KR101939368B1 - 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알츠하이머성 치매 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커로서 miR-1273g-3p는 정상인에 비해 전임상 알츠하이머성 치매 환자, 경도인지장애 환자 및 알츠하이머성 치매 환자에서 발현이 증가한다. 따라서, 상기 miR-1273g-3p는 알츠하이머성 치매 조기 진단 마커로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 알츠하이머성 치매 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
한국이 세계에서 가장 빠른 속도로 고령화가 진행되면서 노화와 관련된 질병 및 이의 치료법에 대해 관심이 높아지고 있다. 특히, 국내 초고령화에 따른 치매 환자의 급증이 심각한 문제로 대두되고 있다. 2012년 보건복지부 조사에 따르면, 당시 65세 이상 치매 노인 환자는 53만 4천명으로, 65세 이상 전체 노인 589만명 중 9%가 치매 환자로 파악되었다. 또한, 2012년 국내 전체 치매 인구 중 알츠하이머성 치매가 71.3%로 1위를 차지하였다. 65세 이상 고령층에서 산발적으로 발생하는 알츠하이머성 치매는 서서히 발병하여 기억력을 포함한 인지기능의 악화가 점진적으로 진행되는 퇴행성 뇌질환이다.
치매는 비가역적으로 진행되는 질병으로서, 초기에 진단이 이루어지지 않으면 발병 후 치료 및 회복이 불가하다. 따라서, 치매는 예방과 조기 검진을 통한 선제적 관리가 발병 지연의 유일한 대안이다. 현재 치매 검진을 위해 간이정신상태검사(MMSE), 몬트리올 인지검사(MoCA), 후각인지도검사(UPSIT) 등의 인지심리검사와 뇌척수액 검사, PET/MIR 뇌영상 촬영, 혈액검사 등의 기술들이 통용되고 있다. 하지만, 인지심리검사는 신체적, 심리적, 인종학적 영향 등의 주관성이 개입되어 정량화하기 어려운 단점이 있고, 장시간 검사, 고비용 문제 등으로 범용적 적용이 어려우며, 초기 치매에서는 증상이 나타나지 않는 경우가 많아 인지심리검사만으로 치매를 예단하기 어렵다. 또한, 뇌척수액 검사를 위한 척수천자(lumbar puncture)는 통증 수반으로 인해 거부감이 큰 검진 기술이다. 또한, PET/MIR 뇌영상 촬영을 이용한 알츠하이머성 치매의 진단은 병이 상당히 진행된 후에 분석이 가능하므로 조기 진단의 어려움이 있고, 고비용의 문제가 발생한다. 따라서, 환자의 고통 및 거부감을 최소화하고 비용을 절감할 수 있도록, 혈액검사만으로도 치매 진단이 가능한 바이오마커를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 상기 검진 기술은 환자 개개인별의 유전적, 생활습관 등의 차이나 실험기법, 분석기법 등의 차이로 인해 검사 결과의 일관성이 없다.
한편, 국내에서 시행되고 있는 치매 진단은 대부분 외국에서 개발된 기법을 사용하고 있으나, 서양인과 한국인의 치매 유발 유전적 변이 및 뇌구조가 매우 다른 양상을 보인다는 보고가 적지 않다. 그러나, 한국인을 대상으로 한 데이터 부족, 개인별 다양한 유전체 변이에 대한 분석기술 미비 등의 이유로, 한국인에게 유의성 있고 적용 가능한 지표를 개발하지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 장시간 소요, 고비용, 통증 수반, 결과의 비일관성, 한국인에게 유의한 치매 검진 기법의 부재 등 상기 현존하는 알츠하이머성 치매 검진 기법의 문제점을 해결하기 위한 검진 기술을 연구하던 중, 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매 환자의 혈장에서 정상인에 비해 특정 miRNA가 유의미하게 증가함을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 특히, 서양인들을 대상으로한 알츠하이머성 치매 특이적인 혈액기반 miRNA 바이오마커 개발 연구(Dorval, 2013)가 보고된 반면, 한국인을 대상으로 한 혈장 miRNA 바이오마커 선정에 대한 연구 결과는 아직 발표되지 않았다.
