关注的治疗剂。因此，非常需要阿尔茨海默氏痴呆的早期诊断和早期预测。作为诊断阿尔茨海默氏痴呆的技术，有人提到了神经心理学测试，MRI脑成像测试，专家意见的临床诊断，通过脑脊液和基于氟比他班(florbetaben)的淀粉样蛋白-PET的病理学测试等。临床诊断可以诊断痴呆症或轻度认知障碍的发作，但可能存在难以将其与其他脑部疾病区分开的情况。临床诊断不适合早期诊断的目的，因为只有在症状出现后才能进行诊断。通过定量分析(例如β淀粉样蛋白和tau蛋白的分析)进行脑脊液试验，因此是痴呆的可靠诊断措施。然而，由于侵入性脑脊液收集，受试者非常抗拒该测试。通过淀粉样蛋白-PET的病理学测试是可靠但昂贵的。在MRI脑成像的情况下，正在开发用于研究与痴呆相关的脑损伤，例如大脑皮质萎缩和海马萎缩以及用于早期诊断的技术，但是目前已知不在早期时间点进行诊断。此外，正在积极开发通过血液诊断痴呆症的技术。然而，实验的群体规模和准确性存在限制，因此临床使用需要验证可靠性。
在遗传因素中，淀粉样蛋白前体蛋白，早老素-1和早老素-2是由于家族史导致阿尔茨海默病早期发作的主要因素(Blennow等，2006；Hardy和Selkoe，2002)。在APOE中，e4等位基因是散发性阿尔茨海默病迟发的最强风险因素(Bu，2009；Corder等，1993；Huang和Mucke，2012)。从全球的角度来看，APOE基因有三种多态性，即e2，e3和e4，频率分别为8.4％，77.9％和13.7％(Farrer等，1997)。阿尔茨海默病中e4的频率显着增加至约40％(Farrer等，1997)。APOE位于19号染色体的长臂(19q13.2)。APOE有三个等位基因，即e2，e3和e4，它们是由于氨基酸位置112(Cys/Arg)和158(Arg/Cys)的变化而形成的，由三个等位基因的组合引起6个基因型(E2/E2，E2/E3，E3/E3，E2/E4，E3/E4，E4/E4)多态性。其中，APOEe4通常在50％或更多的AD患者中发现。然而，APOE e4仅在不到15％的认知正常对照中发现(Ward等，2012)。先前的研究已经报道，APOE e4可以将AD的发作时间缩短5至15年(Corder等，1993；Gomez-Tortosa等，2007)。此外，已经报道了APOE e4对认知能力下降的影响。然而，一些研究报道APOE e4降低了认知能力；另一方面，其他研究报道APOE e4对认知能力下降没有影响，还有其他研究结果提示APOE e4缓慢降低认知能力(Anstey和Christensen，2000；Beaudreau等，2013；Caselli)等人，2009；Craft等人，1998；Deary等人，2002；Jorm等人，2007；Kleiman等人，2006；Mayeux等人，2001；Van Gerven等人，2012)。尽管这些结果仍需讨论，但具有APOE e4纯合子的健康个体表现出海马体积减少，而在健康老年组中，具有APOE e4杂合子的健康个体与非e4携带者无差异(Crivello等，2010；Farlow等.，2004；Lemaitre等.，2005)。此外，在健康老年人中，APOE e4显示与轻度认知障碍转变为阿尔茨海默病有关(Wang等.，2011)。据报道，e4等位基因的风险因种族而异(Brainerd等，2013；Farrer等，1997；Heun等，2010；Hsiung和Sadovnick，2007；Hsiung等，2004；Rose，2005)。然而，即使在基于APOE e4进行预测的情况下，也只能对痴呆的遗传影响程度的20％内作出解释。因此，e4介导的阿尔茨海默病风险和可能诱导剂仍然不清楚。另一方面，韩国专利号10-1335021描述了患有阿尔茨海默病或轻度认知障碍的患者与APOE rs405509的T/G杂合性之间的关联。
因此，本发明人不仅研究了APOE E4遗传变异，而且还研究了APOE基因周围可能影响APOE E4对痴呆的风险的遗传变异。此外，在APOE E4/E4纯合子的情况下，本发明人已经确定痴呆风险存在种族差异，并且意图分析其原因。结果，本发明人已经出乎意料地确定位于APOE启动子中的单核苷酸多态性不仅解释了APOEE4/E4纯合子的痴呆风险的种族差异，而且大脑皮质厚度也根据等位基因而变化。此外，本发明人通过分析大脑皮质厚度和海马体积已经确定了APOE多态性对脑结构的影响。
发明内容
技术问题
本发明的个目的是提供用于预测阿尔茨海默氏病和/或阿尔茨海默病所致痴呆风险的单核苷酸多态性(SNP)遗传变异。
本发明的另一目的是提供通过检测单核苷酸多态性(SNP)遗传变异来预测阿尔茨海默氏病和/或阿尔茨海默病所致痴呆风险的方法。
问题的解决方案
本发明提供了单核苷酸多态性(SNP)，其可用于预测阿尔茨海默病和/或由阿尔茨海默病所致痴呆风险。更具体地，基于人类基因组图谱GRCh38.p7版，SNP是rs405509，其位于染色体19上44905579，并且其等位基因是T和G。该SNP在次要等位基因频率(MAF)中显示种族差异。
在本发明的实施方案中，本发明通过从分离自受试者的样品(例如细胞、组织、血液或体液)中分离和纯化基因组DNA，并分析和鉴定APOE启动子rs405509单核苷酸多态性和APOE基因型来预测痴呆的风险。。
在本发明的另一个实施方案中，提供了使用APOEε遗传变异(rs429358和rs7412)和rs405509遗传变异来提供关于预测阿尔茨海默氏痴呆的信息的方法。
在本发明的另一个实施方案中，提供了诊断或预测轻度认知障碍或阿尔茨海默病(AD)的风险的方法，所述方法检测从受试者分离的含核酸样品中指示轻度认知障碍或阿尔茨海默病的遗传变异，所述方法包括(a)使样品与能够检测基因中遗传变异的存在或不存在的试剂接触的步骤，所述基因选自编码APOEE4等位基因的基因或其基因产物；和(b)使样品与能够检测遗传变异的存在或不存在的试剂接触的步骤，所述遗传变异选自编码APOE启动子的rs405509T等位基因的基因或其基因产物，其中APOE E4/E4和rs405509T/T遗传变异的存在表明受试者是患有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的患者，或具有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的高风险。这里，预测风险的方法可以通过扩增从受试者分离的核酸来进行，并且核酸可以是基因组DNA或RNA。
