KR20180078783A

KR20180078783A - 알츠하이머병 진단을 위한 신규한 miRNA

Info

Publication number: KR20180078783A
Application number: KR1020160183914A
Authority: KR
Inventors: 이건호; 송우근; 이정훈; 김소희
Original assignee: 광주과학기술원; 조선대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-07-10

Abstract

본 발명의 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매의 조기 진단에 이용될 수 있는 바이오마커 miRNA에 관환 것이다. 보다 상세하게는 상기 바이오마커는 서열번호 1의 miR-16-5p로 구성되며, 알츠하이머병에 의해 그 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매의 진단용 바이오마커 조성물 및 진단키트에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병 진단을 위한 신규한 miRNA {A novel miRNA for diagnosing Alzheimer’s disease}

본 발명은 알츠하이머병 진단을 위한 신규한 바이오마커로서 사용될 수 있는 miRNA 조성물 및 이를 포함하는 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매 진단키트에 관한 것이다.

치매 환자의 급증은 이러한 초고령화로 인한 가장 심각한 문제의 하나이다. 2012년 보건복지부 조사에 따르면 당시 65세 이상 치매 노인은 53만4천명으로, 65세 이상 전체 노인 589만 명 중 9%가 치매노인으로 파악되고 있다. 치매는 비가역적으로 진행되는 질병으로, 초기에 진단이 이루어지지 않으면 발병 후 치료 및 회복 불가능하다. 미국연방식품의약청 (FDA)이 승인한 타크린, 도네페즐, 리바스티그민, 갈란타민은 치매 치료제라기보다는 치매 증상을 완화 시키고 병의 진전 속도를 늦출 수 있는 효과가 있다. 치매는 예방과 조기검진을 통한 발병 지연과 선제적 관리가 유일한 대안이다. 치매로 인한 사회적 비용은 2013년 11조7000억원에서 2050년 43조2000억원 (GDP의 1.5%)까지 늘어날 것으로 예측 (치매노인 실태조사, 보건복지부, 2013) 된다. 최근 들어 치매로 인한 자살이나 간병인 살인, 실종 등이 증가하고 있으며, 치매환자 가족들의 삶의 질 저하 및 극심한 정신적 스트레스로 인한 가정파탄 등이 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 치매 조기검진과 약물치료를 시행할 경우 연간 1조3,000억원에서 2조8,000억원의 사회적 비용 절감효과를 기대할 수 있는 것으로 분석되고 있다 (국회예산정책처, 2014). 분석에 따르면, 치매 발병의 2년 지연은 20년 후 유병률을 20% 감소시킬 수 있는 것으로 예측된다. 2012년 국내 전체 치매 인구 중 알츠하이머성 치매가 71.3%로 1위를 차지한다. 대부분의 알츠하이머성 치매는 65세 이상 고령층에서 산발적으로 발생한다.

현재 임상에서 이용되고 있는 치매 검진기술로는, 인지심리검사로서,　간이정신상태검사(MMSE), 몬트리올 인지검사(MoCA) 및 후각인지도검사 (UPSIT) 등이 있으며, 국내에서는 SNSB (Seoul Neuropsychological Screening Battery)가 널리 활용되고 있다. 이와 같은 신경심리검사 및 후각인지도검사는 신체적, 심리적 및 인종학적 영향 등 주관적인 판단이 필요하므로 이를 정량화 하는 것이 어렵고, 장시간 검사를 해야 하며, 비용도 고가로서 이를 널리 이용하는 것이 어렵다. 또한, 초기 치매에서는 증상이 나타나지 않는 경우가 많아 인지기능 검사만으로 치매를 진단하는 것은 어려운 일이다. 또한, 뇌척수액 검사로서, 알츠하이머성 치매의 대표적 특이 물질인 β-아밀로이드 또는 타우 (tau) 단백질의 뇌척수액 내 정량을 통한 진단방법이 있다. 그러나, 뇌척수액 검사를 위한 척수천자는 큰 통증을 수반하여 피험자의 거부감이 큰 단점이 있다. 혈액검사를 통한 치매진단방법으로서, β-아밀로이드 (β-Amyloid)가 "LRP1"이라는 단백질을 통해 뇌에서 혈액으로 이동한다는 사실에 착안하여, β-아밀로이드의 혈액 내 농도를 검사하는 방법이 보고된 바 있다. 그러나, 혈액 내 β-아밀로이드 농도가 매우 낮기 때문에 기존 병원에서 쓰고 있는 혈액 분석 장비로는 정확한 측정이 어려운 단점이 있다. 미량의 β-아밀로이드를 정밀하게 분석할 수 있는 기술 개발이 필요할 것이다. 또한, 아포지질단백질 (apolipoprotein) E4 (ApoE4) 대립유전자 (allele)의 유무 등 차세대유전자서열분석기술 (NGS)을 이용한 인간유전체전체변이분석 (GWAS)을 통하여 치매 특이적 변이를 진단에 이용하고자 하는 시도가 지속적으로 이어지고 있다. 또 다른 방법으로서, PET/MIR 뇌영상 촬영을 이용한 방법이 있다. 이 방법은 MRI 영상을 통해 대뇌피질, 해마 위축 등 치매와 동반되는 뇌손상을 진단한다. 그러나, MIR/PET 뇌영상 촬영을 이용한 진단은 알츠하이머병 상당히 진행된 후에 분석이 가능하므로 조기진단에 어려움이 있으며, 비용 또한 고가이다.

