KR102082016B1 - 알츠하이머병을 나타내는 마이크로rna 바이오마커들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개체로부터 유래한 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하여 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법으로서, 적합한 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준의 변화가 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법을 제공한다. 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법들, 알츠하이머병을 가지는 개체를 치료하는 방법들, 및 알츠하이머병을 진단하기 위한 키트들도 역시 제공된다.

Description

알츠하이머병을 나타내는 마이크로RNA 바이오마커들 {MICRORNA BIOMARKERS INDICATIVE OF ALZHEIMER'S DISEASE}
본 발명은 개체로부터 유래한 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하여 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법으로서, 적합한 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준의 변화가 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법을 제공한다. 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법들, 알츠하이머병을 가지는 개체를 치료하는 방법들, 및 알츠하이머병을 진단하기 위한 키트들도 역시 제공된다.
알츠하이머병은 인간 중추신경계의 진행성 질환이다. 이것은 치매에 의해 나타나고, 전형적으로 노인들에서 증상들은 방향감 장애, 기억 상실, 언어, 계산 또는 시공간 능력들의 장애를 포함하며, 정신과적 소견들에 의해 나타나기도 한다. 알츠하이머병은 뇌의 여러 부위들에서 신경원들을 퇴화시키는 것과 연관된다. 알츠하이머병의 신경병리학은 아밀로이드 판들, 신경원섬유 매듭들, 시냅스 소실 및 선택적 신경원성 세포사망의 존재를 특징으로 한다. 아밀로이드 판들은 비정상적 수준들의 세포외 아밀로이드 베타 펩타이드로부터 유발되는 한편, 신경원섬유 매듭들은 세포내 과인산화된 타우 (tau) 단백질의 존재와 연관된다. 증상들은 전형적으로 먼저 기억의 저하로 임상에서 나타나고, 다른 인지 기능들에서 퇴화로, 또한 비정상적 행동으로 이어진다. 전세계적으로 대략 24백만 명의 사람들이 치매를 앓고 있으며, 이들 중 대다수 (~ 60%)는 알츠하이머병으로 인한다 (Ferri C.P. et al. (2005) Lancet 366(9503): 2112-2117). 5백만 명 이상의 미국인들이 알츠하이머병을 가지는 것으로 추정되고, 이러한 수는 이번 세기-중반까지 14.3백만 명으로 증가할 것이고, 2000년부터 350 퍼센트 증가를 보여주는 것으로 추산된다. 선진국들에서 증가하고 있는 많은 치매 환자들은 사회 및 건강관리 체계에 엄청난 부담을 주게 될 것이다.
조기 진단은 개체가 질환 진행을 지연시킬 수 있는 약물들을 복용하도록 허용하기 때문에, 알츠하이머병의 치료에 있어서 조기 진단은 필수적인 단계이다. 알츠하이머병은 현재 신경학적 검사, 정신적 상태 검사들, 및 뇌 영상화를 포함할 수 있는 임상적 판정기준들의 조합을 사용하여 진단되고 있다. 알츠하이머병의 진단은 종종 다른 치매들을 배제하면서 이루어진다. 이들 판정기준들을 기초로 하여, 정확한 진단이 특히 경미한 또는 초기-단계의 알츠하이머병을 가지는 환자들의 경우에는 어려울 수 있다. 명료한 진단은 뇌 조직의 병리학을 조사하여 이루어질 수 있지만, 이것은 단지 사후에만 실행가능하다. 이에 따라, 진단적 적용들에 사용될 수 있는 알츠하이머병을 나타내는 마커들에 대한 필요성이 존재하게 된다.
본 출원은 2011년 6월 27일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/501,720호에 대한 우선권을 주장하고, 그의 내용들 전부는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 알츠하이머병을 나타내고, 개체에서 알츠하이머병을 정확하게 진단하는 데 사용될 수 있는 새로운 miRNA 바이오마커들을 제공한다. 이들 바이오마커들로는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, miR-301a 및 miR-545를 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 방법들은 적합한 시료, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액에서 세포외 순환하는 miRNA들의 검출을 포함한다.
이에 따라, 첫 번째 관점에서, 본 발명은 개체로부터 유래된 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하여 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법으로서, 적어도 하나의 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 또는 그들의 조합들이고, 적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같은 정상 개체에서의 수준 대비 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이가 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법을 제공한다. 예를 들면, 한 가지 구현예에서, 본 방법은 개체로부터 유래된 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 적어도 하나의 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 또는 그들의 조합들이고, 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 감소가 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 단계를 포함한다. 선택적으로, 본 방법은 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 기초로 하여 개체가 알츠하이머병을 갖거나 갖지 않는 지의 진단을 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 본 방법은 개체에서 알츠하이머병의 진단과 적합한 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준 또는 수준들에서의 차이와의 연관성을 보여주는 단계를 더 포함할 수 있다.
한 가지 구현예에서, 본 방법은 시료에서 하나의 miRNA, 예로 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g 또는 Let-7d의 수준을 결정하는 단계로서, 정상 개체에서의 수준 대비 miRNA의 수준에서의 차이는 감소인, 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 방법은 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 본 구현예에서, 방법은 시료에서 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545의 수준을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 적어도 하나의 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 또는 그들의 조합들로부터 선택될 수 있고, 선택적으로 적어도 하나의 miRNA는 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545로부터 선택될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 본 방법은 다음의 miRNA들의 조합들의 하나의 수준을 결정하는 단계가 관여한다: miR-545, let7g, 및 miR-15b; miR-15b 및 miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g 및 miR-15b; miR-191 및 miR-15b; Let-7g 및 miR-15b; miR-191, miR-301a, 및 miR-545; miR-301a, let-7g, 및 miR-15b; 그리고 miR-191, miR-301a, miR-545, 및 miR-15b.
한 가지 특정한 구현예에서, 본 방법은 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준들을 결정하는 단계, 정상 개체들 및 알츠하이머병을 가진 개체들에 존재하는 동일한 miRNA들의 수준들을 나타내는 한 벌의 데이타와 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준들을 비교하는 단계, 및 비교를 기초로 하여 개체들을 알츠하이머병을 갖거나 갖지 않는 것으로서 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 둘 이상의 miRNA들은 다음의 조합들을 포함할 수 있다: miR-545, let7g, 및 miR-15b; miR-15b 및 miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g 및 miR-15b; miR-191 및 miR-15b; Let-7g 및 miR-15b; miR-191, miR-301a, 및 miR-545; miR-301a, let-7g, 및 miR-15b; 그리고 miR-191, miR-301a, miR-545, 및 miR-15b.
본 방법은 선택적으로 알츠하이머병의 진단을 용이하게 하도록 적어도 하나의 추가적인 검사를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 구현예들에서, 추가적인 검사는 간이-정신 상태 검사 (MMSE), 간이-인지 검사, ADAS-인지 검사 및 시계-그리기 검사의 하나 이상일 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 추가 검사(testing)는 알츠하이머병에 대한 적어도 하나의 추가적인 바이오마커를 검출하거나 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 선택적으로 적어도 하나의 알츠하이머의 치료제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 구현예들에서, 알츠하이머의 치료제는 라자다인® (Razadyne®) (갈란타민 (galantamine)), 엑셀론® (Exelon®) (리바스티그민 (rivastigmine)), 또는 아리셉트® (Aricept®) (도네페질 (donepezil))일 수 있다. 특정한 구현예에서, 알츠하이머의 치료제는 도네페질 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 (예로, 도네페질 염산)이다.
상기 miRNA의 수준은 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, miRNA는 상기 miRNA와 특이적으로 혼성화하는 제제를 사용하여 검출될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 상기 miRNA의 수준은 증폭 방법들, 혼성화 방법들, 및/또는 서열결정 방법들을 사용하여 검출될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 상기 miRNA의 수준은 정량적 PCR을 사용하여 검출된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 혈액-유래 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 측정하는 단계로서, 적어도 하나의 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d 또는 그들의 조합들인, 단계, 및 적합한 대조군과 대비한 개체에서 수준 또는 수준들에서의 차이와 개체에서 알츠하이머병의 진단과의 연관성을 보여주는 단계를 포함하는, 개체에서 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 본 방법은 시료에서 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 첫 번째 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준들 결정하는 단계, 상기 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 두 번째 시료에서 상기 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 상기 두 번째 시료는 상기 첫 번째 시료 이후에 획득되는, 단계, 및 첫 번째 시료에서 결정된 수준들을 두 번째 시료에서 결정된 상기 수준들과 비교하는 단계로서, 상기 수준들은 알츠하이머병 진행을 나타내는, 단계에 의하고, 적어도 하나의 miRNA는 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d 또는 그들의 조합들인, 개체에서 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 본 방법은 시료에서 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같은 정상 개체에서의 수준 대비 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이는 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 단계 및 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이가 검출되는 경우라면, 상기 개체에게 알츠하이머의 치료제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의하는, 개체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 적어도 하나의 miRNA는 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d 또는 그들의 조합들이다. 본 방법은 선택적으로 시료에서 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준이 적합한 대조군과 대비하여 달라지는 (예로, 감소되는) 알츠하이머병을 가진 개체를 확인하는 단계, 및 알츠하이머의 치료제의 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계에 의하는, 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 적어도 하나의 miRNA는 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d 또는 그들의 조합들이다. 본 방법은 선택적으로 적합한 대조군과 대비하여 시료에서 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545의 수준도 역시 달라지는 (예로, 감소되는) 개체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 관점들에서, 알츠하이머의 치료제는 라자다인® (갈란타민), 엑셀론® (리바스티그민), 또는 아리셉트® (도네페질)일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 알츠하이머의 치료제는 도네페질 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 (예로, 도네페질 염산)이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA들을 포함하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 존재를 선별적으로 검출하는 제제로서, 적어도 하나의 miRNA는 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 또는 그들의 조합들인, 제제, 및 상기 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하기 위한 지침들로서, 적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같은 정상 개체에서의 수준 대비 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이는 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 지침들을 포함하는, 개체에서 알츠하이머병을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 선택적으로 시료에서 적어도 하나의 추가적인 miRNA의 존재를 선별적으로 검출하는 제제로서, 추가적인 miRNA가 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545인, 제제를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 제제는 miRNA와 특이적으로 혼성화한다.
본 명세서에서 기술된 방법들 또는 키트들의 일정 구현예들에서, 개체는 포유동물, 예를 들면 인간일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법들 또는 키트들에서, 적합한 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이는 소프트웨어 분류화 알고리즘을 실행하여 결정될 수 있다.
본 방법들 또는 키트들의 소정의 구현예들에서, 시료는 신체의 체액, 예를 들면 혈액, 림프, 소변, 또는 타액일 수 있다. 시료는 무-세포 시료 및/또는 미세소포(microvesicle)가 없는 시료일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 시료는 혈장이다. 또 다른 구현예에서, 시료는 혈청이다.
본 방법들 또는 키트들의 소정의 구현예들에서, 하나의 miRNA가 선택되거나 사용되고, 상기 miRNA는 (a) miR-191이 아닌 miRNA, (b) miR-15b가 아닌 miRNA, (c) miR-142-3p가 아닌 miRNA, (d) Let-7g가 아닌 miRNA, 및/또는 (e) Let-7d가 아닌 miRNA이다.
본 방법들 또는 키트들의 소정의 구현예들에서, 시료는 CSF이고, 상기 miRNA는 (a) miR-15b가 아닌 miRNA, 및/또는 (b) miRNA-191이 아닌 miRNA이다.
1. 도입
본 발명은 알츠하이머병을 나타내고, 개체에서 알츠하이머병을 정확하게 진단하는 데 사용될 수 있는 새로운 miRNA 바이오마커들을 제공한다. 또한, 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법들, 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법들, 및 알츠하이머병을 진단하기 위한 키트들이 제공된다. 일정 구현예들에서, 본 방법들은 적합한 시료, 바람직하게 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액에서 세포외 순환하는 miRNA들의 검출을 포함한다.
2. 정의들
본 발명을 자세하게 설명하기 이전에, 본 명세서에서 사용될 소정의 용어들의 정의들이 제공된다. 달리 정의되지 않은 경우라면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술학적 및 과학적 용어들은 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 설명하는 맥락에서 (특히 다음의 청구항들의 맥락에서) 용어들 "하나 (a)" 및 "하나 (an)" 그리고 "그 (the)" 및 유사한 낱말들의 사용은, 본 명세서에서 달리 표시되지 않은 경우 또는 분명하게 문맥으로 반대하지 않은 경우라면 단수 및 복수 둘 다를 포괄하도록 참작될 것이다. 용어들 "포함하는 (comprising)", "가지는 (having)", "포함하는 (including)", 및 "포함하는 (containing)"은 달리 강조되지 않는 경우라면 개방된 용어들로서 (예로, "포함하지만, 이에 제한되지는 않는"을 의미함) 참작될 것이다. 본 명세서에서 수치들의 범위들의 재인용은 본 명세서에서 달리 표시되지 않은 경우라면, 단지 재인용되거나 해당 범위에 속하는 각각의 분리된 수치를 개별적으로 언급하는 속기 (shorthand) 방법으로서 작용하도록 의도되고, 각각의 분리된 수치는 이것이 개별적으로 재인용된 것처럼 본 명세서 내로 통합된다.