Dorval et al., Front. Mol. Neurosci., 2013 Aug 30;6:24
본 발명의 목적은 알츠하이머성 치매를 진단하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머성 치매를 예방 또는 치료하기 위한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-1273g-3p를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 개체로부터 채취된 혈액에서 혈장 miR-1273g-3p의 발현량을 측정하는 단계, 2) 상기 miRNA의 발현량과 정상인의 miR-1273g-3p 발현량을 비교하는 단계, 및 3) 상기 miRNA의 발현량이 정상인의 miR-1273g-3p 발현량에 비해 높은 경우, 개체가 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애 단계 및 알츠하이머성 치매 단계에서 선택되는 어느 하나의 상태라고 판정하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 miR-1273g-3p의 뉴클레오타이드, 그와 상보적인 뉴클레오타이드 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되어 이루어지는 miR-1273g-3p에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 세포주에 miR-1273g-3p를 투여하는 단계, 2) 상기 miR-1273g-3p가 투여된 세포주에 시험물질을 투여하는 단계, 3) 상기 시험물질이 투여된 세포주에서 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계, 및 4) 시험물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 스크리닝 물질을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커로서 miR-1273g-3p는 정상인에 비해 전임상 알츠하이머성 치매 환자, 경도인지장애 환자 및 알츠하이머성 치매 환자에서 발현이 증가한다. 따라서, 상기 miR-1273g-3p는 정확한 알츠하이머성 치매 조기 진단 마커로서 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 상기 miR-1273g-3p를 이용하여 알츠하이머성 치매를 진단하는 방법은 혈액채취를 통한 치매 진단법으로서, 치매 검진 비용을 절감할 수 있고, 기존 치매 진단법에 비해 샘플 채취방법이 비침습적이고 보다 간편하여 검진에 대한 거부감이 감소되어 치매 조기 진단률 증가가 예상된다.
도 1은 정상(Normal), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군에 따라 유의성 있는 변화를 보이는 miRNA를 선별하여, 계층적 군집화(hierarchical clustering)를 통해 5개의 클러스터로 구분한 것을 나타낸 것이다.
도 2a는 알츠하이머성 치매(AD) 실험군의 miR-1273g-3p에 대한 qPCR(quantitative polymerase chain reaction) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통한 알츠하이머성 치매 검진의 민감도와 특이도를 확인하기 위해 수행한 ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 정상(Normal), 전임상 알츠하이머성 치매(pre-clinical alzheimer's disease, PCA), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군의 miR-1273g-3p에 대한 qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통한 알츠하이머성 치매 검진의 민감도와 특이도를 확인하기 위해 수행한 ROC 커브 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 정상(Normal), 전임상 알츠하이머성 치매(PCA), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군의 신경심리검사(K-MMSE, SNSB) 점수와 혈장 miR-1273g-3p의 qPCR 분석 데이터의 상관성을 나타낸 것이다.
도 5a는 miR-1273g-3p mimic 주입에 따른 치매 모델 세포주인 H4-APPswe 세포주에서 배양액으로 배출되는 β-Amyloid(1-42)(Aβ42)의 양의 변화를 측정하여 나타낸 것이다. 이때, CM은 conditioned media의 약자이다.
도 5b 및 도 5c는 H4-APPswe 세포에 miR-1273g-3p mimic 형질 주입에 따른 β-Amyloid(1-42)의 형성 촉진 단백질인 BACE1 및 Nicastrin의 발현 수준 변화를 웨스턴 블롯 분석기법(western blot assay)을 통해 나타낸 것이다.
도 5d는 H4-APPswe 세포에 miR-1273g-3p mimic 주입에 따른 BACE1 및 Nicastrin의 mRNA 발현 수준 변화를 qPCR 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 2a는 알츠하이머성 치매(AD) 실험군의 miR-1273g-3p에 대한 qPCR(quantitative polymerase chain reaction) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통한 알츠하이머성 치매 검진의 민감도와 특이도를 확인하기 위해 수행한 ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 정상(Normal), 전임상 알츠하이머성 치매(pre-clinical alzheimer's disease, PCA), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군의 miR-1273g-3p에 대한 qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통한 알츠하이머성 치매 검진의 민감도와 특이도를 확인하기 위해 수행한 ROC 커브 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 정상(Normal), 전임상 알츠하이머성 치매(PCA), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군의 신경심리검사(K-MMSE, SNSB) 점수와 혈장 miR-1273g-3p의 qPCR 분석 데이터의 상관성을 나타낸 것이다.
