CN112980941A

CN112980941A - 一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN112980941A
Application number: CN202110233754.1A
Authority: CN
Inventors: 贾建平; 贾龙飞; 刘文颖; 杨坚炜; 庞亚娜
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-03-03
Also published as: CN112980941B

Abstract

本申请具体涉及一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。本申请的方法能够替代传统的脑脊液的p‑tau/Aβ检测，通过7种miRNA实现对AD的诊断，并且，不仅能够区分AD患者与正常人员，还能够区分AD患者与其他痴呆患者。

Description

一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒及其用途

技术领域

本申请涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学诊断领域。本申请具体涉及一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)最常见的生物标志物是Aβ和tau，它们可以通过脑脊液或PET成象检验。然而这个过程是有创的，且非常昂贵，难以在人群中普遍应用。此外，AD与其他类型的痴呆，如血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)、路易体痴呆(DLB)等，可能存在重叠的临床表现、病理和生物标志物，往往导致临床诊断困难。

miRNA是一种长度约为20-25个核苷酸的短的非编码RNA，与miRNA靶标的3'非翻译区(UTR)互补位点结合抑制其表达。越来越多的研究证实了miRNAs与AD之间的关系。miRNAs调控APP的表达和参与APP代谢的蛋白，如α-分泌酶、ADAM10、β-分泌酶和BACE1。miRNAs也在Aβ清除中发挥重要作用：例如，miRNAs可以下调ApoE脂化和TREM2水平，并削弱脑内Aβ代谢。此外，miRNA水平与脑内tau蛋白的表达和过度磷酸化相关，并参与AD其他相关机制，如线粒体功能异常、自噬、线粒体自噬、神经递质释放和清除和突触可塑性。以往的研究样本量小，且未经脑脊液核心标志物证实临床诊断，限制了其临床转化。

基于上述问题，AD的临床治疗急需一种可有效诊断AD及鉴别AD与其他类型痴呆的方法。

发明内容

本申请发明人通过检测AD患者血液中的miRNA水平，发现了7个与p-tau/Aβ比例有显著相关性的miRNA，通过这7种miRNA建立了AD患者脑脊液p-tau/Aβ比例预测计算模型，并在两个独立人群中验证了该模型的诊断效能，证实了由血液中7种miRNA组成的模型能够准确预测脑脊液中P-tau/Aβ42的比值。因此，这7种miRNA有助于AD的诊断，并且，可以区分AD患者和其他类型痴呆。

因此，在第一方面，本申请提供了一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的方法，其包括：

(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；

(2)测定生物样品中生物标志物的水平；和

(3)基于所述生物标志物的水平，诊断受试者是否患阿尔茨海默病；

其中，所述生物标志物为miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p，miR-485-5p，miR-10a-5p，miR-26b-5p和miR-451a-5p。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆。在某些实施方案中，在进行步骤(2)之前，对所述生物样品进行预处理，以获得外泌体；然后进行步骤(2)，即，测定外泌体中生物标志物的水平。对生物样品(例如全血，血清和血浆)进行处理以获得外泌体的方法是本领域技术人员已知的。例如，可使用商业化的试剂盒(例如ExoQuick、Exoeasy)从生物样品(例如全血，血清和血浆)中分离获得外泌体。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过将所述生物标志物的水平与参考值进行比较，从而诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是miRNA的水平。在此类实施方案中，所述参考值是所述mRNA在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中，通过定量PCR(例如，实时荧光定量PCR)来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，相对于参考值，外泌体中miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p和/或miR-485-5p的水平的降低表明，受试者患有AD。在某些实施方案中，相对于参考值，脑脊液中miR-10a-5p，miR-26b-5p和/或miR-451a-5p的水平的升高表明，受试者患有AD。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述4种生物标志物的水平进行岭回归，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者患神经退行性疾病的风险。

在某些实施方案中，所述方法还包括，确定受试者的年龄、性别和ApoEε4基因型。在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述4种生物标志物的水平进行岭回归，并且用年龄、性别和/或ApoEε4基因型进行校正，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述miR-139-3p的序列如SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，所述miR-143-3p的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些实施方案中，所述miR-146a-5p的序列如SEQ ID NO:3所示。在某些实施方案中，所述miR-485-5p的序列如SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，所述miR-10a-5p的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述miR-26b-5p的序列如SEQ ID NO:6所示。在某些实施方案中，所述miR-451a-5p的序列如SEQID NO:7所示。