용어 "개체 (subject)"는 알츠하이머병, 또는 알츠하이머병이 직접 또는 간접적으로 관여하는 임의의 장애와 같은 신경퇴화성 질환들을 포함하는, CNS 장애와 연관된 치매로 고생하거나 이로 침범될 수 있는 동물들을 포함하도록 의도된다. 개체들의 예들로는 포유동물들, 예로 인간들, 비-인간 영장류들, 개들, 소들, 말들, 돼지들, 양들, 염소들, 고양이들, 쥐들, 토끼들, 래트들, 및 형질전환된 (transgenic) 비-인간 동물들을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 개체는 인간, 예로 알츠하이머병 또는 알츠하이머병-연관된 치매로 고생하거나, 고생할 위험성이 있거나, 잠재적으로 고생할 수 있는 인간이다.
용어 "치료하다 (treat)"는 본 명세서에서 개체에서 질환의 적어도 하나의 증상을 완화하거나, 감소시키거나, 경감하는 것을 의미하는 데 사용된다. 예를 들면, 알츠하이머병과 관련하여, 용어 "치료하다"는 인지 손상 (기억 및/또는 방향감의 손상) 또는 전반적 기능성 (functioning)의 손상 (기억 및/또는 방향감의 손상)을 완화하거나, 감소시키거나, 경감하는 것 및/또는 전반적 또는 인지 손상에서 진행성 퇴화를 지연하거나 역전시키는 것을 포함한다. 이에 따라, 용어 "치료하다"는 질환 또는 질환의 증상의 임상적 소견 이전에 발병을 지연하거나 예방하는 것 및/또는 질환의 증상을 발생시키거나 악화시킬 위험성을 감소시키는 것도 역시 포괄한다.
치료적 제제, 또는 그의 조합들의 "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 개체에서 질환을 치료하기에 충분한 양이다. 예를 들면, 알츠하이머의 치료제를 위해 치료적 유효량은 기저선의 임상적으로 관찰가능한 알츠하이머병의 징후들 및 증상들과 대비하여 관찰가능한 치료적 유익을 제공하는 것으로 확인되어 왔던 양일 수 있다.
용어 "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"는 보통 주어진 수치 또는 범위의 5% 이내, 또는 더욱 바람직하게는 1% 이내를 의미한다.
3. 알츠하이머병에 대한 miRNA 바이오마커들
본 발명은 "정상"인 개체들, 예로 알츠하이머병을 가지지 않은 개체들과 비교 시, 알츠하이머병 (AD)을 가진 개체들로부터 유래한 생물학적 시료들에서 차별적으로 존재하는 것으로 확인된 마이크로RNA ("miRNA") 바이오마커들에 관한 것이다. miRNA 바이오마커 또는 miRNA 바이오마커들의 집합은 시료들에서 miRNA 바이오마커 또는 miRNA 바이오마커들의 집합의 발현 수준들 간의 차이가 통계학적으로 유의한 것으로 결정된 경우라면 시료들 간에 차별적으로 존재한다. 통계학적 유의성을 위한 공통적인 테스트들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 t-테스트, ANOVA, 니스칼-월리스 (Kniskal-Wallis), 윌콕슨 (Wilcoxon), 만-휘트니 (Mann-Whitney), 및 교차비 (odds ratio)을 포함한다. miRNA 바이오마커들은 단독 또는 조합으로 개체가 알츠하이머병을 갖거나 갖지 않는 점의 상대적 위험성의 척도를 제공하는 데 사용될 수 있다.
miRNA들은 해독 억제 (translational repression)를 포함하는 서로 다른 기작들을 통하여 유전자 발현을 조절하는 데 관여하는 작은 비-코딩 RNA들이다. miRNA들은 처음에 DNA로부터, 크기가 수백부터 수천 개의 뉴클레오타이드들의 범위를 가지는 길이가 긴 일차 miRNA 전사체들 ("일차-miRNA들 (pri-miRNA)")로서 전사된다. 일차-miRNA는 핵에서 효소 복합체 Drosha-DGCR8에 의해 가공되어 스템-루프 (stem-loop) 전구체 miRNA ("전구-miRNA (pre-miRNA)")를 형성한다. 전구-miRNA는 단백질 엑스포틴 5 (protein exportin 5)에 의해 세포질로 운반되고, 여기에서 이것은 효소 다이서 (Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 (기능적) miRNA를 생성한다. 인간 게놈은 "miRBase: 마이크로RNA 데이타베이스" (http://www.mirbase.org/)"에서 카탈로그화 되었던 1,300개 초과의 miRNA들을 인코딩한다. miRNA 발현은 세포 및 조직 유형들의 광범위한 진용에서, 또한 세포외적으로 예로 생물학적 체액들에서 보고되어왔다.
알츠하이머병의 miRNA 바이오마커들은 "정상"인 개체들, 예로 AD를 가지지 않는 개체들로부터 유래한 시료들과 알츠하이머병을 가진 개체들로부터 유래한 생물학적 시료들에서 miRNA들의 발현 수준을 비교하고, 차별적으로 존재하는 miRNA들을 확인하는 단계에 의해 발견되었다. 7개의 차별적으로 존재하는 miRNA 바이오마커들이 이러한 방식으로 확인되었고, 이는 놀랍게도 혈장에서 측정될 때 알츠하이머병을 나타내는 것으로 관찰되었다: miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, and miR-545 (표 2 참조). 이들 miRNA 바이오마커들은 현재 개체, 예를 들면 알츠하이머병 상태가 이전에 알려지지 않았거나 알츠하이머병으로 고생하는 것으로 의심되는 개체의 알츠하이머병 상태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이것은 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및 miR-545, 또는 그들의 조합의 하나 이상의 수준을 결정하여 달성될 수 있다. 정상 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서의 차이와 비교시 이들 miRNA 바이오마커들의 하나 이상의 수준에서의 차이는 개체가 알츠하이머병을 가지는 점을 나타낸다.
정상 개체와 비교 시 miRNA 바이오마커들의 하나 이상의 수준에서의 차이를 가진 개체는, 초기-단계 알츠하이머병, 중등도 또는 중간-단계 알츠하이머병, 또는 중증 또는 말기-단계 알츠하이머병을 포함하는 알츠하이머병을 가질 수 있다. 한 가지 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 전구 단계 (prodromal) 알츠하이머병으로도 역시 알려져 있는 초기-단계 알츠하이머병의 특징적인 증상들을 가진 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있다. 초기-단계 알츠하이머병을 가진 개체들은 전형적으로 24 내지 30의 MMSE 점수들을 가진다. 경미한 기억 상실 및 복잡한 작업들을 수행하는 저하된 능력에 관한 불평들은 종종 스스로 보고되거나 배우자들 및/또는 보호자들에 의해 보고된다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 "중등도" 또는 "중간-단계" 알츠하이머병이라고도 역시 말하는 "중등도의 중증 인지 저하"의 특징적인 증상들을 가진 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있다. 중등도의 중증 인지 저하는 기억의 주요한 간격들 및 인지 기능에서 결함들의 출현을 특징으로 한다. 본 단계에서는, 일일 활동들로의 일정 도움이 지시된다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 "중등도" 또는 "중간-단계" 알츠하이머병이라고도 역시 말하는 "중증 인지 저하"의 특징적인 증상들을 가진 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있다. 중증 인지 저하에서 기억 장애들은 계속하여 악화되고, 유의한 개성 변화들이 출현할 수 있으며, 침범된 개인들은 전형적으로 습관적인 매일 활동들로의 철저한 도움을 필요로 한다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 "중증" 또는 "말기-단계" 알츠하이머병이라고도 역시 말하는 "매우 중증의 인지 저하"의 특징적인 증상들을 가진 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있다. 말기 단계 알츠하이머병 또는 매우 중증의 인지 저하는 질환의 최종 단계이다. 개인들은 전형적으로 그들의 환경에 반응하는 능력, 말하는 능력 및 궁극적으로 운동을 조절하는 능력을 상실한다 (예를 들면, http://www.alz.org 참조).
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 0 및 26 사이 범위의 MMSE 점수, 예로 0 내지 26의 MMSE 점수, 0 내지 20의 MMSE 점수, 0 내지 26의 MMSE 점수 등을 가지는 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있다. "MMSE"는 인지 평가 협회에서 사용되는 간이-정신 상태 검사를 말한다. MMSE 동안, 의사 또는 기타 의학적 전문가는 환자에서 매일 정신 능력들의 범위를 검사하도록 설계된 일련의 질문들을 물어본다. 보편적으로 묻는 질문들은, 예를 들면 3가지 공통적인 물체들의 명칭들을 기억하고 반복하는 것, 년도, 날짜, 계절, 및 요일을 진술하는 것, 100부터 7의 증분들로 역으로 계수하는 것, 단어 "세계 (world)"를 철자를 역으로 말하는 것, 검사자가 지적하는 친숙한 물체들의 명칭을 말하는 것, 검사자의 사무실의 위치를 확인하는 것, 검사자에 의해 진술된 이후에 공통적 어구를 반복하는 것, 두 개의 겹친 모양들의 그림을 복사하는 것, 및 3-부분 일련의 지침들을 따라하는 것 (예로, 한 장의 종이를 뽑아서, 절반으로 접고, 바닥 위에 이를 두는 것)을 포함한다. MMSE 검사에 관한 최대 점수는 30점이다. 일반적으로, 27 내지 30의 MMSE 점수를 가진 환자는 인지 손상이 전혀 가지지 않는 것으로 고려되고, 21 내지 26의 MMSE 점수를 가진 환자는 경미한 인지 손상을 가지는 것으로 고려되고, 11 내지 20의 MMSE 점수를 가진 환자는 중등도 인지 손상을 가지는 것으로 고려되고, 0 내지 10의 MMSE 점수를 가진 환자는 중증의 인지 손상을 가지는 것으로 고려된다. 소정의 구현예들에서, 0 내지 16의 MMSE 점수를 가진 환자는 진행성 (중등도 중증 내지 중증) 알츠하이머병을 가지는 것으로 고려된다.
한 가지 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 개체에서 알츠하이머병의 경과를 감시하는 데 사용될 수 있다. 개체의 알츠하이머병 상태는 시간 경과 시 변화할 수 있다. 예를 들면, 질환은 시간 경과 시 악화되거나 개선될 수 있다. 이러한 악화 또는 개선으로, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 개체로부터 유래한 시료들에서 검출되는 바와 같이, 변화할 수 있다. 예를 들면, miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 하나 이상의 수준은 알츠하이머병의 발생으로 감소한다. 따라서, 개체에서 알츠하이머병의 경과는 개체로부터 유래한 첫 번째 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하고, 개체에서 유래한 두 번째 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 단계로서, 두 번째 시료는 첫 번째 시료 이후에 획득되는 단계에 의해 감시될 수 있다. 첫 번째 시료에서의 수준들과 대비한 두 번째 시료에서의 수준들이 질환 진행을 나타낸다. 예를 들면, 첫 번째 시료로부터 두 번째 시료까지의 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 하나 이상의 수준에서의 감소는 개체가 알츠하이머병을 발생하였던 점, 또는 질환이 악화되었던 점을 나타낸다. 반대로, 첫 번째 시료로부터 두 번째 시료까지의 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 하나 이상의 수준에서의 증가는 질환이 개선되었던 점을 가리킨다. 한 가지 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들은 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, 및 그들의 조합들이다.