한편, 혈액 내 miRNA는 매우 안정한 상태로 존재하며, miRNA의 혈액 내 발현패턴이상 또는 기능이상은 알츠하이머성 치매의 후성유전학적 요인으로서 작용할 것으로 예측된다. miRNA는 약 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로서, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현조절 등의 기능을 하는 유전물질 이다 (Ambros el al., Nature, 2004). miRNA는 혈액 등 여러 가지 체액에 존재하며, 소포체 등에 둘러싸여 있어 안정한 상태로 존재한다고 알려졌다 (Turchinovich et al., Trends in biochemical science, 2012). 이에 따라 혈액 내 존재하는 miRNA의 변화를 분석하여 질병의 바이오마커로 사용하고자 하는 연구가 진행되고 있다 (Dorval et al., Front. Mol . Neurosci ., 2013). 본 발명자들은 알츠하이머병의 "정상"인 개체 즉, 알츠하이머병에 걸리지 않은 개체로부터 분리한 시료와 알츠하이머병을 가진 개체들로부터 분리한 생물학적 시료들에서 miRNA의 발현 수준을 비교하고, 차별적으로 존재하는 miRNA를 확인하여, 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 miRNA를 발견하고자 노력하였다. 그 결과 놀랍게도 miR-16-5p는 혈액에서 감소된 수준으로 측정될 때 알츠하이머병을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

Circulating microRNAs in Alzheimer's disease: the search for novel biomarkers. (Dorval et al., Front. Mol. Neurosci., 2013 Aug 30;6:24) Extracellular miRNAs: the mystery of their origin and function. (Turchinovich et al., Trends in biochemical science, 2012 Nov;37(11):460-5) Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic Alzheimer's disease correlates with increased BACE1/beta-secretase expression. (Hebert et al., PNAS, 2008 Apr 29;105(17):6415-20)