在某些实施方案中，所述方法能够诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

在第二方面，提供了一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p，miR-485-5p，miR-10a-5p，miR-26b-5p和miR-451a-5p。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含：用于确定受试者的miR-139-3p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-146a-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-10a-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-26b-5p水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-451a-5p水平的第七试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，所述杂交技术选自Northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法。

在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-139-3p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-146a-5p水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-10a-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-26b-5p的水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第七试剂或试剂组合包含能够定量miR-451a-5p的水平的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述试剂盒具有下列的特征：(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-139-3p的水平的引物和/或探针；(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针；(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-146a-5p水平的引物和/或探针；(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针；(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-10a-5p的水平的引物和/或探针；(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-26b-5p的水平的引物和/或探针；(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量miR-451a-5p的水平的引物和/或探针。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，所述扩增技术选自qPCR，RT-PCR，Stem-loop PCR，Poly APCR，RCA，测序。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，其中，所述生物样品为获自受试者的全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品选自外周血。

在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆(例如，血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)、路易体痴呆(DLB))的受试者。

在第三方面，本申请提供了用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病；其中，所述生物标志物为miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p，miR-485-5p，miR-10a-5p，miR-26b-5p和miR-451a-5p。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含用：于确定受试者的miR-139-3p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-146a-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-10a-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-26b-5p水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-451a-5p水平的第七试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

术语解释

如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是一类进行性发展的疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征。主要包括帕金森病(PD)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知功能障碍(MCI)和肌肉萎缩侧缩硬化症(ALS)等。

如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病(AD)”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于AD的诊断可采用磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)和生物标志物诊断等方法。

如本文中所使用的，术语“外泌体(exosome)”是指直径大约为30-150nm的微小膜泡，由多种细胞分泌，含有特定的蛋白质(例如，外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族CD63,CD81和CD9)、脂质、细胞因子或遗传物质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

如本文中所使用的，术语“生物标志物(Biomarker)”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能患的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

如本文中所使用的，术语“参考值”是指生物标志物的预定值，其是根据对照样品(例如获自正常人群的生物样品)的生物标志物的水平得出的。参考值可以用作阈值，以区分可能存在疾病风险的受试者和不存在该疾病风险的受试者。参考值可以是相对值，有上限和下限的数值范围，平均值，中间值等。本领域技术人员根据现有技术中公开的方法可以选择合适的对照样品、测定并获得参考值。上述方法可以参见，例如，Burtis C.A.et al.,2008,Chapter 14,section“statistical treatment of reference values，其以全部引用方式并入本文。

如本文中所使用的，术语“ApoEε4基因型”是指ApoE基因的一种变异形式，APOE基因有多种可能的变异形式，例如，ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4。一些研究表明，携带APOE基因ε4变异体的人群在晚年更容易发展为阿尔茨海默病。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“APP(myloid beta(A4)precursor protein)基因”在早期老年痴呆的发病中起重要作用。目前发现，APP基因共有6种错义突变。

发明的有益效果

本申请的方法能够替代传统的脑脊液的p-tau/Aβ检测，通过7种miRNA实现对AD的诊断，并且，不仅能够区分AD患者与正常人员，还能够区分AD患者与其他痴呆患者(例如，血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)、路易体痴呆(DLB))。本申请的方法仅取血液(例如，外周血)即可完成检测，相较传统的腰椎穿刺脑脊液检测，本申请方法具有以下有益技术效果：(1)具有几乎无创伤，低风险等优势；(2)具有成本低的优势，可在社区或简易的医疗机构完成，受检测人员无需住院；(3)可在大范围人群中筛查AD，使得大范围的老年人口筛查成为可能；(4)无需在医院或专业医疗机构完成；(5)成本低廉。