테스트 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서 miRNA 바이오마커의 수준이 정상 개체에서 존재하는 miRNA 바이오마커의 수준과 달라지는지 여부는 적합한 대조군과 테스트 개체로부터 얻은 시료에서 miRNA 바이오마커의 수준을 비교하여 확증될 수 있다. 당업자라면 문제가 된 검정법을 위한 적당한 대조군을 선택할 수 있다. 예를 들면, 적당한 대조군은 기지의 개체, 예로 정상 개체인 것으로 알려진 개체, 또는 알츠하이머병을 가진 것으로 알려진 개체로부터 유래한 생물학적 시료일 수 있다. 적합한 대조군이 정상 개체로부터 획득된 경우라면, 적합한 대조군과 대비한 테스트 개체에서 miRNA 바이오마커의 수준에서의 통계학적으로 유의한 차이는 개체가 알츠하이머병을 가지는 점을 나타낸다. 적합한 대조군이 알츠하이머병을 가지는 것으로 알려진 개체로부터 획득된 경우라면, 이러한 대조군과 유사하거나 이보다 낮은 수준들은 정상 개체로부터 얻은 시료에서 존재하는 수준들에서의 차이를 반영하는 알츠하이머병을 나타낸다. 한 가지 구현예에서, miRNA 바이오마커의 수준에서의 차이는 감소이다. 적합한 대조군은 또한 참조 표준일 수 있다. 참조 표준은 비교를 위한 참조 수준으로서 작용하여, 테스트 시료들은 개체의 알츠하이머병 상태를 추측하기 위하여 참조 표준과 비교될 수 있다. 참조 표준은 기지의 개체, 예로 정상 개체인 것으로 알려진 개체, 또는 알츠하이머병을 가진 것으로 알려진 개체에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 대표할 수 있다. 마찬가지로, 참조 표준은 기지의 개체들의 집단, 예로 정상 개체인 것으로 알려진 개체들의 집단, 또는 알츠하이머병을 가진 것으로 알려진 개체들의 집단에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 대표할 수 있다. 참조 표준은 예를 들면 다수의 개인들로부터 시료들 풀을 얻고 시료들 풀에서 miRNA 바이오마커의 수준을 결정하고, 이에 의해 평균화된 집단을 지배하는 표준을 생산하여 획득될 수 있다. 이러한 참조 표준은 개인들의 집단 중에서 miRNA 바이오마커의 평균 수준을 나타낸다. 참조 표준은 또한 예를 들면 다수의 개인들로부터 획득된 개별적 시료들에서 존재하는 것으로 결정된 miRNA 바이오마커의 수준을 평균하여 획득될 수 있다. 이러한 표준은 또한 개인들의 집단 중에서 miRNA 바이오마커의 평균 수준을 나타낸다. 참조 표준은 또한 개인들의 집단의 기지의 개체에서 miRNA 바이오마커의 수준을 각각 나타내는 수치들의 수집일 수 있다. 소정의 구현예들에서, 테스트 시료들은 개체의 알츠하이머병 상태를 추측하기 위하여 이러한 수치들의 수집과 대비하여 비교될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 참조 표준은 절대 수치이다. 이러한 구현예들에서, 테스트 시료들은 개체의 알츠하이머병 상태를 추측하기 위하여 절대 수치와 대비하여 비교될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 적합한 대조군과 대비한 시료에서 하나 이상의 miRNA들의 수준 간의 비교는 소프트웨어 분류화 알고리즘을 실행하여 작성된다. 당업자라면 문제가 된 검정법에 의존하여 적당할 수 있는 추가적인 적합한 대조군들을 바로 착상할 수 있다. 상기 언급된 적합한 대조군들은 예시적이고, 제한하려고 의도되지 않는다.
일반적으로, 정상 개체에서 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 하나 이상의 수준을 각각 나타내는 적합한 대조군과 대비한 테스트 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 하나 이상의 수준에서의 감소는 테스트 개체가 알츠하이머병을 가지는 점을 가리킬 것이다. 적합한 대조군이 알츠하이머병을 가진 개체에서 miRNA 바이오마커들의 수준을 나타내는 경우들에서, 일반적으로 이러한 대조군의 수준들과 유사하거나 이보다 낮은 하나 이상의 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및/또는 miR-545의 수준은 알츠하이머병을 나타낸다.
둘 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준들이 테스트 개체에서 결정되는 일정 경우들에서, 적합한 대조군과 대비한 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준들에서 감소, 또는 하나 이상의 추가적인 miRNA 바이오마커들의 수준에서의 변화 없음 또는 증가가 존재할 수 있다. 이러한 경우들에서, 정상 개체에서 miRNA 바이오마커들의 수준을 나타내는 적합한 대조군과 대비한 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준에서의 차이는 테스트 개체가 알츠하이머병을 가지는 점을 가리킨다. 이러한 차이의 결정은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 소프트웨어 분류화 알고리즘의 실행에 의해 도움을 받을 수 있다.
4. 생물학적 시료들
하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 발현 수준은 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서 결정될 수 있다. 개체로부터 유래한 시료는 개체로부터 기원하는 시료이다. 이러한 시료는 개체로부터 획득된 이후에 더 가공될 수 있다. 예를 들면, RNA는 시료로부터 분리될 수 있다. 이러한 예에서, 시료로부터 분리된 RNA는 또한 개체로부터 유래한 시료이다. 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 데 유용한 생물학적 시료는 miRNA 발현이 세포들, 조직들, 및 신체의 전체에 걸친 체액들에서 보고되어 왔기 때문에, 필수적으로 임의의 출처로부터 획득될 수 있다. 그러나, 본 발명의 한 가지 관점에서, 알츠하이머병을 나타내는 하나 이상의 바이오마커들의 수준들은 비-침습적으로 개체로부터 획득된 시료에서 검출될 수 있다. 알츠하이머병의 기존의 바이오마커들 (예로, Aβ1-42, p-tau 등)은 종종 뇌척수액 (CSF)로부터 또는 뇌 조직으로부터 유래한 시료에서 측정된다. CSF는 요추 천자에 의해 가장 보편적으로 획득되고, 이는 척수관 내로 출혈, 척수성 두통, 및 감염을 포함하는 위험성 요인들과 연관된 고통스러운 절차이다. 뇌 조직의 시료들 상의 바이오마커 검출은 살아있는 개체에서 알츠하이머병의 진단을 위해서는 현재 실행되지 않고, 다른 수단에 의해 작성된 진단을 사후에 검증하는 데 주로 사용된다. 이에 따라, 시료는 뇌 조직이 아닌 출처로부터 획득되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들은 알츠하이머병을 나타내고 있으며, 비-침습적으로 획득된 생물학적 시료들에서 검출될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 데 사용된 생물학적 시료는 순환하는 miRNA들, 예로 세포외 miRNA들을 포함하는 시료이다. 세포외 miRNA들은, 순환계로부터 얻은 체액들 예로 혈액 시료 또는 림프 시료와 같은 신체의 체액들, 또는 CSF, 소변 또는 타액과 같은 또 다른 신체의 체액들을 포함하는 광범위한 생물학적 재료를 자유롭게 순환한다. 이에 따라, 일정 구현예들에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 데 사용된 생물학적 시료는 신체의 체액, 예를 들면 혈액, 그의 분획들, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 눈물들, 땀, 정액, 질 분비물들, 림프, 기관지 분비물들, CSF 등이다. 일정 구현예들에서, 시료는 비-침습적으로 획득된 시료이다. 일정 구현예들에서, 시료는 CSF가 아닌 신체의 체액으로부터 획득된다.
순환하는 miRNA들은 세포들에서의 miRNA들 (세포성 miRNA), 미세소포들에서의 세포외 miRNA들 (미세소포-연관된 miRNA), 및 세포들 또는 미세소포들과 연관되지 않은 세포외 miRNA들 (세포외 비-소포성 miRNA)을 포함한다. 일정 구현예들에서, 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 데 사용된 생물학적 시료는 (예로, 순환하는 miRNA를 함유하는 시료) 세포들을 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 생물학적 시료는 무세포이거나 실질적으로 무세포 (예로, 혈청 시료)일 수 있다. 시료는 마찬가지로 미세소포들이 없거나 실질적으로 미세소포들이 없을 수 있다. 예를 들면, 미세소포들이 없거나 실질적으로 미세소포들이 없는 시료는 시료의 미세소포 함량이 시료에서 비-소포성 miRNA들의 수준을 정확하게 결정하는 능력에 간섭하는 것을 피하도록 충분하게 낮은 시료이다. 일정 구현예들에서, 순환하는 miRNA들, 예로 세포외 miRNA들을 포함하는 시료는 혈액-유래 시료이다. 대표적인 혈액-유래 시료 유형들은, 예로 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료 등을 포함한다. 다른 구현예들에서, 순환하는 miRNA들을 포함하는 시료는 림프 시료이다. 순환하는 miRNA들은 또한 소변 및 타액에서 확인되고, 이들 출처들로부터 유래한 생물학적 시료들은 미찬가지로 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 데 적합하다.
5. 시료에서 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 것
생물학적 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 시료에서 miRNA의 수준 또는 양을 측정하는 임의의 신뢰가능한 방법이 사용될 수 있다. 일반적으로, miRNA는 예를 들면 증폭-기초 방법들 (예로, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 정량적 중합효소 연쇄반응 (qPCR), 회전 순환 증폭 (rolling circle amplification) 등), 혼성화-기초 방법들 (예로, 혼성화 어레이들 (예로, 마이크로어레이), 나노스트링 분석 (NanoString analysis), 노던 블럿 분석, 분지된 DNA (bDNA) 신호 증폭, 제자리 혼성화 등), 및 서열결정-기초 방법들 (예로, 예를 들면 일루미나 (Illumina) 또는 이온토런트 (IonTorrent) 플랫폼들을 사용하는 다음-세대 서열결정 방법들)을 포함하는 mRNA를 위해 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 분리된 RNA의 시료들과 같은 시료 (그의 분획들을 포함)로부터 검출되고 정량될 수 있다. 다른 대표적인 기법들은 리보핵산분해효소 보호 검정법 (RPA)을 포함한다.
일정 구현예들에서, RNA는 분석 이전에 DNA (cDNA)로 전환된다. cDNA는 통상적인 기법들을 사용하는 분리된 miRNA의 역전사에 의해 생성될 수 있다. miRNA 역전사 키트들은 알려져 있으며 시판되고 있다. 적합한 키트들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 mirVanaTM TaqMan® miRNA 전사 키트 (앰바이온사 (Ambion), 텍사스 오스틴), 및 TaqMan® 전사 키트 (어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems), 캘리포니아 포스터시티)를 포함한다. 광범위 프라이머들 (universal primer), 또는 miRNA-특이적 스템-루프 프라이머들을 포함하는 특이적 프라이머들이 알려져 있으며, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템사로부터 시판되도 있다. 일정 구현예들에서, miRNA는 측정 이전에 증폭된다. 다른 구현예에서, miRNA의 수준이 증폭 과정 동안 측정된다. 보다 다른 구현예들에서, miRNA의 수준은 측정 이전에 증폭되지 않는다. 시료에서 miRNA의 수준을 결정하는 데 적합한 일정 대표적인 방법들이 좀 더 자세하게 하기에 기술된다. 이들 방법들은 단지 설명으로 제공되고, 다른 적합한 방법들이 마찬가지로 사용될 수 있는 점은 당업자에게라면 자명할 것이다.
A. 증폭-기초 방법들
많은 증폭-기초 방법들이, 이에 제한되는 것은 아니지만 PCR, RT-PCR, qPCR, 및 회전 순환 증폭을 포함하여, miRNA 핵산 서열들의 수준을 검출하기 위해 존재한다. 다른 증폭-기초 기법들로는, 예를 들면 라이게이즈 연쇄반응, 다중복합체 라이게이션가능한 탐침 증폭, 시험관내 전사 (IVT), 가닥 대체 증폭 (strand displacement amplification), 전사-매개성 증폭, RNA (에버와인 (Eberwine)) 증폭, 및 당업자들에게 알려진 다른 방법들을 포함한다.
전형적인 PCR 반응은 표적 핵산 종을 선택적으로 증폭하는 복수의 단계들 또는 순환들을 포함한다: 표적 핵산이 변성되는 변성 단계; 한 벌의 PCR 프라이머들 (예로, 전방향 및 역방향 프라이머들)이 상보적인 DNA 가닥들과 아닐링하는 아닐링 단계; 및 열안정한 DNA 중합효소가 프라이머들을 연장하는 연장 단계. 이들 단계들을 복수 회들 반복하여, DNA 단편은 표적 서열에 해당하는 증폭인자 (amplicon)를 생산하도록 증폭된다. 전형적인 PCR 반응들은 20회 이상의 변성, 아닐링, 및 연장의 순환들을 포함한다. 많은 경우들에서, 아닐링 및 연장 단계들은 동시에 수행될 수 있고, 이 경우에 순환은 단지 두 단계들을 포함한다. (miRNA와 상보성을 가지는 cDNA를 생산하는) 역전사 반응은 PCR 증폭 이전에 수행될 수 있다. 역전사 반응들은, 예로 RNA-기초 DNA 중합효소 (역전사효소) 및 프라이머의 사용을 포함한다.
miRNA의 정량적 실시간 PCR을 위한 키트들이 알려져 있으며, 시판되고 있다. 적합한 키트들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 TaqMan® miRNA 검정 (어플라이드 바이오시스템사) 및 mirVanaTM qRT-PCR miRNA 검출 키트 (앰바이온사)를 포함한다. miRNA는 역전사효소 이전에 광범위 프라이머 서열들, 폴리아데닐화 서열, 또는 어댑터 서열을 포함하는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드와 라이게이션되고, 광범위 프라이머 서열과 상보적인 프라이머, 폴리(T) 프라이머, 또는 어댑터 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
일정 경우들에서, 맞춤 (custom) qRT-PCR 검정법들이 miRNA 수준들의 결정을 위해 개발될 수 있다. 생물학적 시료, 예로 신체의 체액에서 miRNA들을 측정하는 맞춤 qRT-PCR 검정법들은, 예를 들면 연장된 역전사 프라이머 및 잠긴 (locked) 핵산 변형된 PCR을 사용하여 개발될 수 있다. 맞춤 miRNA 검정법들은 표적 서열에 해당하는 화학적으로 합성된 miRNA의 일련의 희석 상에 검정법을 전개하여 검사될 수 있다. 이것은 각각의 검정법의 검출 한계 및 정량의 선형 범위의 결정을 허용한다. 또한, 표준 곡선으로서 사용될 때, 이들 데이타는 생물학적 시료들에서 측정된 miRNA들의 절대적 양 (abundance)의 추정을 허용한다.