在本发明的又一个实施例中，该方法还包括获得受试者中大脑皮质厚度的图像(例如，磁共振(MR)脑图像)的步骤，其中大脑皮质厚度的萎缩可指示该受试者是患有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的患者，或具有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的高风险。
在本发明的又一个实施方案中，该方法可以进一步包括进行一项或多项测试的步骤，所述测试包括神经心理学测试，脑脊液(CSF)测试和淀粉样蛋白-PET测试。
在本发明的一个实施方案中，检测遗传变异的存在或不存在的方法是这样一种方法，其中从分离自受试者的样品中获得的单链形式核酸与互补引物组形成复合物，然后分析复合物中遗传变异的存在或不存在。可以使用聚合酶链反应、核酸酶消化、杂交、Southern印迹、限制酶片段多态性、测序、引物延伸或单链构象多态性，或使用它们的组合来分析复合物中遗传变异的存在或不存在。
在本发明的又一个实施方案中，提供了用于诊断或预测轻度认知障碍或阿尔茨海默病的试剂盒，该试剂盒能够检测基因中遗传变异的存在或不存在，所述基因选自编码APOE E4等位基因的基因或其基因产物，其中试剂盒可以进一步包括编码APOE启动子的rs405509T等位基因的基因或其基因产物。因此，在本发明的一个实施方案中，试剂盒可以是包含引物组和反应酶的试剂盒，所述引物组与APOE的单核苷酸多态性APOE E4和APOE启动子单核苷酸多态性rs405509T/T，T/G和GG互补。
本发明中的基因产物是由基因表达产生的产物，并且应理解为包括RNA，例如tRNA，mRNA，rRNA，miRNA和siRNA，多肽和蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，试剂盒可以是包括用于分析遗传变异的分析方法，用于扩增核酸的方法或参照对照的试剂盒。
在本发明的另一个实施方案中，提供了互补引物对，其能够检测基因的遗传变异的存在或不存在，所述基因选自编码APOE E4等位基因的基因或其基因产物，编码rs405509T等位基因的基因或其基因产物可以一起提供。因此，在本发明的一个实施方案中，引物组可以是与APOE的单核苷酸多态性APOE E4和APOE启动子单核苷酸多态性rs405509T/T，T/G和GG互补的引物组。
在本发明的另一个实施方案中，引物组可以是其上附着有标记物，例如放射性同位素、荧光团或化学衍生物的引物组。
发明的有益效果
根据本发明，除了APOE基因型，通过研究遗传变异rs405509，特别是APOEE4/E4作为散发性阿尔茨海默氏痴呆的预测性遗传变异可以更准确地诊断阿尔茨海默氏痴呆的风险。
附图简述
图1显示了筛选调节APOE e4/4风险的多态性候选物的策略(图1A)。图1B示意性地说明了APOE的基因结构。在图B中显示了rs449647(-491A/T)、rs405509(-219T/G)、rs440446(+113G/C)、rs429358和rs7412的SNP。图1C说明通过评估rs405509、rs449647、rs440446的基因型频率的分布获得的结果，其涉及来自东亚、高加索和非洲血统的全病例监管受试者(wholecase-regulated subject)或e4纯合子。这里，基因型频率被计算为每种情况下的平均频率和对照。
图2显示了东亚人和高加索人皮质厚度减少的图(图2A)。通过应用通用线性模型，并使用APOE e4/4和e3/3作为静止因子，以及年龄、性别和场强作为协变量来估计皮质厚度的逐点差异。数字代表统计学差异(p<0.05)。黑色圆圈表示内侧嗅觉和海马旁区域的脑萎缩，红色圆圈表示前躯区域的脑萎缩(图2A)。根据东亚人和高加索人的APOE基因型，比较内侧颞叶皮质(内侧嗅觉和海马旁区域)(图2B)和楔前叶(图2C)中的平均皮质厚度。将数据标准化为e3/3并表示为％，误差条具有95％置信区间。柱状图是通过比较东亚人和高加索人中APOE基因型之间的海马体积而获得的结果(图2D)。
图3显示了rs405509T-等位基因降低APOE蛋白的表达。将人血清与抗APOE和抗转铁蛋白(TF)一起进行蛋白质印迹，以检测APOE蛋白的rs405509依赖性血清表达(图3A)。在APOE e3/3纯合子中选择血清样品用于rs405509(G/G，G/T和T/T)基因型。柱状图显示APOE表达的相对强度(图3B)。GG基因型用作参考。转铁蛋白(TF)用作标准化对照。数据是平均值±SEM(*p<0.05，***p<0.001)。
图4显示了亚洲人对APOE e4/4介导的阿尔茨海默病发病的易感性。对于阿尔茨海默病，比较不同种族之间APOE e4/4相对于e3/3的比值比。柱状图表示基于临床诊断的阿尔茨海默病(图4A)和神经病理学鉴定的系列(图4B)的e4/4的比值比。*数据集通过逻辑回归分析，是引用先前研究结果。
实施本发明的最佳方式
在本发明中，本发明人通过大规模研究分析了不同种族群体对APOE e4介导的AD的易感性。因此，与高加索人和非洲人的血统相比，在东亚人中e4纯合子更容易患阿尔茨海默病。此外，本发明人通过对神经病理学诊断为阿尔茨海默病的患者和对照的关联研究鉴定了这种种族差异。少数先前的研究报道了不同群体中不同的APOE e4等位基因分布(Farrer等，1997；Singh等，2006)。e4等位基因的频率的顺序从高到低为非洲、欧洲和亚洲，这与阿尔茨海默病的e4风险顺序相反。