본 발명의 목적은 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머에 의한 치매 진단을 위한 miRNA 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 miRNA 바이오마커를 이용하여 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머에 의한 치매를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머성 치매 치료제를 스크리닝 하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 miRNA 바이오마커를 이용한 알츠하이머병 및/또는알츠하이머성 치매 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매를 정확하게 진단하는데 사용되는 신규한 miRNA 바이오마커로서, miR-16-5p (서열번호 1: UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 타액을 포함하여 분리된 시료로부터 miRNA를 검출하여 알츠하머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매를 진단한다. 상기 시료는 무-세포 시료 및/또는 미세소포 (microvesicle)가 없는 시료일 수 있으며, 바람직하게는 혈장 또는 혈청이다. 본 발명에서, 적합한 정상 대조군과 비교하여 시료를 분리한 개체에서 확인되는 miRNA-16-5p의 수준 차이가 상기 개체에서 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매를 나타낸다. 특히, 정상 대조군과 비교하여 증가된 수준의 miRNA-16-5p는 개체에서 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매를 나타낸다. 일 구현예에서, 알츠하이머병 진단을 위한 추가적인 검사 예를 들어, 간이정신상태검사 (MMSE), 몬트리올인지검사 (MoCA), 후각인지도검사 (UPSIT), SNSB (Seoul Neuropsychological Screening Battery) 및 시계-그리기 검사 등이 포함될 수 있다. 다른 일 구현예에서, 알츠하이머병 치료제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하고, 투여 전후에서의 miRNA-16-5p 수준을 측정하는 것을 포함 할 수 있다. 알츠하이머 치료제는 예를 들어, 갈란타민 (galantamine), 리바스티그민 (rivastigmine) 및 도네페질 (donepezil)을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 분리된 시료에서의 상기 miRNA-16-5p의 수준은 예를 들어, 정량적 PCR, 증폭방법, 혼성화방법, 또는 서열결정방법 등에 의해 측정될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 관점에서, 본 발명은 개체에서 분리한 miRNA-16-5p를 함유하는 제 1 시료에서 miRNA-16-5p의 수준을 결정하고, 상기 제 1 시료를 분리한 후 개체로부터 분리한 제 2시료에서 miRNA-16-5p의 수준을 결정하며, 상기 제 1 시료 및 제 2 시료에서 측정된 miRNA-16-5p의 수준을 비교하는 것을 포함하여, 개체에서 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매의 진행을 모니터링 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 miRNA-16-5p 수준을 검출하는 제제 예를 들어, 프라이머 또는 프로브, 및 상기 miRNA-16-5p 수준을 결정하기 위한 지침을 포함하는, 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 키트를 제공한다. 상기 프라이머는 공지되어 있는 miRNA-16-5p의 서열로부터 종래기술을 이용하여 이들 유전자 혹은 유전자의 특정영역을 특이적으로 증폭할 수 있도록 디자인할 수 있으며, 이러한 프라이머의 디자인은 당업자라면 용이할 것이다. 본 발명의 진단 키트를 이용한 바이오마커의 동정 또는 검출에는 당업계에 알려진 일반적인 방법이 포함될 수 있다. 즉, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이를 활용하여 상기 바이오마커의 발현량을 측정할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 본 발명의 진단 키트는 상기 분석 방법에 따라 적절한 형태로 구성되며, 각 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR용 키트는 테스트 튜브, 완층액, 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs), 각종 효소, 사용 매뉴얼 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서, miRNA-16-5p 단백질 또는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 상기 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 유전자의 발현량이 상승조절 (up regulation) 되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 알츠하이머병 및 알츠하이머성 치매 치료제임을 판별하는 단계를 포함하여, 알츠하이머병 및 알츠하이머성 치매의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 기술된 방법 또는 키트에 있어서, 정상 대조군과 비교한 miRNA-16-5p 수준의 차이는 소프트웨어 알고리즘으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 다르게 정의되지 않은 경우, 본 명세서에서 사용된 모든 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 해석된다.

본 발명에서 용어 "개체"는 인간을 포함하는 포유동물을 의미하며, "정상"인 개체 또는 정상 대조군은 알츠하이머병을 가지지 않은 개체를 의미한다.

본 발명에서 용어 "치료"는 개체에서 질환의 적어도 하나의 증상을 완화 또는 경감시키는 것을 의미한다. 특히, 알츠하이머병에 있어서, 인지 손상 또는 전반적 기능성의 완화, 경감, 또는 진행성 퇴화를 지연 또는 역전시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 “치료”는 질환 또는 질환의 증상의 임상적 소견 이전에 발병을 지연하거나 예방하는 것 및/또는 질환의 증상을 발생시키거나 악화시킬 위험성을 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어 "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"는 보통 주어진 수치 또는 범위의 5% 이내, 또는 더욱 바람직하게는 1% 이내를 의미한다.