증폭 곡선들은 Ct 수치들이 각각의 증폭 좌표의 선형 범위에서 평가되는 점을 확인하도록 선택적으로 검토될 수 있다. 전형적으로, 선형 범위는 여러 순위들의 크기로 확장된다. 검정된 각각의 후보 miRNA을 위해, miRNA의 화학적으로 합성된 버전이 획득되고, 검정법의 민감도의 한계, 및 정량의 선형 범위를 결정하도록 일련의 희석으로 분석될 수 있다. 상대적 발현 수준들은 예를 들면 Livak et al ., Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-△△C(T)) Method. Methods (2001) Dec;25(4): 402-8에 의해 기술된 바와 같이, 2(-△△C(T)) 방법에 따라 결정될 수 있다.
일정 구현예들에서, 둘 이상의 miRNA들은 단일한 반응 부피에서 증폭된다. 예를 들면, qRT-PCR과 같은 다중복합체 q-PCR은 하나 이상의 프라이머 쌍들 및/또는 하나 이상의 탐침을 사용하여 하나의 반응 부피에서 관심 있는 적어도 두 개의 miRNA들의 동시적 증폭 및 정량을 가능하게 한다. 프라이머 쌍들은 각각의 miRNA와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 증폭 프라이머를 포함하고, 탐침들은 표지되어 그들은 서로 구분가능하며, 따라서 복수의 miRNA들의 동시적 정량을 허용한다..
회전 순환 증폭 (rolling circle amplification)은 등온 조건들 하에서 선형 또는 기하학 역학들 둘 중 하나로 원형화된 올리고뉴클레오타이드 탐침들을 복제할 수 있는 DNA-중합효소 추진된 반응이다 (예를 들면, Lizardi et al ., Nat. Gen. (1998) 19(3): 225-232; Gusev et al ., Am. J. Pathol. (2001) 159(1): 63-69; Nallur et al ., Nucleic Acids Res. (2001) 29(23): E118 참조). 두 개의 프라이머들의 존재 시, DNA의 (+) 가닥과 혼성화하는 하나, 및 (-) 가닥과 혼성화하는 다른 하나, 가닥 치환의 복잡한 양상은 90분 이하 동안 각각의 DNA 분자의 109개 초과의 사본들의 생성을 유도한다. 폐쇄된 원형 DNA 분자의 일렬로 연결된 사본들이 단일한 프라이머를 사용하여 형성될 수 있다. 공정은 또한 기질-연관된 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 회전 순환 증폭에 사용된 주형은 역전사될 수 있다. 본 방법은 매우 낮은 miRNA 농도들에서 miRNA 서열 및 발현 수준의 매우 민감한 지시인자로서 사용될 수 있다 (예를 들면, Cheng et al ., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (2009) 48(18): 3268-72; Neubacher et al ., Chembiochem. (2009) 10(8): 1289-91).
B. 혼성화 -기초 방법들
miRNA는 이에 제한되는 것은 아니지만 혼성화 어레이들 (예로, 마이크로어레이들), 나노스트링 분석, 노던 블럿 분석, 분지된 DNA (bDNA) 신호 증폭, 및 제자리 혼성화를 포함하는, 혼성화-기초 방법들을 사용하여 검출될 수 있다.
마이크로어레이들은 매우 많은 miRNA들의 발현 수준들을 동시에 측정하는 데 사용될 수 있다. 마이크로어레이들은 유리 슬라이드들 상의 미세-점 핀들로의 인쇄, 미리 작성된 차단제들을 사용한 사진평판 (photolithography), 동적인 마이크로거울 장치들을 사용한 사진평판, 인크-젯 인쇄, 또는 마이크로전극 어레이들 상의 전기화학을 포함하는, 다양한 기술학들을 사용하여 제작될 수 있다.
마이크로어레이 검출의 한 가지 예에서, 인간 센스 miRNA 서열들에 해당하는 다양한 올리고뉴클레오타이드들 (예로, 200+ 5'-아미노-변형된-C6 올리고들)은 약 20 μM의 최종 농도로 삼차원 CodeLink 슬라이드들 (GE 헬스/에머샴 바이오사이언스사 (GE Health/Amersham Biosciences)) 상에서 스폿화되고 제조사의 추천들에 따라 가공된다. 20 μg의 TRIzol-정제된 전체 RNA로부터 합성된 첫 번째 가닥 cDNA는 엔조 바이오어레이 말단 표지 키트 (엔조 라이프 사이언스사 (Enzo Life Sciences Inc.))를 사용하여 바이오틴화된 ddUTP로 표지된다. 혼성화, 염색, 및 세척은 변형된 애피매트릭사 (Affymetrix) 안티센스 게놈 어레이 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
액손 B-4000 스캐너 및 Gene-Pix Pro 4.0 소프트웨어 또는 다른 적합한 소프트웨어가 영상들을 스캔하는 데 사용될 수 있다. 기저선 차감 이후에 비-양성 스폿들, 및 ESD 절차에 의해 검출된 외부선들은 제거된다. 결과로 얻은 신호 강도 수치들은 칩-당 (per-chip) 중앙 수치들로 정상화되고, 다음으로 각각의 miRNA에 대한 기하학적 평균들 및 표준 오차들을 획득하는 데 사용된다. 각각의 miRNA 신호는 로그 기본 2로 변환될 수 있고 한 개-시료 t 테스트가 시행될 수 있다. 각각의 시료를 위한 독립적 혼성화들은 데이타의 강건도 (robustness)를 증가시키도록 다수 번 스폿화된 각각의 miRNA을 가진 칩들 상에서 수행될 수 있다.
마이크로어레이들은 질환들에서 miRNA들의 발현 프로파일화를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, RNA는 시료로부터 추출될 수 있고, 선택적으로 miRNA들은 전체 RNA로부터 크기-선별된다. 올리고뉴클레오타이드 링커들은 miRNA들의 5' 및 3' 말단들과 부착될 수 있고, 그 결과로 얻은 라이게이션 산물들은 RT-PCR 반응을 위한 주형으로서 사용된다. 센스 가닥 PCR 프라이머는 그의 5' 말단과 부착된 형광단을 가질 수 있고, 이에 의해 PCR 산물의 센스 가닥을 표지한다. PCR 산물은 변성되고, 다음으로 마이크로어레이와 혼성화된다. 어레이 상의 해당하는 miRNA 포획 탐침 서열과 상보적인 표적 핵산이라고도 말하는 PCR 산물은 염기쌍 형성을 통해 포획 탐침들이 고정된 스폿과 혼성화할 것이다. 스폿은 다음으로 마이크로어레이 레이저 스캐너를 사용하여 여기될 때 형광을 낼 것이다.
각각의 스폿의 형광 강도는 다음으로 많은 양성 및 음성 대조군들 및 어레이 데이타 정상화 방법들을 사용하여 특정한 miRNA의 사본들의 수의 견지에서 평가되고, 이는 특정한 miRNA의 발현 수준의 평가를 가져올 것이다.
신체의 체액 시료로부터 추출된 miRNA를 포함하는 전체 RNA는 miRNA들의 크기-선별 없이도 역시 직접적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, RNA는 T4 RNA 라이게이즈 및 형광단-표지된 짧은 RNA 링커를 사용하여 3' 말단 표지될 수 있다. 어레이 상의 해당하는 miRNA 포획 탐침 서열과 상보적인 형광단-표지된 miRNA들은 염기쌍 형성을 통해 포획 탐침들이 고정된 스폿과 혼성화한다. 각각의 스폿의 형광 강도는 다음으로, 많은 양성 및 음성 대조군들 및 어레이 데이타 정상화 방법들을 사용하여 특정한 miRNA의 사본들의 수의 견지에서 평가되고, 이는 특정한 miRNA의 발현 수준의 평가를 가져올 것이다.
여러 유형들의 마이크로어레이들은 이에 제한되는 것은 아니지만 스폿화 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이들, 사전-제작된 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이들 또는 스폿화 긴 올리고뉴클레오타이드 어레이들을 포함하여, 채용될 수 있다.
miRNA들은 n카운터 분석 시스템 (나노스트링 테그놀로지사 (NanoString Technologies), 워싱톤 시애틀)을 사용하여 증폭 없이도 역시 검출될 수 있다. 이러한 기술학은 용액에서 혼성화하는 두 개의 핵산-기초 탐침들을 채용한다 (예로, 리포터 탐침 및 포획 탐침). 혼성화 이후에, 여분의 탐침들은 제거되고, 탐침/표적 복합체들은 제조사의 프로토콜에 따라 분석된다. n카운터 miRNA 검정 키트들은 나노스트링 테크놀로지사로부터 시판되고, 이는 높은 특이도로 매우 유사한 miRNA들을 구분할 수 있다.
miRNA들은 또한 분지된 DNA (bDNA) 신호 증폭 (예를 들면, Urdea, Nature Biotechnology (1994), 12: 926-928 참조)를 사용하여 검출될 수 있다. bDNA 신호 증폭을 기초로 하는 miRNA 검정법들은 시판되고 있다. 이러한 검정법의 하나는 QuantiGene® 2.0 miRNA 검정법 (애피매트릭스사, 캘리포니아 산타클라라)이다.
노던 블럿 및 제자리 혼성화도 역시 miRNA들을 검출하는 데 사용될 수 있다. 노던 블럿 및 제자리 혼성화를 수행하는 적합한 방법들이 당해 기술분야에서 알려져 있다.
C. 서열결정-기초 방법들
진보된 서열결정 방법들이 마찬가지로 입수가능한 경우 사용될 수 있다. 예를 들면, miRNA들은 일루미나® 차세대 서열결정 (Illumina® Next Generation Sequencing) (예로, 예를 들면 HiSeq, HiScan, 게놈분석기 (GenomeAnalyzer), 또는 MiSeq 시스템들 (일루미나사, 캘리포니아 샌디에고)을 사용하는 합성-의한-서열결정 (Sequencing-By-Synthesis) 또는 TruSeq 방법들)을 사용하여 검출될 수 있다. miRNA들은 또한 이온 토런트 서열결정 (이온 토런트 시스템사, Gulliford, CT) 또는 반도체 서열결정의 다른 적합한 방법들을 사용하여 검출될 수 있다.
D. 추가적인 miRNA 검출 도구들
질량 분광분석법은 RNase 맵핑을 사용하여 miRNA를 정량하는 데 사용될 수 있다. 분리된 RNA들은 MS 또는 일렬 MS (MS/MS) 접근법들에 의한 그들의 분석 이전에 높은 특이도를 가지는 RNA 엔도뉴클레아제들 (RNase) (예로, 모든 미변형된 구아노신 잔기들의 3' 측면에서 절단하는 RNase T1)로 효소적으로 소화될 수 있다. 개발된 첫 번째 접근법은 ESI-MS와 직접적으로 결합된 역상 HPLC에 의해 엔도뉴클레아제 소화물들의 온-라인 크로마토그래피 분리를 사용하였다. 전사후 변형들의 존재는 RNA 서열을 기초로 하여 예상되는 변형들로부터 질량 이동들에 의해 드러날 수 있다. 변칙적 질량/전화 수치들의 이온들은 다음으로 전사후 변형된 뉴클레오사이드의 서열 배치를 위치시키도록 일렬 MS 서열결정을 위해 분리될 수 있다.
매트릭스-도움 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법 (MALDI-MS)은 전사후 변형된 뉴클레오사이드들에 대한 정보를 획득하는 분석적 접근법으로서도 역시 사용되어 왔다. MALDI-기초 접근법들은 분리 단계에 의해 ESI-기초 접근법들로부터 구분될 수 있다. MALDI-MS에서, 질량 분광측정기는 miRNA를 분리하는 데 사용된다.
