JP7399465B2 - アルツハイマー病の危険性と関連するapoeプロモーターの一塩基多型およびその使用 - Google Patents
アルツハイマー病の危険性と関連するapoeプロモーターの一塩基多型およびその使用 Download PDFInfo
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Description
(1)試料およびデータ
本発明では、完全長ゲノム情報、MRI脳画像情報および臨床診断情報を利用した。認知症コホートにおける2,075人の研究対象(主にChosun大学病院および他の協力病院から;正常対象の平均年齢:73.45±5.30(平均±SD)、アルツハイマー病患者の平均年齢:71.65±5.65(平均±SD)、正常対象の女性の割合:62.4%、アルツハイマー病患者の女性の割合:61.5%)については、完全長ゲノムの情報は血液を使用して獲得し、脳画像情報は各研究対象のMRIスキャン(3T MRI、Skyra、Siemens)によって獲得した。各研究対象は、認知症の診断に必要である神経心理学的検査(K-MMSEおよびSeoul Neuropsychological Screening Battery(SNSB))を受けた。その結果、正常、軽度認知機能障害または認知症の診断は、認知症クリニックの専門医によって行われた。診断結果によって、1,145人の対象が正常であり、930人の対象が認知症の患者であることが示された。さらに、韓国、光州広域市のNational Research Center for Dementia(NRCD)のデータベースを使用した。本発明のすべての実験および研究のプロトコールは、Chosun大学病院の役員会によって承認された。すべての志願者および患者の親族は、実験に参加する前に準備された同意書を提出した。東アジア人の対象は、2,309人の認知的に正常な個体および1,886人のAD患者からなっていた。コーカサス人のゲノムは、Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative(ADNI;http://adni.loni.usc.edu/)データベースから獲得し、コーカサス人の脳画像もADNIデータベースから得た。コーカサス人は、515人の正常対象および320人のAD患者からなっていた。
18F-フロルベタベンPETイメージングを、従来の方法(Osama Sabri、2015、ClinTrans1 Imaging、Barthel、2011、Lancet_neurology)に従って実施した。アミロイドの病状を、脳アミロイド-βプラーク量(BAPL)スコアによって決定した。4つの脳領域(前頭皮質、後部帯状、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質)のフロルベタベン(18F)PET画像を、設定領域皮質のトレーサー取り込み(RCTU)スコアリングシステム(1=取り込みなし、2=微量の取り込み、3=著しい取り込み)に従って評価した。次に、前頭皮質、後部皮質、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質に対するRCTUスコアを、各PETスキャンについて、シングルプリセット3段階スコアリングシステムにおける脳アミロイド-βプラーク量(BAPL)スコア(1=アミロイド量なし、2=微量のアミロイド量、および3=有意なアミロイド量)によってまとめた。ピッツバーグ化合物B(PiB)を使用して陽電子放出断層撮影法(PET)で、インビボのアミロイドイメージングを実施した。脳内の関心領域(ROI)へのPiB沈着を、FreeSurferバージョン5.1ソフトウェア(Martinos Center for Biomedical Imaging)を使用して測定し、部分体積効果について補正した標準化された取り込み値の比(SUVR)を、各関心領域について計算した。前頭皮質、後部皮質、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質領域の平均大脳皮質SUVRを、FreeSurferによって計算した。参照のための領域として小脳皮質を使用した。PiB陽性は1.42のSUVRと定義し、これは、PiB陽性について以前に定義された0.18の平均大脳皮質結合能に対応する。18F-フロルベタピルと11C-PiBの両方に対するコーカサス人のアミロイドPETデータは、ADNIデータベース(http://adni.loni.usc.edu)から得た。
SNPジェノタイピング
ゲノムDNAを、EDTAチューブ中に採取した全血液細胞から単離した末梢血白血球から抽出した。血液試料を1500×gで10分間遠心分離して血漿を除去し、血中白血球をDNA抽出に使用した。韓国人に最適化されたAffymetrix ゲノムワイドジェノタイピングアレイ(Affymetrix(登録商標)Axiom KORV1.0)を使用して、試料をジェノタイピングした。KORV1.0は、Korea National Institute of HealthのGenome Science Centerによって設計され、Korean Chip Consortiumから得た。さらに、TaqmanまたはSNP type(Fluidigm)方法によるジェノタイピング解析を実施して、チップベースSNPジェノタイピングの正確性を評価した。ADNIのジェノタイピングデータは、ADNIデータベース(http://adni.loni.usc.edu)から得た。