본 발명에서 통계학적 유의성을 위한 테스트는 t-테스트, ANOVA, 니스칼-월리스 (Kniskal-Wallis), 윌콕슨 (Wilcoxon), 만-휘트니 (Mann-Whitney), 및 교차비 (oddsratio)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 miRNA-16-5p 바이오마커는 알츠하이머병 상태가 이전에 알려지지 않았거나 알츠하이머병이 있는 것으로 의심되는 개체의 알츠하이머병 상태를 확인하는 데 사용될 수 있다. 정상 개체와 비교 시 상기 miRNA-16-5p 바이오마커의 수준에서의 차이를 가진 개체는, 초기-단계 알츠하이머병, 중등도 또는 중간-단계 알츠하이머병, 또는 중증 또는 말기-단계 알츠하이머병을 포함하는 알츠하이머병을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 miRNA-16-5p 바이오마커는 경도인지장애를 진단하는 데 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에 따르면 혈액 내 존재하는 유전물질인 miRNA의 정량적 변화를 분석함으로써, 알츠하이머성 치매를 보다 더 정확하게 진단할 수 있다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 진단방법은 종래 뇌척수액 채취를 위한 척수천자와는 달리 비교적 비침습적이며, 보다 더 적은 비용으로 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

도 1은 마이크로어레이분석을 통한 혈장 miRNA 양의 시그널 값을 나타낸 것이다.
도 2는 마이크로어레이를 통한 혈장 miRNA 양의 시그널 값 분석에 있어, WT (야생형)과 5xFAD의 혈장에서 상반된 패턴을 나타내는 클러스터에 속하는 16개 miRNA를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 도 2에서 확인한 16개 miRNA 중 상위 5개 miRNA에 대해 qPCR을 수행하여 변화를 확인한 것이다.
도 4는 WT과 5xFAD 쥐의 뇌 조직을 분리하고 대뇌피질 (cortex), 시상 (thalamus) 및 해마 (hippocampus) 부위를 포함한 영역에서 miR-16-5p의 각 부위별 발현량을 분석한 결과이다.
도 5는 miR-16-5p가 β-아밀로이드 플라크 주변에 존재하는 세포에서 발현이 증가하는 것을 확인한 것이다.
도 6은 miR-16-5p의 발현증가가 β-아밀로이드 (1-42)에 미치는 영향을 치매모델 세포 주를 사용하여 실험한 결과이다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실험재료

본 발명에서 사용한 5xFAD 알츠하이머성 치매 모델 쥐는 5개의 알츠하이머성 유발 유전자를 과발현시킨 동물 모델로서 (Jackson Laboratory, 중앙실험동물에서 구매 대행)에서 입수하였다. 상기 쥐는 2개월령에서부터 β-아밀로이드 플라크를 형성하기 시작하며, 전형적인 알츠하이머성 치매 표현형인 신경면역반응 및 기억력 감소 등을 관찰할 수 있는 효과적인 치매동물 모델이다. 각각 1, 2, 3, 4, 6 및 9개월령의 WT (야생형) 및 5xFAD 수컷 쥐에서 각각 600 ~ 900 ㎕의 혈액을 채취하고, 원심분리 (4℃, 4,000 g, 10분)를 2회 수행하여 300 ~ 400 ㎕의 혈장을 분리하였다. 3 ~ 4마리의 혈장샘플을 하나로 풀링 (pooling) 하여 각 연령별로 WT, 3개 샘플 및 5xFAD, 3개 샘플을 준비하였다. Qiagen사의 RNeasy mini kit를 제조자의 지시에 따라 사용하여 혈장에서의 miRNA를 분리하였다.