도 5a는 miR-1273g-3p mimic 주입에 따른 치매 모델 세포주인 H4-APPswe 세포주에서 배양액으로 배출되는 β-Amyloid(1-42)(Aβ42)의 양의 변화를 측정하여 나타낸 것이다. 이때, CM은 conditioned media의 약자이다.
도 5b 및 도 5c는 H4-APPswe 세포에 miR-1273g-3p mimic 형질 주입에 따른 β-Amyloid(1-42)의 형성 촉진 단백질인 BACE1 및 Nicastrin의 발현 수준 변화를 웨스턴 블롯 분석기법(western blot assay)을 통해 나타낸 것이다.
도 5d는 H4-APPswe 세포에 miR-1273g-3p mimic 주입에 따른 BACE1 및 Nicastrin의 mRNA 발현 수준 변화를 qPCR 분석을 통해 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 측면으로, miR-1273g-3p를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커를 제공한다.
miRNA는 전구체(precursor)로부터 두 종류의 성숙한 miRNA (mature miRNA)가 생성되는데, 동일한 pre-microRNA의 서로 다른 arms (3' arm 또는 5' arm)을 포함한 경우 '-3p' 또는 '-5p'를 뒤쪽에 추가하여 miR-n-3p 혹은 miR-n-5p로 명명한다. 이때, n은 숫자이며, 일반적으로 명명한 순서를 나타낸다. 또한, 한두 개의 서열을 제외하고 거의 동일한 서열의 miRNA들은 소문자를 추가하여 명명하는데, 예를 들어, miR-121a와 miR-121b는 각각의 전구체인 mir-121a와 mir-121b에서 생성되었으며 서열도 매우 유사하다. 이때, "mir-"은 pre-miRNA를 나타내며, 대문자가 있는 "miR-"은 성숙한 miRNA를 의미한다. 또한, 종에 따른 miRNA의 명명은 앞쪽에 표기하는데, 예를 들어, hsa-miR-123은 인간(Homo sapiens) miRNA이고, oar-miR-123은 양(Ovis aries) miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서 사용한 miR-1273g-3p의 정확한 명칭은 hsa-miR-1273g-3p로서, 전구체인 hsa-mir-1273g로부터 생성된 성숙한 miRNA이다. 상기 miR-1273g-3p의 서열은 하기와 같다: miR-1273g-3p, ACCACUGCACUCCAGCCUGAG(서열번호 1).
현재, miRNA 명명법이 많이 정착되었으나, 정착되기 전 연구자에 따라 miRNA 명명법이 약간씩 상이하였다. 따라서, miRNA의 고유 번호인 Accession number로 miRNA를 추적하는 것이 가장 정확하고 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서 사용한 miR-1273g-3p의 Accession number는 하기와 같다: miR-1273g-3p, MIMAT0022742(miRBase).
또한, 본 발명에서 용어 "알츠하이머성 치매"란 65세 이상 고령층에서 산발적으로 발생하는 퇴행성 뇌질환으로서, 서서히 발병하여 기억력을 포함한 인지기능의 악화가 점진적으로 진행되는 질병이다.
상기 질병은 비가역적으로 진행되는 질병으로서, 발병 후 치료 및 회복이 불가하여 예방과 조기 검진이 중요한 질병이다. 현재 치매 검진을 위해 인지심리검사, 뇌척수액 검사, PET/MIR 뇌영상 촬영, 혈액검사 등의 기술들이 통용되고 있지만, 장시간 소요, 고비용, 통증 수반, 결과의 비일관성, 한국인에게 유의한 치매 검진 기법의 부재 등의 문제점들을 가지고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바이오마커로서 혈장 내 miR-1273g-3p의 발현량을 측정하여 알츠하이머성 치매 전임상 단계, 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매를 진단함으로써 상기 문제점들을 해결할 수 있는 새로운 알츠하이머성 치매의 조기 검진 기법을 사용하였다.
본 발명은 다른 측면으로, 1) 개체로부터 채취된 혈액에서 혈장 miR-1273g-3p의 발현량을 측정하는 단계, 2) 상기 miRNA의 발현량과 정상인의 miR-1273g-3p 발현량을 비교하는 단계, 및 3) 상기 miRNA의 발현량이 정상인의 miR-1273g-3p 발현량에 비해 높은 경우, 개체가 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애 단계 및 알츠하이머성 치매에서 선택되는 어느 하나의 상태라고 판정하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 miR-1273g-3p의 발현량을 측정하는 단계에서 qPCR 또는 노던 블롯 분석법(northern blot analysis)이 사용될 수 있다.
qPCR은 목표 DNA 분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 한다. 상기 기법은 현재 증폭되는 DNA의 양을 실시간으로 측정한다.