NRCDからの研究データセットは6,413個体からなっていた。ADNIからのデータセットは、ADNI-1データセット由来の818個体、ADNI-GO/2データセット由来の432個体、およびADNI-WGSデータセット由来の818個体からなっていた。試料の品質管理は、<95%の個体コールレート、性別ミスマッチ、ヘテロ接合性(平均から±3SD)、重複性または双生児、<95%のコールレートを有するSNP、<10-6のHWEP値を有するSNP、および<1%のMAFを含んでいた。HRCリファレンスパネル バージョン1.1を使用して、各データセットを別々にインピュテーションした。NRCDからのHRCインピュテーションは、参照集団として東アジア人を選択することによって、プレフェーズ研究のハプロタイプとともに実施した。ADNIデータセットについては、インピュテーションは、参照集団として、HRCインピュテーションサーバー中のヨーロッパ人を選択することによって、プレフェーズ研究のハプロタイプとともに、別々に実施した。インピュテーション後に、低品質でインピュテーションされたSNP(info<0.5)をさらなる研究から除外した(McCarthyら、2016;Nagyら、2017;Surakkaら、2016)。
韓国人対象からのMR画像の獲得
2,443人の韓国人対象について、1.5TのMRスキャナー(Magnetom Avanto、Siemens)(TR=1800ms;TE=3.43ms;TI=1100ms;15フリップ角;FoV=224×224;マトリックス=256×256;スライス数=176)を用いて、脳全体の、0.9mm付近のアキシャル磁化準備型高速グラディエントエコー(magnetization prepared rapid gradient-echo)(MPRAGE)画像を獲得した。3TのMRスキャナー(Skyra、Siemens)(TR=2300ms;TE=2.143ms;TI=900ms;9フリップ角;FoV=256×256;マトリックス=320×320;スライス数=178.体積)を用いて、0.8mm付近のサジタルMPRAGE体積を獲得した。すべての画像は、韓国、光州広域市、Chosun大学病院にあるMRスキャナーを用いて獲得した。
認知的に正常な463人の対象、軽度認知機能障害を有する796人の対象、および310人のAD患者由来のベースラインの1.5Tおよび3TのMR画像を、ADNIデータベース(ADNI、http://adni.loni.usc.edu/)からダウンロードした。対象に関するすべてのMR画像は、標準的なADNI MPRAGEプロトコールに従って、1.5Tまたは3TのGE、Philips、およびSiemensの機器を用いて獲得した。1.5Tスキャナーについては、MPRAGEプロトコールに対する公称パラメーターは、以下の通りである:サジタル面、マルチコイルフェーズドアレイコヘッドコイルに対してTR=2300~2400ms(バードケージまたはボリュームヘッドコイルに対してTR=3000ms)、最小フルTE、TI=1000ms、フリップ角8°、FOV=240×240mm、192×192インプレーンマトリックスおよび1.2mmスライス厚。3Tスキャナーについては、MPRAGEプロトコールに対する公称パラメーターは、以下の通りである:サジタル面、TR=2300または3000ms、最小フルTE、T1=853~900ms、フリップ角8°~9°、FOV=256~260×240mm、256×256インプレーンマトリックスおよび1.2mmスライス厚(Jackら、2008)。AD対象は、MMSEについて20~26のスコア(Burnsら、1998)およびCDR=0.5または1(Morris、1993)に基づいて含めた。さらに、選択されたAD群は、可能性の高い(probable)ADに対する基準であるNINCDS/AARDA基準を満たしていた。健常対照については、CDRが0であり、認知症を有していない個体を含めた(Wolzら、2011)。
MR画像データ処理
画像処理は、脳構造解析(Daleら、1999;FischlおよびDale、2000;Fischlら、2004)に使用されるパブリックドメインソフトウェアのFreeSurferソフトウェア(FreeSurfer 5.3.0)(FreeSurfer、http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/)を用いて実施した。FreeSurfer処理のための自動化パイプラインでDICOMフォーマットのMR画像を使用して、脳皮質表面の3次元モデルを構築した(Daleら、1999;DaleおよびSereno、1993;Fischlら、1999a)。処理において、画像の強度を正規化し、正規化した画像から頭蓋骨を除去した。次に、連結コンポーネントアルゴリズムを用いて皮質下セグメンテーション処理を開始し、発見された如何なる穴も、両方の大脳皮質半球について白質の単一充填体積を表すように充填した。さらに、テッセレーションおよび表面平滑化を用いて、如何なるメトリック歪みも減少させた。