실험예

실험예 1. miRNA 변화분석 및 바이오마커 선별

Affymetrix사의 Genchip miRNA 4.0 Array 분석을 수행하여 각 혈장 miRNA 양의 시그널 값을 수득하였다. 수득한 시그널 값 중 모든 샘플에서 absent call이 나타난 miRNA는 후보에서 제외하였다. 수득한 마이크로어레이 (microarray) 시그널 값에 대한 통계분석을 통해, 연령이 증가함에 따라 WT과 비교하여 5xFAD의 혈장에서 유의성 있는 특이적 변화를 보이는 86개의 miRNA를 선별하였다 (Two-way ANOVA, p<0.05) (도 1). 86개의 miRNA의 마이크로어레이 시그널 값에 대해 계층적 클러스터링 (Hierarchical Clustering)을 수행하여, WT과 5xFAD에서의 miRNA 변화 패턴이 정반대로 나타나는 클러스터를 선별하였다 (도 1 참조). 상기 클러스터는 클러스터는 16개의 miRNA로 구성된 것이 확인되었다. 해당 클러스터에 속하는 16개의 miRNA의 마이크로어레이 시그널 값을 도 2에 나타내었다. 16개 miRNA 중 p 값이 상위 5번째 내로 속하는 5개의 miRNA를 qiagen SYBR Green을 이용하여 동일 샘플에 대해 qPCR 분석을 수행함으로써 그 변화를 명확히 확인하였다. 그 결과 miR-101b-3p를 제외한 4개의 miRNA는 모두 마이크로어레이 분석결과와 비슷한 패턴이 확인됨 (Two-way ANOVA, p<0.01) (도 3). 또한 각 연령별 WT과 5xFAD간의 다양한 차이도 유의성이 있는 것으로 나타났다 (Student t.test) (도 3 참조). qPCR 분석을 수행한 4개의 miRNA 중 miR-16-5p (서열번호 1: UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (22mer)))가 혈액 내 가장 많은 양으로 존재하는 것으로 나타났다 (도 3). miR-16-5p의 기능 규명을 위한 추가 실험을 수행하였다.

실험예 2. miR -16-5p의 기능 규명

miR-16-5p의 뇌 조직 내 발현변화를 분석하기 위해, 각각 1, 3, 6 및 9개월령 WT과 5xFAD 쥐의 뇌 조직을 분리하여 대뇌피질 (cortex), 시상 (thalamus), 및 해마 (hippocampus) 부위를 포함한 영역으로 분리하였다. 분리된 각 조직에서 트리아졸 (Trizol)을 사용한 방법을 통해 (Trizol reagent, #15596, ambion)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 제조사의 지시에 따라 역전사반응을 통해 miR-16-5p의 cDNA를 합성하였다 (miscript RT kit 사용, #218161, Qiagen). 이후 qPCR (사용 프라이머: 5'UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG, miscript primer assay #218300, Qiagen) (사용 제품 : SYBR Green PCR kit, #218076, Qiagen)(qPCR 기계:LightCycler 480, Roche) 을 통해 miR-16-5p의 각 부위별 발현량을 분석하였다.

그 결과 6개월령 및 9개월령 5xFAD 쥐의 시상 (thalamus) 포함 부위에서 miR-16-5p의 양이 10% 이상 유의성 있게 증가하는 것이 확인되었다 (Student t.test, p<0.05) (도 4). 뇌 조직 내 miR-16-5p의 발현양상과 β-아밀로이드 플라크 형성과의 관계를 확인하기 위해, 6개월령과 9개월령 WT과 5xFAD 쥐 뇌조직의 in situ 교잡 (hybridization)과 면역조직화학 (immunohistochemistry)을 통해miR-16-5p와 β-아밀로이드 플라크를 동시에 염색하였다. 이를 위해, 먼저, 6, 9 개월령의 WT과 5xFAD 뇌조직을 시상면으로 절단 (sagittal section)하고 냉동 슬라이드를 제작하여, 실험을 위한 샘플을 준비하였다. miR-16-5p 탐지는 Exiqon에서 제조한 miR-16-5p double DIG probe (# 18062-15)를 사용하였다. 형광물질이 표지된 anti-DIG-POD Fab fragments (#11207733910, Roche)로 miR-16-5p double DIG probe를 표지하였다. anti-6E10 (Amyloid beta 42) 마우스 항체 (#SIG-39300, Covance)로 β-아밀로이드 플라크를 탐지하고, 형광물질이 표지된 anti-mouse antibody (#A31571, invitrogen)로 형광 표지하였다. 공초점 현미경(Olympus,FV1000)을 이용하여 miR-16-5p의 발현양상을 분석하였다. 그 결과 miR-16-5p 발현이 β-아밀로이드 플라크 주변에 존재하는 세포에서 증가하는 것으로 나타났다 (도 5).