附图说明

图1显示了认知正常对照组与AD患者脑脊液中Aβ42和P-tau水平。

图2显示了对29个上调和31个下调的miRNA进行分层聚类后的热图(数据集1)。

图3显示了数据集2中对照组和AD组的7种miRNA的测量结果。

图4显示了建立的预测模型，其中，图4A显示了数据集2中7个miRNAs与p-tau/Aβ的显著性结果，图4B显示了数据集3中7个miRNAs与p-tau/Aβ的显著性结果，图4C显示了数据集2中AD患者及对照组的p-tau/Aβ预测结果，图4D显示了数据集3中AD患者及对照组的p-tau/Aβ预测结果，图4E显示了数据集2中7个miRNA预测的p-tau/Aβ比例的AUC值，图4F显示了数据集3中7个miRNA预测的p-tau/Aβ比例的AUC值。

图5显示了数据集3中对照组和AD组的7种miRNA的测量结果。

图6显示了数据集4中对照组、AD、VaD、PDD、bvFTD和DLB的7种miRNA的测量结果。

图7A显示了数据集4中7个miRNAs与p-tau/Aβ的显著性结果，图7B显示了数据集4中AD患者与非AD患者(对照组，VaD、PDD、bvFTD、DLB)中预测的p-tau/Aβ比例，图7C显示了数据集4中7个miRNA的AUC值。

本申请涉及的部分序列的信息提供于下面的表中。

SEQ ID NO:	描述	序列
			1	miR-139-3p	UGGAGACGCGGCCCUGUUGGAGU
2	miR-143-3p	UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC
			3	miR-146a-5p	UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU
4	miR-485-5p	AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC
			5	miR-10a-5p	UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG
6	miR-26b-5p	UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU
			7	miR-451a-5p	AAACCGUUACCAUUACUGAGUU

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：数据集与统计方法

1.1研究的数据集

本研究共纳入4个数据集。

在预试验阶段(数据集1)，在北京地区招募受试者(n＝44例；其中包括对照组21例、AD患者23例)。

在建立预测模型阶段(数据集2)，从山东、河南和广西省等其他地区招募受试者(n＝406例，对照组216例、AD患者190例)。

在模型验证阶段(数据集3)，从山东、河南和广西省等其他地区招募受试者(n＝304例，对照组153例、AD患者151例)。

在模型应用阶段(数据集4)，在北京地区招募受试者(n＝503例；其中包括对照组139例、AD患者155例、VaD51例、PDD53例、bvFTD53例、DLB52例)。

AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会(NationalInstitute on Aging-Alzheimer’s Association,NIA-AA)诊断标准。根据脑脊液P-tau/Aβ42(临界值取0.14)和T-tau/Aβ42(临界值取0.67)的比值确定AD和正常对照，以增加临床诊断的可靠性(参见Seeburger JL,et al.Cerebrospinal fluid biomarkers distinguishpostmortem-confirmed Alzheimer's disease from other dementias and healthycontrols in the OPTIMA cohort)。所有受试者或其法定监护人均已取得充分知情并签署书面同意书。本研究获得首都医科大学宣武医院机构审查委员会的批准。

1.2数据分析

采用SPSS v.22和Stata 13.0进行统计分析。数据集1、数据集2、数据集3分别进行独立分析。计数资料的组间比较采用卡方检验。计量资料的组间差异，如生物标志物浓度，用Welch’s t检验或方差分析(ANOVAs)进行分析。在数据集2和3中，miRNAs和p-tau/Aβ值的相关性分析使用线性回归模型进行。通过计算容忍度、方差膨胀因子(VIF)、特征根和条件指数等参数以检验线性回归模型中的多重共线性。线性回归模型建立后，根据miRNA水平计算P-tau/Aβ42的预测值。利用预测的p-tau/Aβ42比值建立受试者工作特征(ROC)曲线。所有分析采用双尾检验，显著性差异水平设置为P<0.05。

1.3受试者特征

图1列出了临床前AD和FAD数据集的受试者特征。各组之间的年龄和男女比例均无差异。患有AD的受试者与对照组之间的受教育年限，APOEε4，MMSE量表得分存在差异。