次に、精密化プロセスを実施して灰白質/白質の境界を作成し、次いで、最初の表面モデル構築を実施した。次に、表面を外側に変形させて、軟膜表面を形成した。最初に、灰白質/白質の表面上の各ポイントから軟膜表面までの最短距離を計算し、軟膜表面上のポイントから灰白質/白質までの最短距離を計算し、これによって、脳皮質の厚さの測定値を得た。次に、特定のポイントにおけるこれら2つの値の平均から最終的な皮質厚を得た。皮質厚は、三角グリッドを用いて、皮質外套内の任意のポイントまたは頂点を表す別の位置から約1mm離れた、各半球の163,842個の頂点について測定した。皮質の折りたたみパターンは、0mm、5mm、10mm、15mm、20mmおよび25mmの半値全幅ガウシアンカーネルを用いて地図を平滑化し、非剛体高次元球状平均化方法(non-rigid high-dimensional spherical averaging method)を用いて対象について平均を得ることによって、調整した。調整した地図は、対象の間のmm以下の違いさえ検出することができ、ボクセル解像度によって制限されない。さらに、FreeSurferを使用する自動化体積測定方法(Daleら、1999;FischlおよびDale、2000;Fischlら、1999b)によって、皮下体積を獲得した。
異なるAPOEアレルを有する群の間の皮質厚の違いを、MATLAB用のSurfstat(http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/)ツールボックス(R2012a、The Mathworks、Natick、MA、USA)を使用して統計的に解析した。本発明者らは、軟膜表面上の各々の非マスクポイントを統計的に試験した。固定因子としてAPOEアレル(e4/4対e3/3)を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベルおよび場の強度を使用して、一般線形モデル(GLM)を用いて、皮質厚のポイントごとの違いを特定した(Fanら、2010)。rs405509アレルの違いを評価するために、T/T-E4/4およびG/T-e4/4+G/G-e4/4のハプロタイプを有する対象を、e3/3を有する対象とは別に比較した。rs405509のGLMでは、本発明者らは、固定因子としてAPOEアレル(rs405509-e4/4ハプロタイプ対e3/3)を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベルおよび場の強度を使用して、皮質厚のポイントごとの違いを特定した(Chenら、2015b)。すべての皮質厚解析では、複数のポイントごとの皮質厚の比較のためのランダム場理論(RFT)に基づく補正を、クラスターレベルで適用し、p<0.05の偽発見率(FDR)補正値を通過したクラスターを有意とみなした(TaylorおよびAdler、2003)(http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/)。さらに、Rプログラム(Rバージョン3.3.1)を使用して、APOEアレルを保有する群について、海馬体積および解剖学的な関心領域を統計的に比較した。固定因子としてAPOEアレル(e4/4対e3/3、rs405509-e4/4ハプロタイプ対e3/3)を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベル、診断および頭蓋内体積(ICV)を使用して、共分散解析(ANCOVA)を用いて、海馬体積の違いを評価した(Hickieら、2005;Zierhutら、2013)。次に、共変量として年齢、性別、教育レベルおよび診断を使用して、異なる群(e4/4対e3/3、rs405509-e4/4ハプロタイプ対e3/3)の間の関心領域(ROI)の違いを比較した。解析では、有意性レベルはp<0.05で考慮し、FDR補正がp<0.05のレベルであった場合、結果を有意とみなした(Strickerら、2013;Yeら、2016)。
対照およびAD群の対象の割合をカイ二乗検定によって比較した。調整した(性別および年齢)解析と未調整の解析の両方について、95%信頼区間でロジスティック回帰分析を使用して、事象に対するオッズ比を計算した(Basariaら、2010)。SPSS(バージョン23.0)とRプログラム(バージョン3.3)の両方を使用して、すべての統計的検定を実施した。
ウエスタンブロッティング
最初に、血清を全血(NRCDから得た)から回収した。SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングは、若干の変更を加えて、製造者の指示書に従い実施した(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)。0.1%Tween20を加えたPBS中の5%脱脂粉乳で膜を1時間ブロッキングし、続いて、一次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。一次抗体は、以下のように希釈し、使用した:1:1,000ウサギ抗APOE(D719N;Cell Signaling);1:1,000ウサギ抗トランスフェリン(ab109503;Abcam)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗体は1:5,000で使用した。免疫活性はEZ-Western Lumi Plus(DoGen)で測定した。