据报道，APOE e4促进了内嗅皮质、海马旁皮质和楔前叶皮质厚度的减少(Donix等，2010；Foley等，2016；Thompson等，2011)。另一项关于认知正常受试者的研究表明，具有e4的个体的皮质厚度也有所减少(Fouquet等，2014)。此外，具有e4等位基因的个体在海马中表现出严重的萎缩，而海马在记忆功能和记忆障碍中起重要作用(Alexopoulos等，2011)。在本发明中，本发明人发现与APOE e3纯合子相比，APOE e4纯合子与东亚人和高加索人的内嗅皮层、海马旁皮质和前躯区的皮质厚度严重减少以及海马萎缩相关。该结果与先前的研究一致(Donix等人，2010；Foley等人，2016；Thompson等人，2011)。令人惊讶的是，已经确定在e4/4受试者中观察到的这些皮质和海马萎缩在东亚人中比在高加索人中更严重。本发明表明，与高加索人相比，具有APOE e4/4的东亚人患阿尔茨海默病的风险增加，并且脑中皮质厚度减少和海马萎缩。
本发明人假设群体中e4/4介导的AD的风险差异是由于遗传背景中的种族差异，特别是APOE基因周围的多态性。APOE e4不是与阿尔茨海默病相关的唯一APOE多态性。据报道，APOE启动子和内含子区域内的多态性调控APOE e4对AD发病的影响(Bertram等，2007；Lambert等，2002；Lambert等，1998b；Lescai等，2011)。评估了启动子中的两个SNP(rs449647和rs405509)和内含子中的一个SNP(rs440446)对调控APOEε变化对阿尔茨海默氏病的影响。据报道，-491AA和219TT基因型不依赖于APOE epsilon基因型增加AD风险(Lambert等，2002；Lambert等，1998a；Lambert等，1998b；Limon-Sztencel等，2016；Wang等，2000)。此外，据报道rs405509与APOE e4在影响认知能力方面具有协同作用(Ma等，2016)。本发明人已经分析了这些SNP在不同种族群体中表现出不同的等位基因频率。本发明人已经确定，在这些SNP中rs405509的情况下，与高加索人和非洲人血统相比，包括韩国人和日本人在内的东亚人在总人口和e4纯合子携带者中携带更高频率的rs405509-T，这是风险等位基因。这支持了与其他种族群体相比，e4纯合子在东亚人中具有很高的阿尔茨海默病风险。同样，已经确定与非洲血统相比，高加索人具有较高的rs405509-T等位基因频率，而与非洲血统相比，高加索人也具有较高的e4/4纯合子比值比。
几项神经影像学研究报道了APOE e4纯合子对脑萎缩的影响；然而，APOE启动子多态性的作用尚未明确阐明。以前的研究报道了中国人群中非痴呆相关衰老过程中，APOE启动子区中的rs405509多态性对人大脑的影响。已经发现，与具有rs405509G等位基因的个体相比，具有rs405509-TT和APOE e4的个体表现出年龄依赖性的皮质厚度的萎缩(Chen等人，2015a)。本发明人发现，与e4纯合子中具有G等位基因的个体相比，具有rs405509-TT基因型的个体与阿尔茨海默病高度相关并且导致皮质厚度和海马体积强烈萎缩。特别地，在内侧颞叶皮层(内嗅和海马旁区域)和楔前叶中观察到这种皮质厚度减少的模式，并且海马旁区域的萎缩与先前的研究相似(Chen等，2015a)。本发明人已经发现在具有APOE e4纯合子和rs405509-TT的个体中，内嗅皮质，海马旁皮质和前躯区中的皮质厚度严重减少以及海马萎缩。在本发明中，本发明人已经确定阿尔茨海默病的种族差异和e4/4介导的脑萎缩的风险是由于rs405509多态性的种族多样性。
此外，本发明人已经证明rs405509-TT诱导人脑和血清中APOE的表达降低。在使用rs405509T或G等位基因的等位基因取代的报告基因测定中，本发明人已经证明在启动子中具有rs405509-T等位基因的APOE基因表达较低，表明含有rs405509-T的风险是由于APOE蛋白降低。
如上所述，本发明人已经确定东亚人中的APOE e4纯合子比白种人和非洲血统更容易患阿尔茨海默病。种族群体之间APOE启动子多态性的不同等位基因频率将使具有APOEe4的个体对阿尔茨海默病的发病的易感性不同。鉴于rs405509与APOE蛋白水平的调节的相关性，表明具有rs405509-TT的e4APOE个体中APOE水平降低诱导阿尔茨海默病的风险增加。
发明模式
在下文中，将通过实施例描述本发明。以下实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不限于此。
材料和方法
(1)样品和数据
在本发明中，利用了全长基因组信息、MRI脑图像信息和临床诊断信息。对于痴呆队列中的2,075名研究对象(主要来自朝鲜大学医院和其他合作医院；正常受试者的平均年龄：73.45±5.30(平均值±SD))，阿尔茨海默病患者的平均年龄：71.65±5.65(平均值±SD)，正常人中女性的比例：62.4％，阿尔茨海默病患者中女性的比例：61.5％)，使用血液获得全长基因组信息，并通过MRI扫描获得各研究受试者的脑图像信息(3T MRI，Skyra，西门子)。每个研究受试者都进行了诊断痴呆所必需的神经心理学测试(K-MMSE和首尔神经心理学筛查测试(Seoul Neuropsychological Screening Battery，SNSB))。因此，由痴呆临床专家作出正常，轻度认知障碍或痴呆的诊断。诊断结果显示1,145名受试者正常，930名受试者为痴呆患者。此外，还使用了韩国光州国家痴呆症研究中心(NRCD)的数据库。本发明的所有实验和研究方案均由朝鲜大学医院的董事会批准。所有志愿者和患者亲属均提交了在参与实验前准备的书面同意书。东亚受试者包括2,309名认知正常个体和1,886名AD患者。高加索人的基因组来自阿尔茨海默病神经影像学方案(Alzheimer’s Disease NeuroimagingInitiative，ADNI；http://adni.loni.usc.edu/)数据库，高加索人的脑图像也是从ADNI数据库获得的。高加索人由515名正常人和320名AD患者组成。