实施例2：miRNA的收集和分析

2.1RNA收集与测序

采集所有受试者的清晨空腹(禁食12小时)静脉血20ml，采集管使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的聚丙烯管。为获取血液中miRNAs，全血样本在首都医科大学宣武医院的中央实验室进行处理。在北京以外其他地区采集的血样，需立即将样品在室温下以4200×g离心10分钟以获得血浆，然后储存在4℃下，使用干冰保存在12小时内运送到宣武医院中央实验室。我们使用1μg总RNA制备测序文库。总RNA经15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化。标记区对应18-30nt条带的小RNA区域被切除并恢复。小的18-30nt RNA连接到腺苷化的3’适配器，并结合到唯一的分子标识符(UMI)，然后连接到5’适配器。连接适配器的小RNA双链PCR产物在安捷伦技术2100生物分析仪上进行验证。然后对它们进行热变性，并用夹板寡核苷酸序列进行循环。将单链环状DNA(ssCir DNA)格式化为最终文库。用phi29扩增文库，生成DNA纳米球(DNB)，它拥有一个分子的300多个拷贝。将DNBs加载到图像化纳米阵列上，并通过组合ProbeAnchor合成(cPAS)生成单端50碱基读取。最终连接PCR产物使用BGISEQ-500平台进行测序。用于实时定量PCR分析的样本在QIAzol裂解试剂匀浆后加入合成秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p(Qiagen)，作为RNA提取、逆转录和miRNA扩增的外部校准。随后被上标II逆转录酶(Invitrogen,USA)转录成cDNA。然后用PCR Primer Cocktail和PCR Mix进行几轮PCR扩增，扩增cDNA片段。PCR产物用PAGE凝胶纯化，回收产物用EB溶液溶解。

2.2miRNA数据分析

原始tags，例如原始测序数据，按以下程序处理：清除劣质标签，清除5'的标签引物污染物，去除标签没有三个引物，去除标签没有插入，删除标签与多聚腺苷酸，和删除标记的长度短于18nt。过滤后,剩余的标签被映射到参考基因组NCBI GRCh38和其他数据集，包括miRbase Bowtie2。Rfam映射执行Cmsearch。miRDeep2(68)通过探索二级结构预测新的miRNAs。miRNA表达水平是通过使用唯一的分子识别器计算分子的绝对数量来计算的。差异表达分析采用DEseq2，Q值≤0.001，Log2Ratio绝对值≥1作为默认阈值，以判断差异表达的显著性。

2.3定量实时PCR分析

定量real-time-PCR(qPCR)分析在验证研究中确认改变的miRNAs。使用NCode^TMVILO^TMmiRNA qRT-PCR试剂盒定量miRNA水平，并将其归一化至合成秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p。所有的反应在三个独立的实验中重复三次。采用2-δδct方法计算miRNA的表达(具体方法请参见Livak KJ,et al.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method)。所有miRNA引物均列于表1。为提高实验精度，qPCR重复次数为3次执行。变异系数(CV)的计算方法为标准差除以一组重复的平均值。本研究所有CV％均低于5％，说明数据质量高。

表1.miRNA引物的序列

2.4脑脊液(CFS)采集、测定Aβ42，T-tau和P-tau

参照国际指南收集脑脊液。在进行腰穿时，受试者左侧卧位，取L3-L5椎间盘间隙作为穿刺部位，采集15ml的CSF样品，并在室温下以2,000×g离心10分钟，然后将CSF样品分装至聚丙烯管中，在-80℃保存。所有受试者腰穿后监测至少12h。

2.5Aβ42，T-tau和P-tau检测

使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定脑脊液中Aβ42、总tau(T-tau)和P-tau(Thr 181位点磷酸化的tau)水平。首先进行初步试验，以确定ELISA分析的检测范围。每组中CD81水平的平均值设置为1.00，并采用相对比值以标准化。所有检测结果均在ELISA试剂盒的检测范围内。所有检测均采用盲法进行。

2.6预实验阶段研究结果

初步研究是一个相对较小的样本(数据集1)。RNA测序结果在AD及对照组患者中发现了860个miRNAs。miRNAs读数低于100的排除不参加下一步的分析。AD患者及对照组中miRNA变化大于等于1.2倍或者小于等于0.83倍被选作有意义miRNAs组；我们在AD组找到了29个上调和31个下降miRNA样本(P<0.05,图2)。