APOE遺伝子(位置1,983~+935)プロモーター領域を、正常対象およびAD患者から得た血液細胞由来のゲノムDNAから、以下のプライマーを使用して増幅した:フォワード、5’-GGGGTACCGAAAGCAGCGGATCCTTGAT3’(配列番号1);リバース、5’-CCCCTCGAGCTTCCTGCCTGTGATTGGC3’(配列番号2)。増幅したDNAをKpnIおよびXhoIで切断し、pGL3.ベーシックベクター(Promega)中にライゲーションした。以下のプライマーを使用して、rs405509(219G/T)のPCRベースの部位特異的変異誘発を使用するG→TおよびT→Gアレル置換を実施した:T→Gフォワード、5’-GAGGAGGGTGTCTGGATTACTGGGCGAG-3’(配列番号3);リバース、5’-CTCGCCCAGTAATCCAGACACCCTCCTC3’(配列番号4);G→Tフォワード、5’-GAGGAGGGTGTCTGTATTACTGGGCGAGG-3’(配列番号5);リバース、5’-CCTCGCCCAGTAATACAGACACCCTCCTC-3’(配列番号6)。アッセイは、PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Agilent)を使用して実施した。
HEK293T細胞を12ウェルプレート中で培養した。24時間後に、TransFectin(商標名)脂質試薬を使用して、0.25μgのホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する0.25μgのpGL3(Promega)と0.25μgのpCMV-β-ガラクトシダーゼ(Clontech)とを、この細胞に24時間かけてコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をレポーター溶解バッファー(Promega)で溶解した。ルシフェラーゼ活性およびβ-ガラクトシダーゼ活性を、それぞれ、GloMax(商標名)ルミノメーター(Promega)およびEpochマイクロプレート分光光度計(BioTek)を使用して定量化した。ルシフェラーゼ活性をβ-ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。結果は3つの独立した実験を表す。
完全長ゲノム情報は以下のように得た:正常対象、アルツハイマー型軽度認知機能障害を有する患者、およびアルツハイマー型認知症の患者と診断された対象の血液から単離したバフィーコートを使用して、QIAGEN DNAミニキットを用いて、gDNAを抽出し、次いで、これを定量化した。定量化は、ND-1000分光光度計ならびにQuant-iT PicoGreen dsDNA試薬およびキットを使用して実施した。次に、アガロース1.0%トリス-ホウ酸-EDTA(TBE;Invitrogen)ゲルで電気泳動を実施することによってDNAの品質を検査し、次いで、DNA品質管理を通過した試料について、マイクロアレイベースのジェノタイピングを実施した。AffymetrixのAxiom Koreanチップを製造者の指示書に従って使用して、各遺伝子型に関する情報を得た。マイクロアレイ化されていないSNPについて、インピュテーション方法によってジェノタイピングを実施した。完全長ゲノムインピュテーションのためにPlink、EIGENSTRAT、Shapeit、impute2、GTOOL、EAGLETOOL、およびminimac3プログラムを使用し、リファレンスパネルとして、1000ゲノム(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)およびMichiganインピュテーションサーバー(https://imputationserver.sph.umich.edu/index.html)を使用して、インピュテーションを実施した。
APOE e4/4とアルツハイマー病の関連
アルツハイマー病との関連性の点から、本発明者らは、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統という異なる人種群においてAPOE変異の危険性を解析した。対照およびアルツハイマー病と臨床的に診断された患者を含むすべての人種群において、対照とアルツハイマー病患者群との間で、APOE遺伝子型の分布およびアレル頻度の大きな違いが示された。これらの結果は、対照よりも、アルツハイマー病群のe4を有する対象で顕著であった。APOE e4はアルツハイマー病の重要な危険因子であるが、e4媒介性の危険性の人種差は確認されていなかった。アルツハイマー病の可能性が高いと臨床的に診断された患者、および正常対照を使用した解析において、東アジア人であるe4/4対象は、コーカサス人と比較して非常に高いオッズ比を示した(東アジア人およびコーカサス人について、それぞれ、オッズ比:e4/4=33.40および15.86)(表1)。表1では、オッズ比は、e3/3を参照してロジスティック回帰によって解析した。