AD的临床诊断根据国家神经和交流障碍研究所和中风/阿尔茨海默病和相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)的AD评估标准进行(McKhann等，1984b)。根据目前认可的标准诊断轻度认知障碍(MCI)(Winblad等，2004)。认知正常组是没有神经系统疾病，没有认知功能障碍或日常生活中没有问题的组。作脑部MRI时，排除有局部病变、头部创伤史或可能影响其智力的精神疾病的受试者。包括具有轻度医学异常(例如，原发性高血压、无严重并发症的糖尿病或轻度听力损伤)的受试者。
对于用于rs405509风险(比值比)的高加索人基因组，使用来自国家衰老研究所-晚期阿尔茨海默病(NIA-LOAD)、阿尔茨海默病国家细胞库(NCRAD)和阿尔茨海默病神经影像学方案(ADNI)的数据集。组合并分析两个数据集或三个数据集。使用具有E4/E4基因型的个体中的APOE启动子单核苷酸。在组合和分析NIA-LOAD、NCRAD和ADNI的情况下，具有E4/E4基因型的个体总共395个，其中330个是阿尔茨海默氏痴呆患者，65个是正常受试者。
(2)脑淀粉样成像
根据常规方法进行18F-氟比他班PET成像(Osama Sabri，2015，ClinTrans1Imaging，Barthel，2011，Lancet_neurology)。通过脑淀粉样蛋白-β斑块负荷(BAPL)评分确定淀粉样蛋白病理学特性。根据设定区域皮质示踪剂摄取(RCTU)评分系统(1＝无摄取，2＝轻微摄取，3＝显著摄取)评估四个大脑区域(额叶皮层，后扣带，颞侧皮质和顶叶皮层)的氟比他班(18F)PET图像。接着，利用单个预设的3级评分系统，通过脑淀粉样蛋白-β斑块负荷(BAPL)评分(1＝无淀粉样蛋白负荷，2＝轻微的淀粉样蛋白负荷，和3＝显著的淀粉样蛋白负荷)总结了每次PET扫描的额叶皮层，后皮质，颞侧皮质和顶叶皮层的RCTU评分。，使用匹兹堡化合物B(PiB)用正电子发射断层扫描(PET)进行体内淀粉样蛋白成像。使用FreeSurfer版本5.1软件(马蒂诺生物医学造影中心，Martinos Center forBiomedical Imaging)确定PiB沉积到脑中的感兴趣区域(ROI)，并且针对每个感兴趣区域计算针对部分体积效应校正的标准化摄取值比率(SUVR)。通过FreeSurfer计算额叶皮层、后皮质、颞侧皮质和顶叶皮质区域的平均大脑皮质SUVR。小脑皮质用作参考区域。PiB阳性被定义为1.42的SUVR，对应于之前已经定义为PiB阳性的0.18的平均大脑皮质结合潜力。高加索人的18F-氟比他班和11C-PiB的淀粉样蛋白-PET数据来自ADNI数据库(http://adni.loni.usc.edu)。
(3)数据生成和分析
SNP基因分型
从在EDTA管中收集的全血细胞分离的外周血白细胞中提取基因组DNA。将血液样品以1500μg离心10分钟以除去血浆，并将血液白细胞用于DNA提取。使用针对韩国人优化的安飞世全基因组基因分型阵列(AxiomKORV1.0)对样品进行基因分型。KORV1.0由韩国国立卫生研究院的基因组科学中心设计，并从韩国芯片协会获得。此外，通过Taqman或SNP型(Fluidigm)方法进行基因分型分析以评估基于芯片的SNP基因分型的准确性。ADNI的基因分型数据来自ADNI数据库(http://adni.loni.usc.edu)。
全基因组数据填补(Genome-wide data imputation)
来自NRCD的研究数据由6,413个人组成。来自ADNI的数据集由来自ADNI-1数据集的818个个体，来自ADNI-GO/2数据集的432个个体和来自ADNI-WGS数据集的818个个体组成。样本的质量控制包括个体呼叫率<95％，性别错配，杂合性(平均值±3SD)，冗余或双胞胎，呼叫率<95％的SNP，HWEP值<10-6的SNP，MAF<1％。使用HRC参考组1.1版分别插补每个数据集。通过选择东亚人作为参考群体，同时进行来自NRCD的HRC插补与预分阶段研究单倍型。对于ADNI数据集，通过选择HRC插补服务器中的欧洲人作为参考群体，连同预分阶段研究单倍型一起单独进行插补。在插补后，将低质量插补的SNP(信息<0.5)被排除在进一步研究之外(McCarthy等，2016；Nagy等，2017；Surakka等，2016)。
(4)成像协议
韩国受试者的MR图像采集
对于2,443名韩国受试者，使用1.5T MR扫描仪(Magnetom Avanto，西门子公司)获得了整个脑中近0.9mm轴向磁化制备的快速梯度回波(MPRAGE)图像(TR＝1800ms；TE＝3.43ms；TI＝1100ms；15翻转角；FoV＝224×224；矩阵＝256×256；切片数＝176)。使用3TMR扫描仪(Skyra，西门子公司)获得接近0.8mm的矢状MPRAGE体积(TR＝2300ms；TE＝2.143ms；TI＝900ms；9翻转角；FoV＝256×256；矩阵＝320×320；切片数＝178.体积)。所有图像均使用韩国光州朝鲜大学医院的MR扫描仪获得。
来自ADNI的MR图像
从ADNI数据库(ADNI，http：//adni.loni.usc.edu/)下载来自463名认知正常受试者，796名轻度认知障碍受试者和310名AD患者的基线1.5T和3TMR图像。根据标准ADNIMPRAGE协议，使用1.5T或3T GE，飞利浦和西门子设备获取受试者的所有MR图像。对于1.5T扫描仪，MPRAGE协议的标称参数如下：矢状面，TR＝2300至2400ms，用于多线圈相控阵头部线圈(TR＝3000ms，用于鸟笼或体积头线圈)，最小全TE，TI＝1000ms，翻转角8°，FOV＝240×240mm，192×192面内矩阵和1.2mm切片厚度。对于3T扫描仪，MPRAGE协议的标称参数如下：矢状面，TR＝2300或3000ms，最小全TE，T1＝853至900ms，翻转角8°至9°，FOV＝256至260×240mm，256×256面内矩阵和1.2mm切片厚度(Jack等.，2008)。基于MMSE的20至26分(Burns等，1998)和CDR＝0.5或1(Morris，1993)，AD受试者包括在内。此外，选定的AD组符合NINCDS/AARDA标准，该标准是可能AD的标准。对于健康对照，包括CDR 0且无痴呆的个体(Wolz等，2011)。