제한된 양의 고유의 miRNA들을 분석하기 위하여, nanoESI-MS와 결합된 모세관 LC의 시스템은 맞춤-제작 나노스프레이 이온 출처, 나노부피 밸브 (밸코 인스트루먼트사 (Valco Instruments), 및 미분리 나노 HPLC 시스템 (DiNa, KYA 테크놀로지사)가 장착된 선형 이온 트랩-오비트트랩 하이브리드 질량 분광측정기 (LTQ Orbitrap XL, 써모 피셔 사이언티픽사 (Thermo Fisher Scientific)) 또는 일렬-4배 비행-시간 질량 분광분석기 (tandem-quadrupole time-of-flight mass spectrometer) (QSTAR® XL, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 채용될 수 있다. 분석물/TEAA가 나노-LC 트랩 컬럼 상에 로딩되고, 탈염되고, 다음으로 농축된다. 고유의 miRNA들은 트랩 컬럼으로부터 용출되고 Cl 8 모세관 컬럼 내로 직접 주입되고, 용매들의 극성 증가 구배를 사용하는 RP-HPLC에 의해 크로마토그래피로 분석된다. 크로마토그래피 용출물은 이온들이 음성 극성도 방식으로 스캔 되도록 허용하는 이온화 전압을 사용하여 모세관 컬럼과 부착된 분무기 팁으로부터 분산된다.
miRNA 검출 및 측정을 위한 추가적인 방법들은, 예를 들면 가닥 칩입 검정법 (서드 웨이브 테크놀로지사 (Third Wave Technologies, Inc.)), 표면 플라스몬 공명 (SPR), cDNA, MTDNA (금속성 DNA; 어드밴스 테크놀로지사 (Advance Technologies), Saskatoon, SK), 및 미국 게노믹스사에 의해 개발된 것과 같은 단일-분자 방법들을 포함한다. 복수의 miRNA들은 나노입자-증폭된 SPR 영상화 (SPRI)와 표면 효소 반응을 조합하는 새로운 접근법을 사용하는 마이크로어레이로 검출될 수 있다. 폴리(A) 중합효소의 표면 반응은 잠긴 핵산 (LNA) 마이크로어레이 상에 혼성화된 miRNA들 위에 폴리(A) 미단들을 만든다. DNA-변형된 나노입자들은 다음으로 폴리(A) 미단들 상에 흡착되고 SPRI로 검출된다. 이러한 초민감한 나노입자-증폭된 SPRI 방법론은 아타몰 (attamole) 수준들로 miRNA 프로파일화에 사용될 수 있다.
E. 증폭된 또는 미-증폭된 miRNA 들의 검출
소정의 구현예들에서, 표지들, 염료들, 또는 표지된 탐침들 및/또는 프라이머들은 증폭된 또는 미증폭된 miRNA들을 검출하는 데 사용된다. 당업자라면 검출 방법의 민감도 및 표적의 양을 기초로 하여 어떤 검출 방법들이 적당한지를 인식할 것이다. 검출 방법의 민감도 및 표적의 양에 의존하여, 증폭이 검출 이전에 요구되거나 요구되지 않을 수 있다. 당업자라면 miRNA 증폭이 바람직한 검출 방법들을 인식할 것이다.
탐침 또는 프라이머는 표준 (A, T 또는 U, G 및 C) 염기들, 또는 변형된 염기들을 포함할 수 있다. 변형된 염기들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 AEGIS 염기들 (에라젠 바이오사이언스사 (Eragen Biosciences)로부터 나옴)을 포함하고, 이들은 예로 미국 특허들 제 5,432,272호, 제 5,965,364호, 및 제 6,001,983호에서 기술되어 왔다. 소정의 관점들에서, 염기들은 자연적 포스포디에스테르 결합 또는 다른 화학적 결합에 의해 연결된다. 다른 화학적 결합으로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 펩타이드 결합 또는 잠긴 핵산 (LNA) 결합을 포함하고, 이는 예로 미국 특허 제 7,060,809호에 기술된다.
심화 관점에서, 증폭 반응에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 탐침들 또는 프라이머들은 시간의 함수로서 생산되는 증폭 산물의 양을 감시하는 데 적합하다. 소정의 관점들에서, 서로 다른 단일가닥 대비 이중가닥 특성을 가지는 탐침들은 핵산을 검출하는 데 사용된다. 탐침들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 5'-엑소뉴클레아제 검정법 (예로, TaqManTM) 탐침들 (미국 특허 제 5,538,848호 참조), 스템-루프 분자적 비콘들 (예로, 미국 특허들 제 6,103,476호 및 제 5,925,517호 참조), 스템이 없거나 선형의 비콘들 (예로, 국제특허출원 제 WO 9921881호, 미국 특허들 제 6,485,901호 및 제 6,649,349호 참조), 펩타이드 핵산 (PNA) 분자적 비콘들 (예로, 미국 특허들 제 6,355,421호 및 제 6,593,091호 참조), 선형의 PNA 비콘들 (예로, 미국 특허 제 6,329,144호 참조), 비-FRET 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,150,097호 참조), 선라이즈TM (SunriseTM)/앰플리플루어BTM (AmplifluorBTM) 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,548,250호 참조), 스템-루프 및 이중복합체 스콜피온TM (ScorpionTM) 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,589,743호 참조), 벌지 루프 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,590,091호 참조), 유사 매듭 (pseudo knot) 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,548,250호 참조), 싸이클리콘들 (cyclicon) (예로, 미국 특허 제 6,383,752호 참조), MGB 에클립스TM 탐침 (에포크 바이오사이언스사 (Epoch Biosciences)), 헤어핀 탐침들 (예로, 미국 특허 제 6,596,490호 참조), PNA 라이트-업 탐침들, 안티프라이머 제거 (antiprimer quench) 탐침들 (Li et al., Clin. Chem. 53: 624-633 (2006)), 자가-조립 나노입자 탐침들, 및 예를 들면 미국 특허 제 6,485,901호에 기술된 페로센 (ferrocene)-변형된 탐침들을 포함한다.
소정의 구현예들에서, 증폭 반응에서 하나 이상의 프라이머들은 표지를 포함할 수 있다. 보다 심화 구현예들에서, 서로 다른 탐침들 또는 프라이머들은 서로를 구분하는 검출가능한 표지들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 탐침 또는 프라이머와 같은 핵산은 둘 이상의 구분가능한 표지들로 표지될 수 있다.
일정 관점들에서, 표지는 하나 이상의 탐침들과 부착되고 다음의 성질들의 하나 이상을 가진다: (i) 검출가능한 신호를 제공하고; (ii) 두 번째 표지와 상호작용하여 두 번째 표지, 예로 FRET (형광 공명 에너지 전이)에 의해 제공된 검출가능한 신호를 변형하고; (iii) 혼성화, 예로 이중복합체 형성을 안정화하고; (iv) 결합 복합체 또는 친화도 집합, 예로 친화도, 항체-항원, 이온성 복합체들, 햅텐-리간드 (예로, 바이오틴-아비딘)의 구성원을 제공한다. 보다 다른 관점들에서, 표지들의 사용은 알려져 있는 표지들, 연결들, 연결기들 (linking group), 시약들, 반응 조건들, 그리고 분석 및 정제 방법들을 채용하는 매우 많은 기지의 기법들의 임의의 하나를 사용하여 달성될 수 있다.
miRNA들은 직접적 또는 간접적 방법들에 의해 검출될 수 있다. 직접적 검출 방법에서, 하나 이상의 miRNA들은 핵산 분자와 연결된 검출가능한 표지에 의해 검출된다. 이러한 방법들에서, miRNA들은 탐침과 결합 이전에 표지될 수 있다. 따라서, 결합은 탐침과 결합된 표지된 miRNA에 대해 검색하여 검출된다. 탐침은 선택적으로 반응 부피에 있는 비드와 연결된다.
소정의 구현예들에서, 핵산들은 표지된 탐침과의 직접적 결합에 의해 검출되고, 탐침이 연속하여 검출된다. 본 발명의 한 가지 구현예에서, 증폭된 miRNA들과 같은 핵산들은 원하는 핵산들을 포획하도록 탐침들과 결합된 FIexMAP 미세구들 (Microsphere) (루미넥스사 (Luminex))를 사용하여 검출된다. 일정 방법들은 예를 들면 형광성 표지들로 변형된 폴리뉴클레오타이드 탐침들로의 검출 또는 분지된 DNA (bDNA) 검출이 관여할 수 있다.
다른 구현예들에서, 핵산들은 간접적 검출 방법들에 의해 검출된다. 예를 들면, 바이오틴화된 탐침은 결합된 핵산을 검출하도록 스트렙타비딘-결합된 염료와 조합될 수 있다. 스트렙타비딘 분자는 증폭된 miRNA 상의 바이오틴 표지와 결합하고, 결합된 miRNA는 스트렙타비딘 분자와 부착된 염료 분자를 검출하여 검출된다. 한 가지 구현예에서, 스트렙타비딘-결합된 염료 분자는 파이코링크® 스트렙타비딘 R-파이코에리트린 (PROzyme)을 포함한다. 다른 결합된 염료 분자들은 당업자들에게 알려져 있다.
표지들은 이에 제한되는 것은 아니지만: 검출가능한 형광성, 화학발광성, 또는 생물발광성 신호 (예로, Kricka, L., Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego (1992) 및 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press (1997))를 생성하거나 제거하는 광-방출, 광-분산, 및 광-흡수 화합물들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 리포터 형광단 및 제거기 (quencher) 형광단을 포함하는 이중 표지된 형광성 탐침이 사용된다. 구별된 방출 스펙트럼들을 가지는 형광단들의 쌍들이 선택되고, 그들은 쉽게 구분될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
소정의 구현예들에서, 표지들은 이중복합체들의 혼성화를 증진하거나, 안정화하거나, 이에 영향을 주도록 작용하는 혼성화-안정화 분체들, 예로 삽입인자들 (intercalator) 및 삽입화 염료들 (이에 제한되는 것은 아니지만 에티디움 브로마이드 및 SYBR-그린을 포함함), 작은-홈 결합제들 (minor-groove binder), 및 교차-연결 기능기들 (예로, Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996) 참조)이다.
다른 구현예들에서, miRNA들을 정량하는 혼성화 및/또는 라이게이션에 의존하는 방법들이 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 (OLA) 방법들 및 표적 핵산 서열과 혼성화하는 구분가능한 탐침을 미결합 탐침으로부터 분리되도록 허용하는 방법들을 포함하여 사용될 수 있다. 예로서, 미국 특허공고 제 2006/0078894호에서 개시된 바와 같은 HARP-유사 탐침들이 miRNA들의 정량을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법들에서, 탐침 및 표적화 핵산 간의 혼성화 이후에 탐침은 혼성화된 탐침을 미혼성화된 탐침으로부터 구분하도록 변형된다. 이후에, 탐침은 증폭되고/되거나 검출될 수 있다. 일반적으로, 탐침 불활성화 부위는 탐침의 표적 혼성화 부위 내의 뉴클레오타이드들의 소집합을 포함한다. 그의 표적 핵산과 혼성화하지 않고, 이에 따라 표적 핵산의 검출을 허용하는 HARP 탐침의 증폭 또는 검출을 감소시키거나 방지하기 위하여, 혼성화후 탐침 불활성화 단계가 그의 표적화 핵산 서열과 혼성화하는 HARP 탐침 및 해당하는 미혼성화 HARP 탐침 간을 구분할 수 있는 제제를 사용하여 수행된다. 제제는 미혼성화 HARP 탐침을 불활성화하거나 변형할 수 있어, 증폭될 수 없다.
탐침 라이게이션 반응도 또한 miRNA들을 정량하는 데 사용될 수 있다. 다중복합체 라이게이션-의존성 탐침 증폭 (MLPA) 기법들에서 (Schouten et al., Nucleic Acids Research 30: e57 (2002)), 표적 핵산 상에 서로 바로 인접하여 혼성화하는 탐침들의 쌍들은 표적 핵산의 존재에 의해 추진된 서로가 라이게이션된다. 일정 관점들에서, MLPA 탐침들은 끼여있는 PCR 프라이머 결합 부위들을 가진다. MLPA 탐침들은 라이게이션될 때 특이적으로 증폭되고, 이에 따라 miRNA 바이오마커들의 검출 및 정량을 허용한다.
6. miRNA 바이오마커들을 사용한 알츠하이머병의 결정
본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들은 개체의 알츠하이머병 상태를 평가하도록 진단적 검사들에서 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 질환 상태는 알츠하이머병의 존재 또는 부재를 포함한다. 질환 상태는 또한 알츠하이머병의 경과를 감시하는 것, 예를 들면, 질환 진행을 감시하는 것을 포함할 수 있다. 개체의 알츠하이머병 상태를 기초로 하여, 추가적인 절차들이 예를 들면 추가적인 진단적 검사들 또는 치료적 절차들을 포함하여 지시될 수 있다.