東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の順番である、人種的に異なるe4/4の危険性は、APOE周辺の遺伝子多型のためであることが推定された。原因となるメカニズムを調べるために、本発明者らは、異なる人種群の間のアレル頻度と関連する、APOE周辺の遺伝子の40kb領域内のSNPをスクリーニングした(図1A)。40kbにわたる630個のインピュテーションされたSNPのうち、基準、すなわち、例えば東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の順番またはその逆の順番のアレル頻度などの基準に従って、72個のSNPを選択した。続いて、本発明者らは、APOEの調整なしで、アルツハイマー病との有意な関連性およびマイナーアレル頻度に従って、SNPを取り出した。その結果、3つのSNP、rs449647、rs405509、およびrs440446が得られた。これらの多型は、APOEプロモーターおよびイントロン領域に位置した(図1B)。これらは、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の間で、アレル(rs449647-A、rs405509-T、およびrs440446-G)頻度の大きな違いを示した(図1C)。これらの中で、rs405509は、人種群の間で著しい違いを示した(1000個のゲノムデータベースに基づいて、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統について、それぞれ、T-アレル頻度=0.67、0.48、および0.24)。特に、東アジア人由来のe4ホモ接合体は、90.4%のTT-遺伝子型を有していたが、コーカサス人およびアフリカ人由来のe4ホモ接合体は、それぞれ64.2%および21.3%のTT-遺伝子型を有しており、これは、rs405509のアレル頻度の違いが、異なる人種群の間のe4/4に関して、AD発症に対する感受性の違いをもたらし得ることを示す。rs449647およびrs440446は、異なる人種群の間で異なるアレル頻度を示したが、e4/4におけるそれらの頻度は、人種群の間で大きく違わなかった。
e3/4およびe4/4においてrs405509のTT遺伝子型がアルツハイマー病の高い危険性を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは、e3/4およびe4/4対象においてrs405509の関連性を試験した。予想通り、rs405509-TTは、NRCDデータセット(東アジア人)由来の3/4とe4/4対象群の両方において著しく高いオッズ比を示し(表6)、これは、e4/4の危険性の人種差を示唆する。東アジア人において高いrs405509-TT頻度を有するE4ホモ接合体は、コーカサス人およびアフリカ人系統よりも、アルツハイマー病に対して高い感受性を示した。
APOE e4/4によって媒介される脳萎縮において人種差が示されるかどうかを確認するために、本発明者らは、東アジア人およびコーカサス人に対して、e4/4とe3/3対象との間で、一般線形モデルによって、ポイントごとの皮質厚解析を実施した。東アジア人とコーカサス人の両方で、e4/4対象は、e3/3よりも薄い皮質領域を示した(図2A、2B、および2C)。e4/4依存的収縮が生じた領域は、嗅内皮質-海馬傍回-紡錘状回(entorhinal-parahippocampal-fusiform)、楔前部、および下頭頂小葉であった(P<0.05)。驚くべきことに、これらの領域の皮質厚の減少は、コーカサス人と比較して、東アジア人で強く示された。共分散解析(ANCOVA)を実施して、e4/4誘導性皮質萎縮の人種差を測定した。皮質萎縮が生じた領域の相対的平均皮質厚を、e3/3を参照して、e4/4対象について計算した。東アジア人とコーカサス人の両方で、嗅内皮質および海馬傍回皮質を含む内側側頭皮質、ならびに楔前部内の平均皮質厚に関して、e4/4とe3/3の間で大きな違いが示された(*P<0.05、**P<0.01)。さらに、東アジア人は、e4/4/とe3/4の間でコーカサス人よりも大きな違いを示した(図2Bおよび2C)。東アジア人とコーカサス人の間の、e4/4における相対的皮質収縮の直接比較(e3/3に対して正規化)も、有意な結果を示した(*P<0.05、**P<0.01)。さらに、本発明者らは、東アジア人およびコーカサス人において、e4/4とe3/3対象の間で海馬体積を解析した。東アジア人とコーカサス人の両方で、海馬の萎縮は、e3/3よりもe4/4で著しく示され、e3/3と比較した場合のe4/4誘導性の海馬萎縮率は、コーカサス人よりも東アジア人で高かった(**P<0.01)(図2D)。これらの結果は、東アジア人は、皮質厚の減少および海馬の収縮を含めたAPOE e4/4媒介性脳萎縮に、よりかかりやすいことを示唆する。e4/4ホモ接合体における脳萎縮に対するrs405509の影響を調べるために、本発明者らは、コーカサス人対象において、e3/3を参照して、e4/4ならびにrs405509のそれぞれの遺伝子型の組み合わせ(e4/4-TT、e4/4-GT、およびe4/4-GG)に依存した皮質厚の減少を解析した(図2E、2Fおよび2G)。