实施例3：预测模型的建立

扩大的样本量(数据集2)用于研究miRNA在AD和对照组表达的区别。数据集1中上调组的29例和下降组的31例在数据集2中得到了确认，支持了前期研究中获得的测序数据的意义。随后我们又分析了miRNA和p-tau/Aβ比例的潜在联系。29例上调组和31例下调组miRNA作为线性回归的自变量，p-tau/Aβ作为因变量。进行调整年龄、性别、APOE4、p-tau/Aβ比例，发现了7个相关的miRNA：miR-139-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,miR-485-5p,miR-10a-5p,miR-26b-5p,及miR-451a-5p(图3)。其中，miR-139-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,and miR-485-5p在AD患者中降低，miR-10a-5p,miR-26b-5p，and miR-451a-5p增加(P<0.001；图3A–G)。线性回归模型中，年龄、性别、APOE4P值＞0.05，说明这些在模型中是无关变量。对这七个miRNAs进行线性回归分析，我们发现七个miRNAs与p-tau/Aβ比例相关有显著性意义(adjusted R²＝0.64,P<0.001,Figure 4A)。建立p-tau/Aβ预测公式，公式为P-tau/Aβ42＝0.106-0.068×miR-146a-5p-0.093×miR-139-3p-0.093×miR-485-5p+0.089×miR-26-5p+0.079×miR-451a-5p+0.099×miR-10-5p-0.203×miR-143-3p。公式应用于数据集3和数据集4，用于接下来数据分析p-tau/Aβ的预测。我们进行了分析，以估计AD和对照组中的7个miRNA之间的多重共线性。所有的公差为>0.1,VIFs<10，特征值为>0，条件指数<30，表明各miRNA之间不存在显著的多重共线性。通过应用线性回归模型，可以计算AD患者及对照组的p-tau/Aβ比例预测值(图4C)。进一步的ROC分析显示通过7个miRNA预测的p-tau/Aβ比例有非常高的曲线面积(AUC；0.90,P<0.001；图4E)远远高于随机概率(AUC of50％)。

实施例4：模型验证阶段

独立数据集3用于确定上述发现。我们发现miR-139-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,和miR-485-5p在AD患者中相较于对照组有降低，miR-10a-5p,miR-26b-5p,和miR-451a-5p在AD患者中增高(P<0.001；图5A–G)。多重线性回归分析发现AD与对照组中的miRNA没有显著性差异(tolerances>0.1,VIFs<10,eigenvalues>0,condition index<30)。数据集2的预测公式应用于预测p-tau/Aβ比例。预测的p-tau/Aβ比例与实际脑脊液中p-tau/Aβ比例相关性高(adjusted R²＝0.67,P<0.001,图4B)。通过使用预测的p-tau/Aβ比例区分对照组和AD组(图4D)，ROC分析得到的AUC(0.90,P<0.001；图4F)，与数据集2计算得出的AUC相同。综上所述，由血液中7个微小RNA组成的模型有助于预测脑脊液中P-tau/Aβ42的比值，并有助于AD的诊断。

实施例5：模型应用阶段

使用了第四个数据集去评估模型在临床实践中应用于受试者的诊断能力，这些受试者包括对照组、AD和其他神经退行性疾病，如VaD、PDD、bvFTD和DLB，我们获得了与数据集1、2、3相似的结果；miR-139-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,and miR-485-5p水平降低，miR-10a-5p,miR-26b-5p,and miR-451a-5p增高(P<0.001；图6A–G)。7种miRNAs在其他类型痴呆，如血管性痴呆、帕金森痴呆、行为异常额颞叶痴呆、路易体痴呆无显著改变(all P>0.05)，说明这些miRNA是AD特异性的。基于数据集2的预测公式用于预测p-tau/Aβ。预测的p-tau/Aβ与实际在脑脊液中p-tau/Aβ的比例关联性强(adjusted R²＝0.62,P<0.001,图7A)。AD患者中预测的p-tau/Aβ比例相较于非AD患者(对照组，血管性痴呆、PDD、bvFTD、DLB)稳定增长(combination of controls,VaD,PDD,bvFTD,and DLB)(P<0.001,图7B)。更进一步的ROC分析展现出高的AUC(0.94,P<0.001,图7C)，提示7个miRNAs在区别AD与健康对照和其他类型神经退行性疾病是非常有效的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒及其用途