질환 상태를 정확하게 예측하는 진단적 검사의 힘은 검정법의 정확도, 검정법의 민감도, 검정법의 특이도, 또는 "곡선 아래의 영역" (AUC) 예를 들면 수여자 작동 특징 (ROC) 곡선 아래의 영역의 견지에서 보편적으로 측정된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 정확도는 잘못 분류된 시료들의 분획의 척도이다. 정확도는 예로 검사 집단에서 시료들의 전체 수로 나눈 정확하게 분류된 시료들의 전체 수로서 계산될 수 있다. 민감도는 검사에 의해 양성으로 예측된 "진정한 양성들"의 척도이고, 알츠하이머병 시료들의 전체 수로 나눈 정확하게 확인된 알츠하이머병 시료들의 수로서 계산될 수 있다. 특이도는 검사에 의해 음성으로 예측된 "진정한 음성들"의 척도이고, 정상 시료들의 전체 수로 나눈 정확하게 확인된 정상 시료들의 수로서 계산될 수 있다. AUC는 민감도 대비 위양성율 (1- 특이도)의 좌표가 되는 수여자 작동 특징 곡선 아래의 영역이 척도이다. AUC가 클수록, 검사의 예측적 수치는 더 강력해진다. 검사의 유용성의 기타 유용한 척도들은 양성들로서 검사하는 실제적 양성들의 백분율인 "양성 예측적 수치", 및 음성들로서 검사하는 실제 음성들의 백분율인 "음성 예측적 수치"를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 서로 다른 알츠하이머병 상태들을 가지는 개체들로부터 유래한 시료들에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준은 적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같이, 정상 개체들과 대비한 적어도 p < 0.05, 예로 p < 0.05, p < 0.01, p< 0.005, p < 0.001 등의 통계학적으로 유의한 차이를 보여준다. 다른 바람직한 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들을 사용하는 진단적 검사들은 개별적으로 또는 조합으로 적어도 약 75%의 정확도, 예로 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 또는 약 100%의 정확도를 보여준다. 다른 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들을 사용하는 진단적 테스트들은 개별적으로 또는 조합으로 적어도 약 75%의 특이도, 예로 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 또는 약 100%의 특이도를 보여준다. 다른 바람직한 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들을 사용하는 진단적 검사들은 개별적으로 또는 조합으로 적어도 약 75%의 민감도, 예로 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 또는 약 100%의 민감도를 보여준다. 다른 바람직한 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들을 사용하는 진단적 검사들은 개별적으로 또는 조합으로 적어도 약 75%의 특이도 및 민감도, 예로 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 또는 약 100%의 특이도 및 민감도를 보여준다 (예를 들면 약 80%의 특이도 및 약 80%의 민감도, 또는 예를 들면 약 80%의 특이도 및 약 95%의 민감).
표 2에 나열된 각각의 바이오마커는 정상 대조군과 비교 시 알츠하이머병을 가진 개체들로부터 유래한 생물학적 시료들에서 차별적으로 존재하고, 따라서 각각은 테스트 개체에서 알츠하이머병의 결정을 용이하게 하는 데 개별적으로 유용하다. 이러한 방법은 개체로부터 유래한 시료에서 바이오마커의 수준을 결정하는 것이 관여한다. 시료에서 바이오마커의 수준을 결정하는 것은 임의의 적합한 방법, 예를 들면 본 명세서에서 설명된 방법들을 사용하여 시료에서 바이오마커의 수준을 측정하거나, 검출하거나, 검정하는 것을 포함한다. 본 방법은 시료에서 바이오마커의 수준을 적합한 대조군과 비교하는 것도 역시 관여할 수 있다. 적합한 대조군을 사용하여 평가된 바와 같이 정상 개체에서의 수준과 대비한 바이오마커의 수준에서의 변화는 개체의 알츠하이머병 상태를 나타낸다. 개체가 특정한 알츠하이머병 상태를 가지는 것으로서 분류되는 초과 또는 미만의 바이오마커의 양을 나타내는 바이오마커의 진단적 양이 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이오마커가 정상 개인과 비교 시 알츠하이머병을 가지는 개인으로부터 유래한 시료들에서 저하조절되는 경우라면, 진단적 컷-오프 미만의 측정된 양은 알츠하이머병의 진단을 제공한다. 일반적으로, 표 2에서 개별적 miRNA 바이오마커들은 정상 개인들로부터 획득된 시료들과 대비하여 알츠하이머병 시료들에서 저하조절된다. 당해 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 검정법에 사용된 특정한 진단적 컷-오프를 조절하는 것은 원하는 경우 진단적 검정법의 민감도 및/또는 특이도를 조절하도록 허용한다. 특정한 진단적 컷-오프는 예를 들면 서로 다른 알츠하이머병 상태들을 가진 개체들로부터 얻은 통계학적으로 유의한 수의 시료들에서 바이오마커의 양을 측정하고, 원하는 수준의 정확도, 민감도, 및/또는 특이도에서 컷-오프를 가져와서 결정될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 진단적 컷-오프는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 분류화 알고리즘의 도움으로 결정될 수 있다.
이에 따라, 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 단계에 의해 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법들로서, 정상 개체에서의 수준 대비 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 차이는 (적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같음) 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법들이 제공된다. 적어도 하나의 miRNA는 바람직하게 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, 및 Let-7d의 적어도 하나를 포함하고, 선택적으로 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 개체로부터 유래한 순환하는 miRNA를 포함하는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 방법으로서, 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준에서의 감소가 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법을 제공한다.
선택적으로, 본 방법은 시료에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 기초로 하여 개체가 알츠하이머병을 갖거나 갖지 않는 지의 진단을 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 방법은 개체에서 알츠하이머병의 진단과 적합한 대조군과 대비한 적어도 하나의 miRNA의 수준 또는 수준들에서의 차이와의 연관성을 보여주는 단계를 더 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 이러한 진단은 개체에게 직접적으로 제공될 수 있거나, 개체의 보호에 관여하는 또 다른 상대에게 제공될 수 있다.
개별적 miRNA 바이오마커들이 본 명세서에서 확인된 바와 같이 알츠하이머병을 위한 진단적 적용들에 유용한 한편, miRNA 바이오마커들의 조합은 단독으로 사용될 때 miRNA 바이오마커들보다 더 큰 알츠하이머병의 예측적 수치를 제공할 수 있다. 상세하게, 다수의 miRNA 바이오마커들의 검출은 진단 검사의 정확도, 민감도, 및/또는 특이도를 증가시킬 수 있다. 대표적인 miRNA 바이오마커들 및 바이오마커 조합들은 표 8A 내지 표 8C에 나타나 있다. 75%의 전반적인 정확도를 나타내는 miRNA 바이오마커들 및 바이오마커 조합들은 표 9A 내지 표 9B에 나타나 있다. 본 발명은 이들 도표들에서 설명된 바와 같은 개별적 바이오마커들 및 바이오마커 조합들, 그리고 본 명세서에 기술된 방법들 및 키트들에서 그들의 용도를 포함한다.
이에 따라, 개체로부터 얻은 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준을 결정하여 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법들로서, 정상 개체에서의 수준 대비 miRNA들의 수준에서의 차이는 (적합한 대조군과 대비하여 결정된 바와 같음) 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 방법들이 제공된다. miRNA들은 바람직하게 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, 및 Let-7d의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 miR-301a, miR-545, 또는 miR-301a 및 miR-545을 포함할 수 있다. 둘 이상의 miRNA 바이오마커들의 대표적인 조합들로는 예를 들면 miR-545, let7g, 및 miR-15b; miR-15b 및 miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g 및 miR-15b; miR-191 및 miR-15b; Let-7g 및 miR-15b; miR-191, miR-301a, 및 miR-545; miR-301a, let-7g, 및 miR-15b; 그리고 miR-191, miR-301a, miR-545, 및 miR-15b을 포함한다.
또한 개체에서 알츠하이머병을 진단하는 방법으로, 개체로부터 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준들을 결정하는 단계, 정상 개체들 및 알츠하이머병을 가진 개체들에 존재하는 동일한 miRNA들의 수준들을 나타내는 한 벌의 데이타와 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 수준들을 비교하는 단계, 및 비교를 기초로 하여 개체들을 알츠하이머병을 갖거나 갖지 않는 것으로서 진단하는 단계에 의하는, 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, 한 벌의 데이타는 적합한 대조군 또는 개체로부터 얻은 시료와 비교를 위한 참조 표준으로서 작용한다. 한 벌의 데이타와 개체로부터 얻은 시료의 비교는 분류화 알고리즘에 의해 도움을 받을 수 있고, 이는 통계학적으로 유의한 차이가 시료에서 둘 이상의 miRNA들의 종합적 수준들 및 정상 개체들 또는 알츠하이머병을 가진 개체들에 존재하는 동일한 miRNA들의 수준들 간에 존재하는지 여부를 전산화한다.
7. 알츠하이머병 상태를 분석하기 위한 분류화 알고리즘들의 생성
일정 구현예들에서, "기지의 시료들"과 같은 시료들을 사용하여 생성되는 데이타는 다음으로 분류화 모델을 "훈련"하는데 사용될 수 있다. "기지의 시료"는 사전-분류되었던, 예로 정상 개체로부터 또는 알츠하이머병을 가진 개체로부터 유래한 것으로서 분류되었던 시료이다. 스펙트럼들로부터 유래하고 분류화 모델을 형성하는 데 사용되는 데이타는 "훈련 데이타 집합 (training data set)"이라고 명명될 수 있다. 일단 훈련된 경우라면, 분류화 모델은 미지의 시료들을 사용하여 생성된 스펙트럼들로부터 유래한 데이타에서 양상들을 인식할 수 있다. 분류화 모델은 다음으로 미지의 시료들을 부류들 (class) 내로 분류하는 데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면 특정한 생물학적 시료가 소정의 생물학적 병태와 연관되는지 여부를 (예로, 이환 대비 비-이환) 예측하는 데 유용할 수 있다.
일정 구현예들에서, 분류화 모델을 형성하는 데 사용되는 훈련 데이타 집합을 위한 데이타는 정량적 PCR (예를 들면, △△Ct 방법을 사용하여 획득된 Ct 수치들)로부터, 또는 마이크로어레이 분석과 같은 고-처리량 발현 프로파일화로부터 직접적으로 획득될 수 있다 (예를 들면, miRNA 발현 검정법, 예로 n카운터 miRNA 발현 검정법으로부터 얻은 전체 계수들 또는 정상화된 계수들).
분류화 모델들은 데이타에 존재하는 객관적인 매개변수들을 기초로 하여 데이타의 몸통들을 부류들 내로 분리하도록 시도하는 임의의 적합한 통계학적 분류화 (또는 "학습 (learning)") 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 분류화 방법들은 관리되거나 관리되지 않을 수 있다. 관리된 및 미관리된 분류화 공정들의 예들은 Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No. 1, 2000년 1월에 기술되어 있고, 이의 제안들은 참고문헌으로 통합된다.
관리된 분류화에서, 기지의 카테고리들의 예들을 포함하는 훈련 데이타는 학습 기작으로 표현되고, 이는 각각의 기지의 부류들을 정의하는 하나 이상의 연관성들의 집합들을 학습한다. 다음으로 새로운 데이타는 학습 기작에 적용될 수 있고, 이는 다음으로 학습된 연관성들을 사용하여 새로운 데이타를 분류한다. 관리된 분류화 공정들의 예들로는 선형 회귀 공정들 (예로, 복수의 선형 회귀 (MLR), 부분적 최소 제곱들 (PLS) 회귀 및 기본 성분들 회귀 (PCR)), 이중 결정 트리들 (예로, CART-- 분류화 및 회귀 트리들과 같은 반복적인 분류 공정들), 역 전파 네트워크들과 같은 인위적 신경망들, 판별식 분석들 (예로, 베이시안 분류인자 (Bayesian classifier) 또는 피셔 분석), 로지스틱 분류인자들, 및 서포트 벡터 분류인자들 (서포트 벡터 머신들)을 포함한다.
다른 구현예들에서 작성된 분류화 모델들은 미관리된 (unsupervised) 학습 방법들을 사용하여 형성될 수 있다. 미관리된 분류화는 훈련 데이타 집합이 유래한 스펙트럼들을 사전-분류하지 않고도, 훈련 데이타 집합에서 유사성들을 기초로 하여 분류화들을 학습하도록 시도한다. 집합 (cluster) 분석법은 데이타를 "집합들" 또는 서로 매우 유사하고 다른 집합들의 구성원들과는 매우 비유사한 구성원들을 이상적으로 가지는 그룹들 내로 분할하도록 시도한다. 다음으로 유사성은 일정 거리 측정을 사용하여 측정되고, 이는 데이타 항목들 간의 거리를 측정하고, 서로 더 밀접한 데이타 항목들을 함께 수집한다. 수집 기법들은 맥퀸 (MacQueen)의 K-평균들 알고리즘 및 코호넨 (Kohonen)의 자가-조직화 맵 알고리즘을 포함한다.
생물학적 정보를 분류하는 용도를 위해 제시된 학습 알고리즘들은, 예를 들면 PCT 국제특허출원 공고 제 WO 01/31580호 (Barnhill et al., "Methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods of use thereof"), 미국 특허출원 제 2002 0193950 A1호 (Gavin et al, "Method or analyzing mass spectra"), 미국 특허출원 제 2003 0004402 A1호 (Hitt et al., "Process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data"), 및 미국 특허출원 제 2003 0055615 A1호 (Zhang and Zhang, "Systems and methods for processing biological expression data")에서 기술된다. 전술한 특허출원들의 내용들은 그들의 전부가 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다.