본 발명의 일 실시예에서는 혈장 샘플의 miRNA에 대해 cDNA를 합성하여 qPCR 분석을 수행하였다. 그 결과, miR-1273g-3p가 알츠하이머성 치매에서 유의성 있는 증가를 보이며 알츠하이머성 치매 진단 마커로서의 가능성을 확인하였다(도 2).
노던 블롯 분석법은 시료간의 RNA 발현량의 차이나 어떤 시료에서의 RNA 존재 유무를 판단하기 위해 사용하는 기법이다. 일례로, 상기 기법을 통해 정상인, 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매 환자로 진단된 피험자의 각 혈장 샘플간 miR-1273g-3p 발현량의 차이를 확인하여, 혈장 miR-1273g-3p의 알츠하이머성 치매 조기 진단 마커로서의 가능성을 확인할 수 있다.
한편, 상기 방법에 의해 측정된 개체의 miR-1273g-3p 발현량이 정상인의 평균 발현량과 비교하여 1% 내지 19% 증가된 경우, 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 알츠하이머성 치매 전 단계거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정할 수 있고, 20% 내지 59% 증가된 경우, 경도인지장애를 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정할 수 있으며, 60% 내지 99% 증가된 경우, 알츠하이머성 치매를 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, miR-1273g-3p의 뉴클레오타이드, 그와 상보적인 뉴클레오타이드 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트는 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매이며, 가장 바람직하게는 알츠하이머성 치매의 진단에 이용될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophiles (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 측면으로, 서열번호 1로 표시되어 이루어지는 miR-1273g-3p에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공한다.
상기 “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 상기 miRNA의 서열 정보를 기반으로, 당 분야에 잘 알려진 기술들을 이용하여 상기 프로브 또는 프라이머를 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있으며, 유전자 증폭 키트일 수 있다. 본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
또한, 본 발명은 또 다른 측면으로, 1) 세포주에 miR-1273g-3p를 투여하는 단계, 2) 상기 miR-1273g-3p가 투여된 세포주에 시험물질을 투여하는 단계, 3) 상기 시험물질이 투여된 세포주에서 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계, 및 4) 시험물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "β-Amyloid"는 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 한 절편이며 알츠하이머성 치매 환자에게서 보이는 뇌병리의 중심적인 요소이다. β-Amyloid는 알츠하이머성 치매 환자의 경우 정상인과 다른 어떤 미지의 단백질 분해효소들에 의하여 절단되어 생성되고 서로 응집되어 신경세포의 바깥부위에 침착하고 신경반을 형성한다. 이 β-Amyloid는 직접적으로 산화 스트레스를 유도하고 간접적으로는 소교세포(microglia)를 활성화시켜서 신경에 독성을 나타낸다.
본 발명에서 용어 "BACE1(beta-secretase 1)"은 뇌에서 신경독성 물질인 β-Amyloid 펩티드 생산을 촉발시키는 주요 효소이다. 또한, 본 발명에서 용어 "Nicastrin"은 비교적 큰 분자량의 단백질로 세포막에 존재하는 감마-세크레타제의 구성단위이며, 세포 표면에 존재할 경우에는 니카스트린이 세포 외부로 향해 있으면서 수용체 구실을 한다.