(5)图像数据处理和分析
MR图像数据处理
使用用于脑结构分析的公共领域软件FreeSurfer软件(FreeSurfer5.3.0)(FreeSurfer，http：//surfer.nmr.mgh.harvard.edu/)进行图像处理(Dale等，1999；Fischl和Dale，2000；Fischl等，2004)。在用于FreeSurfer处理的自动化管道中使用DICOM格式MR图像，构建了脑皮质表面的三维模型(Dale等人，1999；Dale和Sereno，1993；Fischl等人，1999a)。在处理中，将图像的强度归一化并从标准化图像中去除颅骨。接着，使用连通分量算法启动皮质下分割处理，并且填充所发现的任何孔以代表两个大脑皮质半球的白质的单个填充体积。此外，通过镶嵌和表面摩平减少了任何度量失真。接着，执行细化处理以创建灰/白质边界，然后执行初始表面模型构造。接着，表面向外变形以形成软膜表面。首先，计算从灰质/白质表面上的每个点到软膜表面的最短距离，并计算从软膜表面上的点到灰质/白质的最短距离，从而测量大脑皮层的厚度。接着，从特定点处的这两个值的平均值获得最终皮质厚度。测量每个半球中163,842个顶点的皮质厚度，其中距离皮质幔内的任何点或另一个位置约1mm的三角形网格代表顶点。通过用0mm，5mm，10mm，15mm，20mm和25mm全宽度-半最大高斯核磨平图并通过非刚性高维球面平均法获得受试者的平均值来调整皮质折叠图案。调整后的图甚至可以检测到受试者之间mm或更小的差异，并且不受体素分辨率的限制。另外，通过使用FreeSurfer的自动体积测量方法获得皮下体积(Dale等，1999；Fischl和Dale，2000；Fischl等，1999b)。
(6)图像统计分析
使用MATLAB(R2012a，The Mathworks，纳蒂克，马萨诸塞州，美国)的Surfstat(http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/)工具箱统计分析具有不同APOE等位基因的组之间皮质厚度的差异。本发明人统计测试了软膜表面上的每个未掩蔽点。使用APOE等位基因(e4/4 vs e3/3)作为固定因子，和性别、年龄、教育水平和场强作为协变量，使用通用线性模型(GLM)确定皮质厚度的逐点差异(Fan等.，2010)。为了评估rs405509等位基因差异，将具有T/T-E4/4和G/T-e4/4+G/G-e4/4单倍型的受试者与具有e3/3的受试者分开比较。在rs405509的GLM中，本发明人通过使用APOE等位基因(rs405509-e4/4单倍型相对于e3/3)作为固定因子，和性别、年龄、教育水平和场强度作为协变量确定了皮质厚度的逐点差异(Chen等.，2015b)。在所有皮质厚度分析中，基于随机场理论(RFT)的多点逐级皮质厚度比较的校正应用于聚类水平，并且通过错误发现率(FDR)校正值p<0.05的簇被认为是显著的(Taylor和Adler，2003)(http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/)。此外，对于携带APOE等位基因的组，使用R程序(R版本3.3.1)对海马体积和感兴趣的解剖区域进行统计学比较。使用APOE等位基因(e4/4 vs e3/3，rs405509-e4/4单倍型与e3/3)作为固定因子，性别，年龄，教育水平，诊断和颅内容积(ICV)作为协变量，使用协方差分析(ANCOVA)评估海马体积的差异(Hickie等，2005；Zierhut等，2013)。接着，使用年龄，性别，教育水平和诊断作为协变量比较不同组(e4/4 vs e3/3，rs405509-e4/4单倍型与e3/3)之间的感兴趣区域(ROI)的差异。在分析中，在p<0.05时考虑显著性水平；如果FDR校正处于p<0.05的水平，则结果被认为是显著的(Stricker等，2013；Ye等，2016)。
(7)统计分析
通过卡方检验比较对照组和AD组中的受试者比例。事件的比值比使用逻辑回归分析计算，调整后的(性别和年龄)和未调整的分析均为95％置信区间(Basaria等，2010)。所有统计测试均使用SPSS(版本23.0)和R程序(版本3.3)执行。
(8)来自人血样的APOE基因的表达
蛋白质印迹
首先，从全血中回收血清(从NRCD获得)。根据稍作修改的制造商(AmershamBiosciences，皮斯卡塔韦，新泽西州)说明书进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。用PBS中的5％脱脂奶粉将膜封闭1小时，向其中加入0.1％吐温20，随后在室温下与一抗孵育1小时。如下稀释并使用一抗：1：1,000家兔抗APOE(D719N；Cell Signal ing)；1：1,000家兔抗转铁蛋白(ab109503；Abcam)。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗以1：5,000使用。用EZ-Western Lumi Plus(DoGen)测量免疫活性。
(9)报告基因检测