<130> IDC210034

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

uggagacgcg gcccuguugg agu 23

<210> 2

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

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<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

agaggcuggc cgugaugaau uc 22

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

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<210> 6

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

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uucaaguaau ucaggauagg u 21

<210> 7

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<212> RNA

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aaaccguuac cauuacugag uu 22

<210> 8

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<212> DNA

<213> artificial

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<223> 引物

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ctgtagatcc gaatttgtga 20

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<212> DNA

<213> artificial

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<223> 引物

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ttcaagtaat tcaggatagg taaaa 25

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

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gcggccctgt tggagtaaa 19

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

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tgagatgaag cactgtagct caaa 24

<210> 12

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<212> DNA

<213> artificial

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agaactgaat tccatgggtt aa 22

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<212> DNA

<213> artificial

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aaaccgttac cattactgag ttaa 24

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<223> 引物

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ctggccgtga tgaattcaaa a 21

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<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

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<223> 引物

<400> 15

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

Claims

1.一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p，miR-485-5p，miR-10a-5p，miR-26b-5p和miR-451a-5p；

优选地，所述试剂盒包含：用于确定受试者的miR-139-3p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-146a-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-10a-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-26b-5p水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-451a-5p水平的第七试剂或试剂组合。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平；

优选地，所述杂交技术选自Northern印迹分析，微阵列技术，原位杂交，液相芯片技术，夹板连接法；

优选地，所述试剂盒具有下列的特征：

(1)所述第一试剂或试剂组合包含能够定量miR-139-3p的水平的引物和/或探针；

(2)所述第二试剂或试剂组合包含能够定量miR-143-3p的水平的引物和/或探针；

(3)所述第三试剂或试剂组合包含能够定量miR-146a-5p水平的引物和/或探针；

(4)所述第四试剂或试剂组合包含能够定量miR-485-5p的水平的引物和/或探针；

(5)所述第五试剂或试剂组合包含能够定量miR-10a-5p的水平的引物和/或探针；

(6)所述第六试剂或试剂组合包含能够定量miR-26b-5p的水平的引物和/或探针；

(7)所述第七试剂或试剂组合包含能够定量miR-451a-5p的水平的引物和/或探针；

优选地，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具；

更优选地，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物(例如，尼龙膜，微球)上。

3.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平；

优选地，所述扩增技术选自qPCR，RT-PCR，Stem-loop PCR，Poly A PCR，RCA，测序；

优选地，所述试剂盒具有下列的特征：

优选地，所述试剂盒还包括用于进行核酸扩增的试剂和/或用于进行测序的试剂；

优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其中，所述生物样品为获自受试者的全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液；

优选地，所述生物样品选自全血(例如，外周血)，血清和血浆；

更优选地，所述生物样品选自外周血；

优选地，所述生物样品包含外泌体；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合；

优选地，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体；

优选地，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液；

优选地，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者；

优选地，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆(例如，血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)、路易体痴呆(DLB))的受试者。

6.用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病；其中，所述生物标志物为miR-139-3p，miR-143-3p，miR-146a-5p，miR-485-5p，miR-10a-5p，miR-26b-5p和miR-451a-5p；

优选地，所述试剂盒包含用于确定受试者的miR-139-3p水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-143-3p水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-146a-5p水平的第三试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-485-5p水平的第四试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-10a-5p水平的第五试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-26b-5p水平的第六试剂或试剂组合，用于确定受试者的miR-451a-5p水平的第七试剂或试剂组合。

7.权利要求6所述的用途，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过杂交技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平；

优选地，所述试剂盒具有下列的特征：

优选地，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具；

8.权利要求6所述的用途，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七试剂或试剂组合)通过扩增技术来测定所述生物样品中生物标志物的水平；

优选地，所述试剂盒具有下列的特征：

9.权利要求6-8任一项所述的用途，其中，所述生物样品为获自受试者的全血(例如，外周血)，血清，血浆或脑脊液；

更优选地，所述生物样品选自外周血；

优选地，所述生物样品包含外泌体；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。

10.权利要求6-9任一项所述的用途，其中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合；