rs405509-TTを有するe4/4対象は、内側側頭皮質(嗅内皮質および海馬傍回皮質)ならびに楔前部内で著しいクラスターを示した(P<0.05)。これに反して、rs405509-Gアレルを有するe4/4対象は、そのようなクラスターを示さなかった。ACNOVAを用いた定量的比較解析により、r405509-TT遺伝子型を有するe4/4対象は、e3/3対象と比較して、内側側頭皮質(F=8.38、P<0.01)および楔前部(F=10.707、P<0.01)内で著しい萎縮を示すことが示されたが、rs405509-GGを有するe4/4対象は、皮質領域内で如何なる有意性も示さなかった(図2Fおよび2G)。本発明者らは、コーカサス人におけるrs405509-TTおよびrs405509-GGを有するe4/4対象において、海馬の萎縮も試験した。rs405509-TTを有するe4/4対象の海馬の収縮は、e3/3対象よりも強く示されたが、rs405509-GGを有するe4/4対象の収縮は顕著でなかった(図2H)。これらの神経イメージングの結果は、rs405509におけるTT遺伝子型が、e4/4対象において、アルツハイマー病の危険性に影響を及ぼすだけでなく脳収縮にも関連することを支持する。表8は、神経イメージング解析に参加した対象を示す。
本発明によれば、rs405509は、e4ホモ接合体において、アルツハイマー病の発症および脳収縮と関連する。したがって、本発明者らは、rs405509とAPOEの調節との生物学的関連性を解析した。rs405509遺伝子型がAPOEタンパク質の発現を調節するかどうかを調べるために、本発明者らは、e3/3対象のrs405509-TT、GT、およびGG遺伝子型のヒト血清に対してウエスタンブロッティングを実施した(図3A)。rs405509-TTを有する対象のAPOEタンパク質のレベルは、rs405509-GGおよびGTを有する対象のレベルと比較して、驚くべきレベルまで低下した(図3A)。これらの結果は以前の研究と矛盾がなく、これは、APOEのレベルの低下がアルツハイマー病の危険性の増大と関連することを示唆する。さらに、APOEの転写活性に対するrs405509の影響を、レポーター遺伝子アッセイによって確認した。このアッセイは、rs405509-Tアレルを有するAD患者およびrs405509-Gを有する認知的に正常な個体に由来するAPOEプロモーター断片を使用して実施した。各プロモーター領域のrs405509アレルを別のアレルに変更し、次いで、ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイを実施した(図3Cおよび3D)。rs405509位置におけるTからGへの一塩基多型は、APOEプロモーター活性の驚くべき増大をもたらした(対照と比較して160%)が、GからTへの置換は、プロモーター活性の劇的な低下をもたらした(対照と比較して66%)。これは、rs405509-Tアレルが、Gアレルと比較してAPOEの転写を低下させることを示唆する。これらの結果は、rs405509が、APOEタンパク質のレベルを調節することによってe4/4の影響を調節することを示唆する。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 対象から単離された核酸を含む試料において軽度認知機能障害またはアルツハイマー病(AD)を示す遺伝的変異を検出することによって、軽度認知機能障害またはアルツハイマー病の診断をするかまたは危険性を予測するための方法であって、
(a)APOE E4アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と、
(b)APOEプロモーターのrs405509 Tアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択される遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と
を含み、
APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の存在が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、方法。
[2] APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の有無を検出する方法が、前記対象から単離された前記試料から一本鎖形態の核酸を得、前記核酸を相補的プライマーセットと複合体を形成させ、次いで、前記複合体中の前記遺伝的変異の有無を解析することを含む、[1]に記載の方法。
[3] 前記複合体中の前記APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の有無を解析することが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析を実施することを含む、[2]に記載の方法。
[4] 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸を増幅する、[1]に記載の方法。
[5] 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がゲノムDNAである、[1]に記載の方法。