使用以下引物，从获自正常受试者和AD患者的血细胞的基因组DNA扩增APOE基因(位置1,983至+935)启动子区：正向，5'-GGGGTACCGAAAGCAGCGGATCCTTGAT3'(SEQ ID NO：1)；反向，5'-CCCCTCGAGCTTCCTGCCTGTGATTGGC3'(SEQ ID NO：2)。用KpnI和XhoI切割扩增的DNA，并连接到pGL3.basic载体(Promega)中。采用基于PCR的rs405509(219G/T)的定点诱变，使用以下引物进行G→T和T→G等位基因取代：T→G正向，5'-GAGGAGGGTGTCTGGATTACTGGGCGAG-3'(SEQ ID NO：3)；反向，5'-CTCGCCCAGTAATCCAGACACCCTCCTC3'(SEQ ID NO：4)；G→T正向，5'-GAGGAGGGTGTCTGTATTACTGGGCGAGG-3'(SEQ ID NO：5)；反向，5'-CCTCGCCCAGTAATACAGACACCCTCCTC-3'(SEQ ID NO：6)。使用PfuUltraHigh-Fidel ity DNA聚合酶(Agilent)进行测定。
(10)荧光素酶测定
将HEK 293T细胞在12孔板中培养。24小时后，使用TransFectin(商品名)脂质试剂，将含有0.25μg萤火虫荧光素酶报告基因的0.25μg pGL3(Promega)和0.25μgpCMV-β-半乳糖苷酶(Clontech)共转染细胞24小时。。用报告裂解缓冲液(Promega)裂解转染的细胞。使用GloMax(商品名)发光计(Promega)和Epoch微孔板分光光度计(BioTek)分别定量荧光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。将荧光素酶活性标准化为β-半乳糖苷酶活性。结果代表三个独立的实验。
(11)全长基因组信息
获得全长基因组信息如下：使用QIAGEN DNA mini试剂盒，使用从正常受试者、阿尔茨海默氏症的轻度认知障碍患者和被诊断为阿尔茨海默氏痴呆患者的血液中分离的血沉棕黄层来提取gDNA，然后量化。使用ND-1000分光光度计和Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒进行定量。接着，通过在琼脂糖1.0％三硼酸盐-EDTA(TBE；英杰公司)凝胶上进行电泳来检查DNA质量，然后对通过DNA质量控制的样品进行基于微阵列的基因分型。根据制造商的说明，使用来自安飞世的Axiom韩国芯片以获得各基因型的信息。对于尚未进行微阵列测定的SNP，通过插补法进行基因分型。Pl ink，EIGENSTRAT，Shapeit，impute2，GTOOL，EAGLETOOL和minimac3程序用于全长基因组插补，并且使用1000个基因组(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)作为参考组和Michigan插补服务器(https://imputationserver.sph.umich.edu/index.html)进行插补。
结果
APOE e4/4与阿尔茨海默病之间的关系
就与阿尔茨海默病的相关性而言，本发明人分析了东亚、高加索和非洲血统的不同种族群体中APOE变异的风险。在包括对照和临床诊断为阿尔茨海默病的患者的所有种族中，对照组和阿尔茨海默病患者组之间显示出APOE基因型和等位基因频率分布的巨大差异。这些结果在患有阿尔茨海默病组中具有e4的受试者中比在对照组中更为突出。尽管APOE e4是阿尔茨海默病的重要危险因素，但尚未发现e4介导的风险有种族差异。在使用临床诊断为阿尔茨海默病可能性较高的患者和正常对照的分析中，与高加索人相比，东亚人的e4/4受试者显示出非常高的比值比(东亚和高加索人的比值比分别为：e4/4＝33.40和15.86(表1)。在表1中，参考e3/3通过逻辑回归分析比值比。
[表1]
右栏代表先前的研究，其中列出了参考的比值比；ADNI数据集用于分析高加索人阿尔茨海默病的风险；§评估淀粉样蛋白负荷对NRCD受试者的神经病理学诊断；高加索人的淀粉样蛋白积聚来自ADNI。
这是一个非常令人惊讶的结果，e4/4介导的风险依赖于种族群体，并且风险在东亚人和高加索人的顺序中更高。本发明的结果与先前的研究一致，该研究分析了APOE基因型与阿尔茨海默氏病的相关性(表1)。下表2显示了基于临床诊断的阿尔茨海默病组和对照组中的受试者。
[表2]
*年龄等于或大于60岁至90岁以下的老人；对照的年龄是检查时的年龄；阿尔茨海默病组的年龄是发病年龄；§东亚人的数据集来自NRCD；高加索人的数据集来自ADNI。
为了鉴定e4/4介导的阿尔茨海默病发作的种族差异，本发明人使用来自韩国人和高加索人的神经病理学诊断数据集分析了它们之间的关联(表3)。
[表3]
*年龄等于或大于60岁至90岁以下的老人；Ab(-)表示淀粉样蛋白阴性，Ab(+)表示淀粉样蛋白阳性；对照组的年龄是检查时的年龄；§阿尔茨海默病组的年龄是发病年龄；东亚人是参与淀粉样蛋白PET扫描的韩国人；从ADNI获得用于淀粉样蛋白病理学的高加索数据集。
在两个种族中，在淀粉样蛋白阳性组中比在淀粉样蛋白阴性组中鉴定出更多的e4携带者(表4)。
[表4]
*Ab(-)表示淀粉样蛋白阴性受试者，Ab(+)表示淀粉样蛋白阳性受试者。
在一项关于APOE基因型与淀粉样蛋白积聚之间关联的研究中，与高加索人相比，韩国e4/4受试者显示出非常高的比值比(韩国人和高加索人的e4/4比值比分别为＝125.1和20.92)，这与临床诊断的受试者的结果一致(表1和5)。这些结果表明，东亚e4纯合子比其他种族群体更容易患阿尔茨海默病。
[表5]
*采用逻辑回归分析不同种族的APOE基因型与淀粉样蛋白基因神经病理学诊断之间的关系；e3/3用作参考基因型；根据性别和年龄调整比值比。
筛选APOE基因周围的多态性