분류화 모델들은 임의의 적합한 디지탈 컴퓨터 상에서 형성되고 이의 상에서 사용될 수 있다. 적합한 디지탈 컴퓨터들로는 유닉스 (Unix), 윈도우TM 또는 리눅스TM 기초한 작동 시스템과 같은 임의의 표준 또는 특수화된 작동 시스템을 사용하는 마이크로, 미니, 또는 대형 컴퓨터들을 포함한다.
훈련 데이타 집합(들) 및 분류화 모델들은 디지탈 컴퓨터에 의해 실행되거나 사용되는 컴퓨터 암호에 의해 구현될 수 있다. 컴퓨터 암호는 광학 또는 자기 디스크들, 스틱들, 테이프들 등을 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터 해독가능한 매체들 상에 저장될 수 있고, C, C++, 비주얼 베이직 등을 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터 프로그램화 언어로 작성될 수 있다.
상기에 기술된 학습 알고리즘들은 알츠하이머병에 대한 miRNA 바이오마커들을 위한 분류화 알고리즘들을 개발하는 데 사용될 수 있다. 분류화 알고리즘들은 다음 순서로 단독 또는 조합으로 사용되는 바이오마커들의 진단적 수치들 (예로, 컷-오프 점수들)을 제공하여 진단적 검사들에 사용될 수 있다.
8. 추가적인 진단적 검사들
알츠하이머병을 나타내는 miRNA 바이오마커들의 수준은 개체에서 알츠하이머병의 독립형 진단적 지시인자로서 사용될 수 있다. 선택적으로, 본 방법들은 알츠하이머병의 진단을 용이하게 하도록 적어도 하나의 추가적인 검사의 수행을 포함할 수 있다. 예를 들면, 알츠하이머병의 진단을 용이하게 하기 위하여 추가적으로 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 다른 방법들이 수행될 수 있다. 알츠하이머병의 진단을 용이하게 하는 데 임상적 관행으로 사용되는 임의의 다른 검사 또는 검사들의 조합은 본 명세서에서 기술된 miRNA 바이오마커들과 조합으로 사용될 수 있다.
예를 들면, 임상 의사라면 개체로부터 유래한 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 것에 추가하여 개체 상에서 정신 상태 검사들을 수행할 수 있다. 이러한 검사들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 간이-정신 상태 검사 (MMSE), 간이-인지 검사, ADAS-인지 검사, 및/또는 시계-그리기 검사를 포함할 수 있다. 이들 검사들은 일상적으로 알츠하이머병의 진단을 용이하게 하는데 임상적 관행으로 사용된다.
마찬가지로, 뇌 영상화 검사들, 예를 들면 MRI 또는 CT 스캔이 개체 상에서 수행될 수 있다. 이들 검사들은 주로 종양들, 뇌졸중들, 또는 뇌에서의 체액과 같은 알츠하이머병과 유사한 증상들을 유발할 수 있는 다른 병태들을 배제하도록 수행된다.
신경학적 검사가 개체들 상에서 수행될 수 있고, 이는 개체의 반사들, 협동 (coordination), 근육 강도, 눈 운동, 말하기, 및/또는 감각과 같은 병태들이 검사된다.
개체는 개체가 알츠하이머병을 발생시킬 증가된 위험성을 가질 수 있는 여부를 나타내는 유전적 요인들에 대해 검색될 수 있다. 개체는 마찬가지로 알츠하이머병을 나타내는 적어도 다른 하나의 바이오마커의 존재, 부재, 또는 수준에 대해 검색될 수 있다.
9. 치료 방법들
일정 구현예들에서, 개체가 본 명세서에서 기술된 방법들에 의해 알츠하이머병으로 진단되는 경우, 본 발명은 알츠하이머병을 가지는 것으로 확인된 이러한 개체를 치료하는 방법들을 더 제공한다. 이에 따라, 한 가지 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 시료에서 적어도 하나의 miRNA 바이오마커의 수준을 결정하는 단계로서, 적합한 대조군과 대비하여 결정되는 바와 같은 정상 개체에서의 수준 대비 적어도 하나의 miRNA 바이오마커의 수준에서의 차이는 개체에서 알츠하이머병을 나타내는, 단계, 및 알츠하이머병의 치료제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 유래한 시료에서 적어도 하나의 miRNA 바이오마커의 수준이 적합한 대조군과 대비하여 결정되는 바와 같은 정상 개체에서의 수준 대비 달라지는 (예로, 감소되는) 알츠하이머병을 가진 개체를 확인하는 단계, 및 알츠하이머의 치료제의 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
용어 "알츠하이머의 치료제"는 예를 들면 알츠하이머병의 치료를 위해 미국 식품 의약품 안전청에 의해 승인된 물질들을 포함한다. 이러한 물질들로는 예를 들면 라자다인® (갈란타민), 엑셀론® (리바스티그민), 또는 아리셉트® (도네페질)을 포함한다. 대표적인 구현예에서, 알츠하이머의 치료제는 도네페질 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 (예로, 도네페질 염산)이다.
알츠하이머의 치료들은 약제학적 조성물을 사용하여 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 약제학적 조성물들은 알츠하이머병 치료제 (또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르)를 포함하고, 선택적으로 갈란타민, 리바스티그민, 도네페질 또는 임의의 전술한 약물들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다 (예로, 갈란타민 하이드로브로마이드, 리바스티그민 타르트레이트, 도네페질 염산). 소정의 구현예들에서, 이들 조성물들은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료제들을 더 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 부당한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이도 인간들 및 하등한 동물들의 조직들과 접촉하는 사용에 적합하고, 합리적인 유익/위험 비율을 가지는 이들 염들을 말한다. 아민들, 카르복실산들 및 다른 유형들의 화합물들의 약제학적으로 허용가능한 염들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 버지 등은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된 S. M. Berge, et al ., J. Pharmaceutical Sciences , 66: 1-19 (1977)에서 약제학적으로 허용가능한 염들을 자세하게 기술하고 있다. 염들은 본 발명의 화합물들의 최종 분리 및 정제과정 동안 제자리에서, 또는 적합한 시약과 자유 염기 또는 자유 산 기능을 반응시켜서 별도로 제조될 수 있다. 예를 들면, 화합물들이 산성 분체를 보유하는 곳에서, 적합한 그의 약제학적으로 허용가능한 염들은 알칼리 금속 염들, 예로, 소듐 또는 포타슘 염들; 및 알칼리 토금속 염들, 예로 칼슘 또는 마그네슘 염들과 같은 금속 염들을 포함할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 에스테르"는 본 명세서에서 사용되는 바 시 험관내에서 가수분해하는 에스테르들을 말하고, 부모 화합물 또는 그의 염을 이탈하도록 인간 신체에서 바로 분해되는 것들을 포함한다. 적합한 에스테르기들은, 예를 들면 약제학적으로 허용가능한 지방족 카르복실산들, 상세하게 알카노, 알케노, 고리알카노 및 알칸디오 산들로부터 유래한 것들을 포함하고, 각각의 알킬 또는 알케닐 분체는 유리하게 6개 이상의 탄소 원자들을 가지지 않는다.
상기에 기술된 바와 같이, 약제학적 조성물들은 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어 담체는 원하는 특정한 용량 형태를 제조하는 데 적합한 임의의 및 모든 용매들, 희석제들, 또는 다른 액체 운반체, 분산 또는 현탁 보조물들, 표면 활성 제제들, 등장성 제제들, 비후화 또는 에멀전화 제제들, 보존제들, 고형 결합제들, 광택제들 등을 포함한다. 레밍턴의 약제학적 과학들 Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 6판, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)은 약제학적 조성물들을 제형화하는 데 사용되는 다양한 담체들 및 그들의 제조를 위한 기지의 방법들을 개시하고 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체들로서 작용할 수 있는 물질들의 일정 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 락토스, 포도당 및 슈크로스와 같은 당들; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분들; 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 그의 유도체들; 분말화된 트래거칸스 고무 (tragacanth); 말트; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터 및 좌약 왁스들과 같은 부형제들; 땅콩 오일, 목화씨 오일과 같은 오일들; 잇꽃 오일, 참깨 오일; 올리브 오일; 옥수수 오일 및 콩 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜들; 에틸 올레이트 및 에틸 로리에이트와 같은 에스테르들; 아가; 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 완충 제제들; 알긴산; 무발열원 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올, 및 포스페이트 완충용액들, 뿐만 아니라 소듐 로릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 다른 비-독성 적합한 광택제들을 포함하고, 뿐만 아니라 채색 제제들, 방출 제제들, 코팅 제제들, 감미제들, 향미제들 및 방향제들, 보존제들 및 항산화제들도 역시 제형 담당자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명에서 용도를 위한 조성물들은 원하는 알츠하이머의 치료제의 임의의 농도를 가지도록 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 본 조성물은 이것이 치료적 유효량의 알츠하이머의 치료제를 포함하도록 제형화된다.
10. miRNA 바이오마커들을 검출하기 위한 키트들
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병 상태를 진단하는 키트들로서, miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, 및 miR-545, 그리고 그들의 조합들의 하나 이상을 결정하는 데 유용한, 키트들을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 하나 이상의 miRNA들은 miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 키트들은 개체로부터 유래한 시료에서 알츠하이머병을 진단하는 miRNA 또는 miRNA들의 그룹의 존재를 선별적으로 검출하도록 적응된 물질들 및 시약들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 구현예에서, 본 키트는 miRNA와 특이적으로 혼성화하는 시약을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 miRNA를 검출하는 데 적합한 형태로 있는 핵산 분자, 예를 들면 탐침 또는 프라이머일 수 있다. 본 키트는 하나 이상의 miRNA들을 검출하도록 검정법을 수행하는 데 유용한 시약들, 예를 들면 qPCR 반응으로 하나 이상의 miRNA들을 검출하는 데 사용될 수 있는 시약들을 포함할 수 있다. 본 키트는 마찬가지로 하나 이상의 miRNA들을 검출하는 데 유용한 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
심화 구현예에서, 본 키트는 라벨 또는 제품 삽입물의 형태로 적합한 작동 매개변수들을 위한 지침들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 지침들은 시료를 채취하는 방식, 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준을 결정하는 방식, 또는 개체의 알츠하이머병 상태와 시료에서 하나 이상의 miRNA 바이오마커들의 수준과의 연관성을 보여주는 방식에 관한 정보 또는 안내서들을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 키트는 참조 표준들, 적합한 대조군들으로서, 또는 테스트 시료에서 miRNA 바이오마커들을 검출하는 검정법의 측정을 위해 사용될 miRNA 바이오마커 시료들을 가진 하나 이상의 용기들을 포함할 수 있다.
도 1A 및 도 1B는 n카운터 miRNA 검정법을 사용한 집단 1 (20명의 알츠하이머병 (AD) 또는 경미한 인지 손상 (MCI) 환자들 (11명 AD 및 9명 MCI) 및 20명의 정상 대조군 (NC) 환자들)로부터 얻은 정상화된 miRNA 발현의 분산 좌표들을 나타낸 것이다.
도 2는 TaqMan RT-qPCR을 사용한 집단 1 (20명의 AD 또는 MCI 환자들 및 20명의 NC 환자들)로부터 얻은 개별적 후보 miRNA 바이오마커들의 평균 NC 수치들로 정상화된 선형 배수 변화 수치들의 분산 좌표들을 나타낸 것이다.
도 3은 TaqMan RT-qPCR을 사용한 집단 2 (20명의 AD 및 17명의 NC 환자들)로부터 얻은 개별적 후보 miRNA 바이오마커들의 평균 대조군 수치들로 정상화된 선형 배수 변화 수치들의 분산 좌표들을 나타낸 것이다.
표 1은 프리시젼메드사 (PrecisionMed, Inc.)로부터 획득된 바와 같은 진단, 연령, 성별, MMSE 점수들 및 방문 횟수들을 포함하는 집단 1에서 환자들의 입수가능한 세부사항들을 나타낸 것이다.
표 2는 miRNA 바이오마커들 및 정상화에 사용된 miRNA들의 서열 및 miRBASE 기탁번호들을 나타낸 것이다.
표 3은 집단 1 시료들 (20명 AD 또는 MCI (11명 AD 및 9명 NC) 및 20명 NC)의 경우에 나노스트링 및 TaqMan 플랫폼들 간의 후보 miRNA 바이오마커들을 위한 평균 배수-변화 수치들의 상관성을 나타낸 것이다.
표 4는 집단 1 시료들 (11명 AD 및 20명 NC)의 소집합을 사용한 TaqMan qPCR로부터 유래한 상대적 Ct 수치 데이타를 나타낸 것이다. 데이타는 AD 및 NC 환자들 간을 구분하도록 후보 miRNA 바이오마커들을 위한 서명 양식들을 생성하는 데 사용되었다.
표 5는 프리시젼메드사로부터 획득된 바와 같은 진단, 연령, 성별, MMSE 점수들 및 방문 횟수들을 포함하는 집단 2에서 환자들의 입수가능한 세부사항들을 나타낸 것이다.