상기 단백질의 활성은 단백질의 발현으로 분석되는 것이다. 일례로, 본 발명에 따른 혈장 miR-1273g-3p를 H4-APPswe 세포주에 투여한 후, 상기 miRNA가 투여된 세포를 시험물질과 접촉시켜 BACE1 및 Nicastrin 발현량의 변화를 시험물질 접촉 전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교함으로써, 발현량에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본 발명에서 단백질의 발현량 분석은 qPCR, 웨스턴 블롯 분석기법을 이용한 혼성화 방법 등과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 H4-APPswe 세포(KM670/671NL)는 인간 교모세포종(glioblastoma) H4 세포에서 APP의 Swedish 돌연변이를 발현시킨 것이다. 상기 세포는 beta-secretase(BACE)에 의한 APP의 비정상 분절을 증가시켜 조발성 알츠하이머성 치매와 타우 단백질(Tau protein)의 과인산화를 유발하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 상기 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 통해 선별된 시험물질을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 통해 선별된 시험물질은 시험물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하였을 때, β-Amyloid(1-42), BACE1 또는 Nicastrin의 발현량을 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 알츠하이머성 치매를 치료할 수 있는 타겟 분자를 발굴하고 이를 타겟으로 하는 의약을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 miR-1273g-3p가 알츠하이머성 치매 환자에게서 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, miR-1273g-3p mimic을 H4-APPswe 세포주에 형질 주입 시킬 경우, 해당 세포주에서 배양액으로 배출되는 베타 아밀로이드의 양이 증가하고, β-Amyloid(1-42) 형성을 촉진 시키는 단백질인 BACE1과 Nicastrin이 증가하는 것 또한 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 혈장 샘플의 확보
1.1. 1차 분석 샘플
신경심리검사를 통해 임상 전문의에게 정상(남자 16명, 여자 20명), 경도인지장애(남자 12명, 여자 12명), 알츠하이머성 치매(남자 20명, 여자 16명)로 진단받은 피험자의 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 제공한 환자의 정보는 하기 표 1과 같다.
| Group | size | Age |
Sex
(f/m) |
MMSE |
| Normal | 36 | 72.86±4.7 | 20/16 | 27.3±2.7 |
| amnestic MCI | 32 | 74.22±4.5 | 20/12 | 25.94±2.5 |
| AD | 36 | 73.58±5.7 | 16/20 | 17.34±8.2 |
1.2. 2차 분석 샘플
신경심리검사 및 아밀로이드 PET 검사를 통해 임상 전문의에게 정상(남자 12명, 여자 12명), 알츠하이머성 치매(남자 12명, 여자 12명)로 진단받은 피험자의 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 제공한 환자의 정보는 하기 표 2와 같다.
| Group | size | Age |
Sex
(f/m) |
MMSE | Amyloid -PET |
| Normal | 24 | 72.08±4.9 | 12/12 | 28.46±1.5 | Negative |
| AD | 24 | 70.83±9 | 12/12 | 19.31±6.2 | Positive |
1.3. 3차 분석 샘플
신경심리검사 및 아밀로이드 PET 검사를 통해 임상 전문의에게 정상(남자 11명, 여자 16명), 전임상 알츠하이머성 치매(남자 5명, 여자 4명), 경도인지장애(남자 5명, 여자 2명), 알츠하이머성 치매(남자 23명, 여자 13명)로 진단받은 피험자의 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 제공한 환자의 정보는 하기 표 3과 같다.
| Group | size | Age |
Sex
(f/m) |
MMSE | Amyloid -PET |
| Normal | 27 | 73.37±3.8 | 11/16 | 27.96±1.4 | Negative |
| Pre-clinical AD | 9 | 73.2±3.7 | 4/5 | 28.22±1.3 | Positive |
| amnestic MCI | 7 | 75.2±5.7 | 2/5 | 25.7±1.7 | Positive |
| AD | 36 | 73.9±8 | 13/23 | 20.05±5.9 | Positive |
실험예
1.
miRNA
변화 분석
상기 실시예 1.1.의 1차 분석 혈장 샘플을 하기와 같이 4개씩 하나로 풀링(pooling)하였다: 정상 9개(남자 4개, 여자 5개), 경도인지장애 6개(남자 3개, 여자 3개), 알츠하이머성 치매 9개(남자 5개, 여자 4개). 이후, 각 혈장 샘플을 1 ㎖씩 준비하였다. 제조사의 지시에 따라 miRNeasy serum/plasma 키트(#217184)(Qiagen, Germany)를 사용하여 혈장으로부터 total RNA를 분리하였다. 이에 대해 DNA Link 사에 의뢰하여 Genchip miRNA 4.0 어레이 분석(Affymetrix, USA)을 수행함으로써 각 혈장 miRNA 양의 시그널 값을 획득하였다. 획득한 시그널 값 중, 모든 샘플에서 absent call이 나타난 miRNA는 후보에서 제외하였다. 획득한 마이크로어레이 시그널 값에 대한 통계 분석(One-way ANOVA)을 통해, 각 실험군에 따라 유의성 있는 변화를 보이는 158개의 miRNA를 선별하였으며, 계층적 군집화를 통해 5개의 클러스터로 구분하였다. 이를 도 1에 나타내었다.