据估计，在东亚，高加索和非洲血统中，种族不同的e4/4风险是由于APOE周围的遗传多态性所致。为了检查致病机制，本发明人筛选了APOE周围基因的40kb区域内的SNP，其与不同种族群体中的等位基因频率相关(图1A)。在跨越40kb的630个插补SNP中，根据标准选择72个SNP，即，诸如以东亚、高加索和非洲血统次序的等位基因频率的标准，或反之亦然。随后，本发明人根据与阿尔茨海默氏病和次要等位基因频率的显著相关性去除SNP而不调整APOE。结果，衍生出三个SNP，rs449647，rs405509和rs440446。这些多态性位于APOE启动子和内含子区域(图1B)。这些显示出东亚、高加索和非洲血统中等位基因(rs449647-A，rs405509-T和rs440446-G)频率的巨大差异(图1C)。其中，rs405509在种族群体中表现出显著差异(基于1000个基因组数据库，东亚，高加索和非洲血统的T等位基因频率分别为0.67,0.48和0.24)。特别是来自东亚人的e4纯合子的TT基因型为90.4％，而高加索人和非洲人的TT基因型分别为64.2％和21.3％，这表明rs405509等位基因频率的差异对于不同种族之间e4/4的AD发病易感性可能不同。rs449647和rs440446在不同种族群体中表现出不同的等位基因频率，但e4/4的频率在种族群体中差异不大。
rs405509与阿尔茨海默病之间的关联
为了检查rs405509的TT基因型是否在e3/4和e4/4中赋予阿尔茨海默病的高风险，本发明人测试了rs405509在e3/4和e4/4受试者中的相关性。正如预期的那样，rs405509-TT在来自NRCD数据集(东亚人)的3/4和e4/4受试者组中显示出非常高的比值比(表6)，表明e4/4风险的种族差异。在东亚人中具有高rs405509-TT频率的E4纯合子对阿尔茨海默病的易感性比高加索和非洲血统更高。
[表6]
参考rs405509-GT+GG基因型，在e3/4和e4/4基因型受试者中通过逻辑回归分析rs405509-TT基因型的比值比；NP是正常的人群对照；§AD是患有阿尔茨海默病的患者。
另外，为了鉴定rs405509对e3/4-和e4/4介导的阿尔茨海默病风险的影响，本发明人分析了e3/4和e4/4在其他rs405509基因型背景中的相关性，即rs405509-TT，GT和GG(表7)。结果，在NRCD和ADNI数据集中，e3/4和e4/4受试者对rs405509-TT基因型的比值比高于rs405509-G等位基因背景。
[表7]
*参考阿尔茨海默病的e3/3，APOE基因型e3/4和e4/4的比值比在相应的rs405509基因型数据集(rs405509-TT，rs405509-GT和rs405509-GG基因型)中通过逻辑回归分析。
APOE e4/4与脑萎缩之间的关系
为了确定在APOE e4/4介导的脑萎缩中是否表现出种族差异，本发明人通过通用线性模型对东亚人和高加索人的e4/4和e3/3受试者进行逐点皮质厚度分析。在东亚人和高加索人中，e4/4受试者表现出比e3/3更薄的皮质区域(图2A，2B和2C)。发生e4/4依赖性收缩的区域是内嗅-副海马-梭形，前躯和下顶叶(P<0.05)。令人惊讶的是，与高加索人相比，这些地区皮质厚度的减少在东亚人中表现得非常强烈。进行协方差分析(ANCOVA)以测量e4/4诱导的皮质萎缩中的种族差异。参照e3/3计算e4/4受试者发生皮质萎缩的区域的相对平均皮质厚度。在东亚人和高加索人中，e4/4和e3/3在内侧颞叶皮质内的平均皮质厚度方面表现出很大的差异，包括内嗅皮质和海马旁皮质以及前躯(*P<0.05，**P<0.01)。此外，东亚人在e4/4/和e3/4之间表现出比高加索人更大的差异(图2B和2C)。东亚人和高加索人之间e4/4相对皮质收缩的直接比较(标准化为e3/3)也显示出显著的结果(*P<0.05，**P<0.01)。此外，本发明人分析了东亚人和高加索人中e4/4和e3/3受试者之间的海马体积。在东亚人和高加索人中，e4/4的海马萎缩均比e3/3更显著，相比于e3/3，e4/4诱导的海马萎缩率在东亚人中高于在高加索人中(**P<0.01)(图2D)。这些结果表明，东亚人更容易受到APOE e4/4介导的脑萎缩的影响，包括皮质厚度减少和海马收缩。为了检查e4/4纯合子中rs405509对脑萎缩的影响，本发明人分析了降低的皮质厚度取决于e4/4和rs405509的各基因型组合(e4/4-TT，e4/4-GT和e4)/4-GG)，参考高加索人受试者中的e3/3(图2E，2F和2G)。具有rs405509-TT的E4/4受试者在内侧颞叶皮质(内嗅皮质和海马旁皮质)和前躯中表现出显著的成簇(P<0.05)。另一方面，具有rs405509-G等位基因的e4/4受试者没有表现出这样的簇。与ACNOVA的定量比较分析显示，与e3/3受试者相比，具有r405509-TT基因型的e4/4受试者在内侧颞叶皮质(F＝8.38，P<0.01)和前躯(F＝10.707，P<0.01)中表现出显著的萎缩，而具有rs405509-GG的e4/4受试者在皮质区域中没有表现出任何显著性(图2F和2G)。本发明人还在高加索人中测试了具有rs405509-TT和rs405509-GG的e4/4受试者的海马萎缩。具有rs405509-TT的e4/4受试者中的海马收缩比e3/3受试者中表现地更强烈，而具有rs405509-GG的e4/4受试者的收缩不显著(图2H)。这些神经影像学结果支持rs405509中的TT基因型不仅影响阿尔茨海默病的风险，而且还影响e4/4受试者的脑收缩。表8显示了参与神经影像学分析的受试者。
[表8]
*东亚是指韩国光州朝鲜大学的NRCD的参与者；高加索人是指ADNI队列的参与者；§老年人的年龄等于或大于60岁至小于90岁。
APOE的表达
根据本发明，rs405509与e4纯合子中阿尔茨海默病的发作和脑收缩有关。因此，本发明人分析了rs405509与APOE调节的生物学相关性。为了检查rs405509基因型是否调节APOE蛋白的表达，本发明人对e3/3受试者中rs405509-TT，GT和GG基因型的人血清进行了蛋白质印迹(图3A)。与具有rs405509-GG和GT的受试者中的水平相比，具有rs405509-TT的受试者中的APOE蛋白水平降低至令人惊讶的水平(图3A)。这些结果与先前的研究一致，表明APOE水平降低与阿尔茨海默病风险增加有关。此外，通过报告基因测定鉴定了rs405509对APOE转录活性的影响。使用来自具有rs405509-T等位基因的AD患者和具有rs405509-G的认知正常个体的APOE启动子片段进行测定。将每个启动子区域中的rs405509等位基因改变为替代等位基因，然后进行基于荧光素酶的报告基因测定(图3C和3D)。在rs405509位置从T到G的单核苷酸多态性导致APOE启动子活性的惊人增加(相对于对照为160％)，而从G到T的取代导致启动子活性的显著降低(相对于对照的66％)。这表明与G等位基因相比，rs405509-T等位基因降低了APOE转录。这些结果表明rs405509通过调节APOE蛋白的水平来调节e4/4的作用。