다음, miR-16-5p가 증가하였을 때, β-아밀로이드 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 miR-16-5p mimic (Dharmacon, #C-300483-03-005)을 75 nM로 치매 모델 세포주 H4-APPswe 세포 (APP swedish mutant(KM670/671NL) overexpressing H4 human neuroglioma cell line, 이화여자대학교 목동병원 생화학교실 안정혁 교수님으로부터 분양받음)에 형질주입시키는 실험을 수행하였다. 음성대조군 (N.C.)과 비교하여, miR-16-5p mimic을 형질주입시켰을 경우, 해당 세포 주에서 배양액으로 배출되는 β-아밀로이드 (1-42)의 양이 증가하는 것이 관찰되었다 (도 6a) (β-아밀로이드 (1-42) 측정방법: amyloid-beta 42 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit를 제조사의 지시에 따라 사용, life technology, #KHB3442). 또한 miR-16-5p의 양을 감소시킬 수 있는 상보적염기서열의 miRNA 억제제인 miR-16-5p 저해제 (inhibitor) 75nM (Dharmacon, #IH-300483-05-005)를 처리한 경우 반대로 음성대조군 (N.C.) 보다 β-아밀로이드 (1-42)의 배출되는 양이 증가 하는 것으로 나타났다 (도 6a). 이와 같은 결과는 기존에 BACE1을 타겟으로 하는 것으로 알려진 miRNA인 miR-29a-3p (Hebert et al., PNAS, 2008)를 과발현시켰을 때 β-아밀로이드 (1-42)의 양이 감소되지 않는 것과 비교하면, miR-16-5p가 훨씬 더 강력한 알츠하이머성 치매 마커로서 기능을 할 수 있음을 뒷받침한다. 또한, 이러한 결과는 miR-16-5p의 발현증가가 β-아밀로이드 플라크 주변의 세포에서 나타나는 방어기제로서 작용함을 시사한다. miR-16-5p로 인한 β-아밀로이드 (1-42) 감소가 기존에 알려졌던 타겟인 BACE1 외에도 β-아밀로이드의 형성을 촉진시키는 단백질 중 하나인 프레세닐린-1 (Presenilin-1) (PS-1) 또한 감소시키는 것으로 나타났다 (도 6b).

본 발명은 알츠하이머성 치매를 혈액 중의 단백질 마커를 사용하여 진단함으로써, 보다 더 저렴하고 용이하게 치매를 진단할 수 있은 방법을 제공한다. 본 발명의 miRNA를 매개로 한 알츠하이머성 치매의 발병 메커니즘 규명을 통해, miR-16-5p를 타겟으로 한 신규한 알츠하이머병 치료제 개발 가능성을 제공한다. 본 발명의 치매 특이 miRNA 데이터베이스는 척수액 (CSF) 내 단백질 정량, 단일염기다형성(SNP) 등의 복합적인 바이오정보와 더불어 치매관련 빅데이터를 이용한 미래 진단기술의 발전에 기여할 수 있다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> A novel miRNA for diagnosing Alzheimer's disease <130> CSU16P-0001-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-16-5p <400> 1 uagcagcacg uaaauauugg cg 22

Claims

서열번호 1의 miR-16-5p를 포함하는, 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 에 의한 치매를 진단하기 위한 바이오마커 조성물.
miR-16-5p의 발현량을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 키트.
제 2항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인, 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 miR-16-5p와 동일한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 키트.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단 키트의 검체는 혈액인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매를 진단하기 위한 키트.
(a) 개체에서 분리한 miRNA-16-5p를 함유하는 제 1 시료에서 miRNA-16-5p의 수준을 결정하고,
(b) 상기 제 1 시료를 분리한 후 개체로부터 분리한 제 2시료에서 miRNA-16-5p의 수준을 결정하며,
(c) 상기 제 1 시료 및 제 2 시료에서 측정된 miRNA-16-5p의 수준을 비교하는 것을 포함하여,
개체에서 알츠하이머병 및 알츠하이머병에 의한 치매의 진행을 모니터링 하는 방법.
하기 단계를 포함하는 알츠하이머병 및 알츠하이머성 치매의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법:
(a) miRNA-16-5p 단백질 또는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 유전자의 발현량이 상승조절 (up regulation) 되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 알츠하이머병 및 알츠하이머성 치매 치료제임을 판별하는 단계.