실험예
2.
바이오마커의
선별
상기 실험예 1에서 선별된 158개의 miRNA 중에서, t.test 분석에서도 유의미한 변화를 보이는 것으로 나타난 miRNA 7개(miR-1273g-3p, miR-6798-3p, miR-501-3p, miR-206, miR-193b-5p, miR-106b-3p, miR-29a-3p)에 대해 혈장 내 정확한 발현을 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1.2.의 2차 분석 혈장 샘플 50 μl에서 miRNeasy serum/plasma 키트(#217184)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 11 μl의 total RNA를 분리하였다. miscript RT 키트(#218161)(Qiagen, Germany)를 사용하여 상기 11 μl의 total RNA에 4 μl의 5x Hispec, 2 μl의 10x Nucleic acid mix, 2 μl의 RT mix 및 1 μl의 RNase free DW를 혼합하여 miRNA에 대해 total 20 μl의 cDNA를 합성하였다.
이후, 상기 합성된 cDNA를 37℃에서 1시간, 95℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 200 μl의 DW를 첨가하여 희석하였다. 상기 희석된 cDNA로부터 1 μl를 추출하고, 추출된 cDNA에 3 μl의 2x SYBR green master mix, 0.6 μl의 10x universal primer, 0.6 μl의 10x specific primer(miscript primer assay, Qiagen, Germany) 및 0.8 μl의 DW를 혼합하고, QuantiTect SYBR® Green PCR 키트 (Qiagen, Germany)를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다.
이때, qPCR은 triplication으로 진행하였다. 이후, Roche LightCycler 480을 사용하여 95℃에서 15분동안 [94℃ 15sec, 55℃ 30sec, 70℃ 30sec]x 40 cycle을 수행하였다. 이때, qPCR에 사용한 specific primer 정보는 다음과 같다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
| miRNA name | catalog no. | miRNA sequence | 기타 |
| miR-1273g-3p | MSC0075541 (customized) | ACCACUGCACUCCAGCCUGAG | |
| miR-6798-3p | MSC0075542 (customized) | CUACCCCCCAUCCCCCUGUAG | |
| miR-501-3p | MS00009828 | AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU | |
| miR-206 | MS00003787 | UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG | |
| miR-193b-5p | MS00008939 | CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA | |
| miR-106b-3p | MS00003402 | UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU | |
| miR-29a-3p | MS00003262 | UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA | |
| miR-425-5p | MS00009695 | AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA | Normalization용 |
| miR-23a-3p | MS00031633 | AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC | Normalization용 |
| miR-191-5p | MS00003682 | CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG | Normalization용 |
| miR-451a | MS00004242 | AAACCGUUACCAUUACUGAGUU | Normalization용 |
| Cel-39 (spike -in control) |
miRNeasy serum/plasma 키트에 포함 | positive control |
또한, 혈장 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통해 정상인과 알츠하이머성 치매 환자를 구분할 수 있는지에 대한 그 민감도와 특이도를 확인하기 위해 ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2a에 나타난 바와 같이, miR-1273g-3p만이 알츠하이머성 치매(AD)에서 약 1.6배정도의 유의성 있는 증가를 나타냈다. 도 2b에 나타난 바와 같이, ROC 커브 분석 결과, AUC(area under curve)가 0.78로 나타났다. 이는 miR-1273g-3p의 알츠하이머성 치매 진단 마커로서의 가능성을 나타낸다(t.test, p<0.00063).