工业适用性
本发明提供了一种方法，通过分析从血液或生物样品收集的基因组DNA中的APOE基因型以及APOE启动子中rs405509的遗传变异，能够更准确地预测痴呆风险。本发明可以有助于基于痴呆大数据以及复杂的临床和病理信息，例如MRI脑图像，神经心理学测试，脑脊液(CSF)测试和淀粉样蛋白-PET测试的未来诊断技术。
序列表
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<120> 与阿尔茨海默病风险相关的APOE启动子单核苷酸多态性及其用途
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccctcgagc ttcctgcctg tgattggc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggagggtg tctggattac tgggcgag 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgcccagt aatccagaca ccctcctc 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggagggtg tctgtattac tgggcgagg 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctcgcccag taatacagac accctcctc 29

Claims (14)

1.一种诊断或预测轻度认知障碍或阿尔茨海默病(AD)风险的方法，所述方法检测从受试者分离的含核酸样品中指示轻度认知障碍或阿尔茨海默病的遗传变异，该方法包括：
(a)使该样品与能够检测基因中遗传变异的存在或不存在的试剂接触的步骤，所述基因选自编码APOE E4等位基因的基因或其基因产物；和
(b)使该样品与能够检测遗传变异的存在或不存在的试剂接触的步骤，所述遗传变异选自编码APOE启动子的rs405509T等位基因的基因或其基因产物，
其中APOE E4/E4和rs405509 T/T遗传变异的存在表明受试者是患有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的患者，或具有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的风险。
2.如权利要求1的方法，其特征在于，检测APOE E4/E4和rs405509 T/T遗传变异的存在或不存在的方法包括从分离自受试者的样品中获得单链形式的核酸，允许核酸与互补引物组形成复合物，然后分析复合物中遗传变异的存在或不存在。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，分析该复合物中APOE E4/E4和rs405509T/T遗传变异的存在或不存在包括使用聚合酶链反应，核酸酶消化，杂交，Southern印迹，限制酶片段多态性，测序，引物延伸或单链构象多态性，或它们的组合进行分析。
4.如权利要求1的方法，其特征在于，扩增从分离自受试者的样品中获得的核酸。
5.如权利要求1的方法，其特征在于，从分离自受试者的样品中获得的核酸是基因组DNA。
6.如权利要求1的方法，其特征在于，从分离自受试者的样品中获得的核酸是RNA。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
获得受试者中大脑皮质厚度图像的步骤，
其中大脑皮质厚度的萎缩表明受试者是患有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的患者，或具有轻度认知障碍或阿尔茨海默病的风险。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大脑皮质厚度的图像是MR脑图像。
9.如权利要求1,7和8中任一项所述的方法，其特征在于，还包括：
进行一项或多项测试的步骤，包括神经心理学测试，脑脊液(CSF)测试和淀粉样蛋白-PET测试。
10.一种用于诊断或预测轻度认知障碍或阿尔茨海默病的试剂盒，其中检测基因中APOE E4/E4遗传变异的存在或不存在，所述基因选自编码APOE E4等位基因的基因或其基因产物，以及还检测rs405509 T/T遗传变异的存在或不存在，所述遗传变异选自编码APOE启动子的rs405509 T等位基因的基因或其基因产物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，包括：
与APOE E4等位基因和APOE启动子的rs405509 T等位基因互补的引物组；和
反应酶。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，包括用于分析遗传变异的分析方法。
13.如权利要求10的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增核酸的方法。
14.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，包括参考对照。
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