[6] 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がRNAである、[1]に記載の方法。
[7] 前記対象の大脳皮質厚の画像を得る工程
をさらに含み、
前記大脳皮質厚の萎縮が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、[1]に記載の方法。
[8] 大脳皮質厚の前記画像がMR脳画像である、[7]に記載の方法。
[9] 神経心理学的検査、脳脊髄液(CSF)検査、およびアミロイドPET検査からなる検査の1つ以上を実施する工程
をさらに含む、[1]、[7]および[8]の何れか1に記載の方法。
[10] 軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を診断または予測するためのキットであって、APOE E4/E4遺伝的変異の有無を、APOE E4アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物において検出し、APOEプロモーターのrs405509 Tアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択されるrs405509 T/T遺伝的変異の有無をさらに検出する、キット。
[11] 前記APOE E4アレルおよび前記APOEプロモーターの前記rs405509 Tアレルに相補的なプライマーセット、ならびに
反応酵素
を含む、[10]に記載のキット。
[12] 前記遺伝的変異を解析するための解析方法が含まれる、[10]に記載のキット。
[13] 核酸を増幅するための方法が含まれる、[10]に記載のキット。
[14] 参照対照が含まれる、[10]に記載のキット。
Claims (14)
- アジア人の対象から単離された核酸を含む試料において、脳内のアミロイド蓄積、海馬の萎縮、並びに、楔前部領域、内側嗅内領域および海馬傍回領域における脳萎縮を伴うアルツハイマー病(AD)を示す遺伝的変異を検出するための方法であって、
(a)APOE遺伝子中、またはAPOE遺伝子の遺伝子産物中の、APOE E4/E4遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と、
(b)APOEプロモーターのrs405509 Tアレルの有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程とを含み、
APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の存在が、前記対象がアルツハイマー病を有する患者であること、またはアルツハイマー病の増加した危険性を有することを示す、方法。 - APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の有無を検出する方法が、前記対象から単離された前記試料から一本鎖形態の核酸を得、前記核酸を相補的プライマーセットと複合体を形成させ、次いで、前記複合体中の前記遺伝的変異の有無を解析することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体中の前記APOE E4/E4およびrs405509 T/T遺伝的変異の有無を解析することが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析を実施することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸を増幅する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の大脳皮質厚の画像を得る工程
をさらに含み、
前記大脳皮質厚の萎縮が、前記対象がアルツハイマー病を有する患者であること、またはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、請求項1に記載の方法。 - 大脳皮質厚の前記画像がMR脳画像である、請求項7に記載の方法。
- 神経心理学的検査、脳脊髄液(CSF)検査、およびアミロイドPET検査からなる検査の1つ以上を実施する工程
をさらに含む、請求項1、7および8の何れか1項に記載の方法。 - アジア人の、脳内のアミロイド蓄積、海馬の萎縮、並びに、楔前部領域、内側嗅内領域および海馬傍回領域における脳萎縮を伴うアルツハイマー病を診断または予測するためのキットであって、APOE E4/E4遺伝的変異の有無を、APOE遺伝子、またはAPOE遺伝子の遺伝子産物において検出し、APOEプロモーターにおけるrs405509 T/T遺伝的変異の有無をさらに検出することを特徴とする、キット。
- 前記APOE E4遺伝子および前記APOEプロモーターのrs405509 Tアレルに相補的なプライマーセット、ならびに
反応酵素
を含む、請求項10に記載のキット。 - 前記遺伝的変異を解析するための解析方法が含まれる、請求項10に記載のキット。
- 核酸を増幅するための方法が含まれる、請求項10に記載のキット。
- 参照対照が含まれる、請求項10に記載のキット。
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