실험예
3. 선별된 혈장
miRNA의
조기진단
마커로서의
가능성 확인
알츠하이머성 치매로 인한 신경정신적 문제가 나타나기 전에 혈장 miR-1237g-3p 분석만으로 치매 진단이 가능한지 확인하기 위해, 전임상 알츠하이머성 치매의 혈장 샘플이 포함된 3차 분석 샘플을 확보하였다. miRNeasy serum/plasma 키트(#217184)(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 상기 3차 분석 샘플로부터 total RNA를 분리하였다. miscript RT 키트(#218161)(Qiagen, Germany)를 사용하여 상기 total RNA에서 miRNA에 대해 cDNA를 합성하였고, QuantiTect SYBR® Green PCR 키트 (Qiagen, Germany)를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 실험예 2와 동일하다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, 혈장 miR-1273g-3p의 qPCR 분석을 통해 정상인과 알츠하이머성 치매 환자를 구분할 수 있는지에 대한 그 민감도와 특이도를 확인하기 위해 ROC 커브 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 3차 분석 혈장 샘플에 대하여 qPCR 분석을 통해 miR-1273g-3p의 변화를 확인한 결과, 일부 전임상 알츠하이머성 치매 및 경도인지장애 환자에서 혈장 miR-1273g-3p가 정상인에 비해 증가하는 양상을 나타내었다. 또한, 알츠하이머성 치매 환자에서도 miR-1273g-3p가 약 1.9배 증가하였다. 이는 miR-1273g-3p가 알츠하이머성 치매의 정확한 조기 진단 마커로서 가능성이 있음을 나타낸다. 도 3b에 나타난 바와 같이, ROC 커브 분석 결과, AUC가 0.861로 나타났다. 이는 혈장 miR-1273g-3p의 정확도 높은 알츠하이머성 치매 진단 마커로서의 가능성을 나타낸다.
실험예
4.
miRNA
-1273g-3p의
qPCR
데이터와 신경심리검사 점수와의 상관성 확인
혈장 miR-1273g-3p를 이용한 알츠하이머성 치매 진단이 기존 치매 진단 시 사용되는 신경심리 검사를 대체할 가능성이 있는지 확인하기 위해, 정상(Normal), 전임상 알츠하이머성 치매(PCA), 경도인지장애(MCI) 및 알츠하이머성 치매(AD) 각 실험군 환자의 신경심리검사(K-MMSE, SNSB(Seoul Neuropsychological Screening Battery)) 점수와 혈장 miR-1273g-3p의 qPCR 데이터의 상관성을 확인하였다. 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, K-MMSE 및 SNSB의 메모리 도메인 점수와는 음의 상관관계를 나타내었으며 특히, K-MMSE 점수가 높게 나타나는 알츠하이머성 치매 환자라도 miR-1273g-3p의 양이 정상인보다 높은 범주에 속하는 경우가 확인되었다.
실험예
5. 치매 모델 세포주에서
miR
-1273g-3p의 기능 확인
miR-1273g-3p(서열번호 1)의 증가로 인한 세포 내 변화를 확인하기 위해, miR-1273g-3p mimic(#C-302446-00-0005)(Dharmacon, USA)을 이화여자대학교 목동병원 생화학교실 안정혁 교수님으로부터 분양받은 치매 모델 세포주인 H4-APPswe(APP Swedish mutant(KM670/671NL) overexpressing H4 human neuroglioma cell line)에 형질 주입(transfection) 시켰다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.
6-웰 플레이트에서 웰당 2.5ⅹ105 cells가 되도록 분주한 후, 이를 37℃, CO2 5%, 24시간동안, DMEM(10% FBS)배지를 사용하여 배양하였다. 이후, 100 μl의 OptiMEM과 75 nM의 miRNA mimic을 실온에서 5분간 인큐베이션 하였고, 100 μl의 OptiMEM과 3.75μl 의 Dharmafect 1 reagent를 실온에서 5분간 인큐베이션 하였다. 상기 각각 인큐베이션한 용액을 서로 혼합한 후, 실온에서 20분간 인큐베이션하여 상기 분주된 세포에 처리하였다. 24시간 후, 배양액을 교체하였다. 24시간이 지난 후, 배양액을 모아 β-Amyloid (1-42) ELISA 키트 (#KHB3441, invitrogen) 사용하여 ELISA를 수행하였다. 세포는 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 qPCR을 실시하였고, 구체적인 과정은 하기와 같다.
50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, NaV, NaF 및 Proteinase inhibitor cocktail(Roche)로 구성된 modified RIPA buffer(pH 7.4)를 사용하여 세포를 용해하였다. BCA(bicinchoninic acid assay) 정량 후, 9% 아크릴아마이드 겔에 30 ㎍씩 로딩하여 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. 이후, 100 V의 전압을 가하여 80분동안 PVDF(poly-vinyl difluoride) 막으로 이동시켰고, 실온에서 30분동안 5% skim milk로 블로킹하였다. 1차 항체(anti-nicastrin (#5665S, cell signaling), anti-BACE1 (#B0681, sigma), anti-Actin (#SC-1616, santacruz))를 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였고, HRP(horseradish peroxidase) 결합된 2차 항체를 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 이후, ECL(enhanced chemiluminescence)(#DG-WP250, DoGen)을 처리하여 검출하였다. 또한, 세포의 total RNA를 miRNeasy mini 키트 (#217004, qiagen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 mRNA를 추출하였다. miscript RT 키트 (#218161)(Qiagen, Germany)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, QuantiTect SYBR® Green PCR 키트 (Qiagen, Germany)를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 실험예 2와 동일하다. 이를 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, miR-1273g-3p mimic을 H4-APPswe 세포에 형질 주입 시킨 경우, 음성대조군(N.C.)에 비해 해당 세포주에서 배양액으로 배출되는 β-Amyloid(1-42)의 양이 증가하였다. 또한, 도 5b 및 도 5c에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석기법을 이용하여 β-Amyloid(1-42)의 형성을 촉진시키는 단백질인 BACE1 및 Nicastrin의 발현 수준을 평가한 결과, 이들 모두 유의미하게 증가하였다. 이후, 도 5d에 나타난 바와 같이, qPCR 분석을 통해 BACE1 및 Nicastrin의 mRNA 발현 수준을 평가한 결과, BACE1 및 Nicastrin 단백질은 mRNA 발현부터 증가하는 것으로 나타났다.
이를 통해, miR-1273g-3p의 증가를 조기에 발견하고 그 발현을 감소시킬 수 있다면, 상기 miRNA가 알츠하이머성 치매의 발병을 늦출 수 있는 하나의 치료제 타겟으로서 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
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accacugcac uccagccuga g 21
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aaaccguuac cauuacugag uu 22
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 1) 개체로부터 채취된 혈액에서 혈장 miR-1273g-3p의 발현량을 측정하는 단계;
2) 상기 miRNA의 발현량과 정상인의 miR-1273g-3p 발현량을 비교하는 단계; 및
3) 상기 miRNA의 발현량이 정상인의 miR-1273g-3p 발현량에 비해 높은 경우, 개체가 알츠하이머성 치매 전 단계, 경도인지장애 단계 및 알츠하이머성 치매 단계에서 선택되는 어느 하나의 상태라고 판정하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제3항에 있어서,
정상인의 평균 miR-1273g-3p 발현량에 비해 miR-1273g-3p의 발현량이 1% 내지 19% 증가된 경우, 알츠하이머성 치매 전 단계라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법. - 제3항에 있어서,
정상인의 평균 miR-1273g-3p 발현량에 비해 miR-1273g-3p의 발현량이 20% 내지 59% 증가된 경우, 경도인지장애라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법. - 제3항에 있어서,
정상인의 평균 miR-1273g-3p 발현량에 비해 miR-1273g-3p의 발현량이 60% 내지 99% 증가된 경우, 알츠하이머성 치매라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법. - 제3항에 있어서,
상기 miRNA의 발현량 측정은 qPCR 또는 노던 블롯 분석법으로 수행하는 것인, 정보 제공 방법. - miR-1273g-3p의 뉴클레오타이드, 그와 상보적인 뉴클레오타이드 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트로서,
상기 진단은 개체로부터 채취된 혈액에서 혈장 miR-1273g-3p의 발현량을 기초로 판정하는 것을 특징으로 하는, 키트. - 서열번호 1로 표시되어 이루어지는 miR-1273g-3p에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트로서,
상기 진단은 개체로부터 채취된 혈액에서 혈장 miR-1273g-3p의 발현량을 기초로 판정하는 것을 특징으로 하는, 키트. - 1) 세포주에 miR-1273g-3p를 투여하는 단계;
2) 상기 miR-1273g-3p가 투여된 세포주에 시험물질을 투여하는 단계;
3) 상기 시험물질이 투여된 세포주에서 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계; 및
4) 시험물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 β-Amyloid(1-42), BACE1 및 Nicastrin으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제 스크리닝 방법. - 제10항에 있어서,
상기 세포주가 H4-APPswe 세포주인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법. - 제10항에 따라 스크리닝된 물질을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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| Molecular Neurobiology, 53:5772-5781 (2016) |
| Respitory Research, 18:4 (2017.01.05.) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102066726B1 (ko) | 2019-02-15 | 2020-01-15 | 충북대학교 산학협력단 | 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 |
| KR102135130B1 (ko) | 2019-02-15 | 2020-07-17 | 충북대학교 산학협력단 | 트랜스타이레틴 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180135703A (ko) | 2018-12-21 |
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