표 6은 TaqMan RT-qPCR miRNA 검정법을 사용한 집단 1 및 집단 2 간의 후보 miRNA 바이오마커들의 (평균 대조군 수치들로 정상화됨) 평균 배수-변화 수치들의 상관성을 나타낸 것이다.
표 7은 집단 2 시료들 (20명 AD 및 17명 NC)을 사용한 TaqMan qPCR로부터 유래한 상대적 Ct 수치 데이타를 나타낸 것이다. 이는 집단 1 데이타로부터 유래한 서명들을 사용하여 AD 및 NC 환자 상태를 예측하도록 알고리즘을 위한 입력으로서 사용되었다.
표 8은 알츠하이머병을 나타내는 후보 miRNA 바이오마커 서명들을 나타낸 것이다.
표 9는 > 75%의 정확성을 가진 miRNA 바이오마커 서명들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)을 나타낸 것이다.
표 10은 예측을 위해 집단 2 시료들을 사용한 개별적 miRNA들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)을 나타낸 것이다.
표 11은 예측을 위해 집단 2 시료들을 사용한 개별적 miRNA들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)을 나타낸 것이다.
본 발명은 다음의 실시예들에 의해 또한 설명되고, 이는 제한으로서 참작되지 않아야 한다. 본 출원의 전체에 걸쳐서 인용된 모든 참고문헌들, 특허들 및 공고된 특허출원들의 전체 내용들은 그들의 전부가 참고문헌으로 본 명세서에 의해 통합된다.
실시예들
실시예 1: 후보 miRNA 바이오마커들의 확인 및 검증
본 연구의 목적은 인간 혈액의 혈장 분획으로부터 miRNA 프로파일들을 생성하고, 알츠하이머병 (AD)으로 진단된 환자들 및 정상 대조군들 (NC) 간에 miRNA 함량 및 발현 수준에서 유의한 차이들이 존재하는지 여부를 결정하는 것이었다.
인간 혈장 시료들은 프리시젼메드사 (PrecisionMed, Inc., Solano Beach, CA-USA)로부터 구입하였다. 집단 1은 11명의 AD 환자들, 9명의 경미한 인지 손상 (MCI) 환자들, 및 20명의 NC 환자들로부터 얻은 시료들을 포함하였다. 집단 1의 환자들을 위한 연령, 성별, 진단, 및 간이-정신 상태 검사 (MMSE) 점수들은 표 1에서 제공된다. 전체 RNA가 혈장 시료들 (1 mL)로부터 추출되었고, 내부-스파이크 합성 miRNA들 (Ath-159a 및 Neg-A)이 하기에 기술된 바와 같이, 추출 효율 및 정상화를 위한 대조군에 첨가되었다.
각각의 시료는 다음으로 하기에 기술된 바와 같이 n카운터 miRNA 발현 검정법 (나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)을 세 벌로 사용하여 고-처리량 발현 프로파일화에 사용되었다. 정상화 및 기저선 교정 이후에, 최종 선형 계수들이 AD/MCI 및 NC 시료들 둘 다를 위해 평균 되었고, 배수 변화 수치들이 결정되었다. AD/MCI 및 NC 시료들에서 평균 발현 수치들 간의 적어도 1.5배 차이를 가지는 것들, 및 > 200의 평균 정상화된 계수들을 가지는 후보 miRNA들이 선별되었다. miRNA 106a (Hsa-miR-106a)는 모든 AD/MCI 및 NC 시료들을 거쳐서 최소의 변화를 보였던 잠재적인 내인성 대조군으로서 확인되었다.
적어도 > 100의 (기저선 초과로 유의하게 발현되는 것으로 고려됨) 평균 발현 계수를 가지는 227개의 miRNA들이 존재하였다. 227개의 miRNA들 중에서, 우리는 적어도 1.5배의 차이를 가지고, 평균 > 200의 정상화된 선형 계수들을 가지는 13개의 miRNA들을 확인하였다 (도 1A 및 도 1B). 이들은 hsa-let-7d, hsa-let-7g, hsa-miR-15b, hsa-miR-126, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-191, hsa-miR-301a, hsa-miR-453, hsa-miR-545, hsa-miR-563, hsa-miR-600, hsa-miR-1274a 및 hsa-miR-1975을 포함하였다.
고-처리량 나노스트링 플랫폼을 사용하여 확인된 후보 miRNA 바이오마커들은 다음으로 스템-루프 TaqMan RT-qPCR miRNA 검정법 (라이프 테크놀로지사)을 사용하여 검정되었다. 모두 40명의 집단 1 시료들을 위한 전체 RNA의 1 : 10 희석물이 만들어졌고, TaqMan 검정법이 하기에 기술된 바와 같이 각각의 시료 상에서 수행되었다. Ath-159a (내부-스파이크) 및 miR-106a (내인성 miRNA) 수치들은 △△Ct 분석 방법 (라이프 테크놀로지사)를 사용하여 전체 시료들에 걸쳐서 수치들을 정상화하는 데 사용되었다. 테스트된 13개의 miRNA들 중에서, 6개 miRNA들의 존재가 입증될 수 없었다. 이들은 hsa-miR-126, hsa-miR-453, hsa-miR-563, hsa-miR-600, hsa-miR-1274a 및 hsa-miR-1975를 포함하였다.
남은 7개의 miRNA들 (miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a 및 miR-545)은 나노스트링에 의해 및 TaqMan에 의해 기록된 평균 배수 변화들 간의 매우 강한 상관성을 보여주었다 (도 2, 표 3). miRNA 서열들 및 miRBase 기탁번호들은 표 2에 제공된다. 예를 들면, miR-191은 나노스트링 분석에 따라 AD 시료들에서 ~ 3.1배로 저하-조절되었던 한편, TaqMan 분석에 의해 ~ 3.7배 저하-조절되는 것으로 밝혀졌다 (표 3 참조). 이러한 밀접한 경향성은 모든 남아있는 miRNA들 (miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a 및 miR-545)을 통하여 관찰되었다. 모든 배수 변화 수치들은 p-수치 < 0.005를 가졌다.
TaqMan 분석에 의해 입증될 수 없었던 모든 후보 miRNA들 (miR-126 제외)은 500개 이하의 정상화된 선형 계수들을 (나노스트링에 의해 결정된 바와 같음) 가졌다. 각각의 검증된 miRNA들의 평균 계수들은 한편으로 3,000개 이상이었다. 이것은 나노스트링 실험들을 위한 더 높은 역치를 설정하는 것이 위-양성 후보들이 수를 감소시키는 데 사용될 수 있는 점을 제시한다.
재료들 및 방법들
전체 RNA 추출
전체 RNA는 변형된 miRvana PARIS 프로토콜 (라이프 테크놀로지사; AM 1556)를 기술한 바와 같이 사용하여 추출되었다 (Mitchell, P.S. et al., PNAS. 2008 Jul 29; 105(30): 10513-8). 1 mL의 인간 혈장이 동등한 양의 2× 변성 완충용액에 첨가되었고 다음으로 10 μL의 0.05 μM Ath-159a 및 40 pM의 Neg-A (UUGUGGCGAGCGGAAUGGAAU) (정상화 및 추출 효율 대조군으로 사용되는 합성 miRNA들)로 스파이크되었다. 페놀 추출은 두 번 수행되었고, 전체 RNA가 프로토콜 추천(AM1556)에 따라서 70 μL의 물로 최종적으로 용출되었다 (AM1556).
miRNA 들의 고-처리량 발현 프로파일화
45 μL의 정제된 전체 RNA가 9 μL로 농축되었고 n카운터 miRNA 발현 검정법 (나노스트링 테크놀로지사, WA-USA)을 위한 주형으로서 사용되었다. 시료 제조는 추천된 바와 같이 (나노스트링; C-0009-02) 3 μL의 농축된 전체 RNA를 모든 시료들의 시작 양으로서 세 벌로 사용하여 설정되었다. 회수된 전체 RNA의 양은 나노드롭 (Nanodrop)과 같은 표준 스펙트럼들-기초 기구들을 사용하여 신뢰가능하게 검출되기에 충분하였기 때문에, 3 μL의 농축된 전체 RNA가 모든 나노스트링 기초한 검정법들을 위한 시작 물질로서 사용되는 (Mitchell, P.S. et al., PNAS. 2008년 7월 29일;105(30): 10513-8에서도 역시 사용됨) 동일한 부피 접근법이 채택되었다. 65℃에서 16시간 동안 밤샘 혼성화를 위하여 반응들이 설정되었다. 다음날, 시료들은 제조사의 프로토콜에 의해 추천된 바와 같이 n카운터 프렙 스테이션 (나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA, v.20081003)을 통해 가공되었고, n카운터 디지탈 분석기 (나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA, v.20081009)를 통한 가공이 이어졌다. 분석기 해상도는 600 FOV로 설정되었다. 데이타가 다운로딩 되었고, 추천된 바와 같이 (n카운터 데이타 분석 지침들) 엑셀 상에서 분석되었다. 간략하게, 데이타는 처음에 제공된 양성 검정 대조군들을 사용하여 레인마다 변화를 위해 정상화되었다. 이것은 가장 높은 100개의 miRNA 발현체 (expresser)들의 계수들을 사용하여 전반적 평균 정상화로 이어졌다. 각각의 정상화된 수치는 다음으로 이것이 해당 레인에 대해 기록된 기저선 신호의 평균보다 적어도 2 SD들보다 더 높았던 점을 입증하도록 검토되었다. 해당 미만의 임의의 수치는 제로로 전환되었다. 배수 변화 수치들은 개별적 miRNA들을 위한 모든 AD/MCI 및 NC 시료 발현 수치들의 평균을 취하여 계산되었다.
TaqMan qPCR 을 사용한 후보 바이오마커 miRNA 들의 검증
고-처리량 나노스트링 플랫폼을 사용하여 확인된 후보 miRNA 바이오마커들은 다음으로 스템-루프 TaqMan RT-qPCR miRNA 검정법 (라이프 테크놀로지사)을 사용하여 검증되었다. 간략하게, RT 프라이머 풀은 특이적 miRNA RT 프라이머들 (miR-301a, miR-1975, miR-191, miR-15b, miR-126, let-7g, let-7d, miR-545, miR-1274, miR-142-3p, miR-600, miR-453, miR-563, miR-106a 및 ath-159a)로 1× TE에서 0.05×의 최종 농도로 제작되었다. miRNA-특이적 프라이머들 및 탐침들은 라이프 테크놀로지사로부터 구입되었다. 6 μL의 RT 프라이머 풀, 0.3 μL의 dNTPS (100 mM), 3 μL의 멀티스크라이브 RT (50 U/μL), 1.5 μL의 10× 역전사 완충용액 및 0.2 μL의 RNAseIN (20 U/μL) 및 물을 포함하는 15 μL의 RT 반응이 설정되었다. 모든 역전사 성분들은 miRNA RT 키트 (라이프 테크놀로지사; # 4366596)에 포함되어 있었다. 3 μL의 전체 RNA (1 : 10 희석)는 각각의 시료를 위해 주형으로서 첨가되었고 반응은 얼음 위에서 5분 동안 배양되었으며, 효소 불활성화를 위해 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분이 이어졌다. 반응물은 다음으로 4℃에서 보관되었다. 전-증폭 프라이머들의 두 번째 풀은 다음으로 1× TE에서 0.2×의 최종 농도로 혼합된 동일한 검정법을 위한 각각의 PCR 프라이머 탐침 (20×)으로 제작되었다. 2× 전-증폭 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지사; #4391128), 3.75 μL의 맞춤 전-증폭 프라이머 풀 및 물을 포함하는 전-증폭 반응이 설정되었다 (반응 부피 22.5 μL로 만들어짐). 2.5 μL의 RT 산물이 다음으로 첨가되었고 전-증폭 프로그램을 통하여 순환되었다 [95℃에서 10분, 55℃에서 2분, 및 72℃에서 2분, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 4분의 15회 순환들로 이어짐]. 이것은 99.9℃에서 10분 동안 배양으로 이어졌고, 다음으로 반응은 175 μL의 0.1× TE (pH 8.0)를 첨가하여 희석되었으며 역전에 의해 혼합되었다. 2 μL의 전-증폭 산물은 다음으로 ABI7500 기구 위의 표준 프로토콜 (라이프 테크놀로지사; P/N 4364031-Rev D)을 이어서 개별적 표준 TaqMan qPCR 반응들 (두 벌)에 사용되었다. Ct 수치들은 일정한 분석을 위한 단일한 연구 (SDS 2.4, 라이프 테크놀로지사)에서 모든 반응들의 경우 0.2의 매뉴얼 역치 및 자동 기저선을 설정하여 계산되었다.
△△Ct 방법 (라이프 테크놀로지사, Livak KJ, Schmittgen TD, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-△△C(T)도 역시 참조)은 내인성 대조군으로서 사용된 hsa-miR-106a 및 ath-159a 둘 다의 기하학적 평균과 함께 분석에 사용되었고, NC 환자들의 평균 상대적 Ct 수치들은 모든 개별적 수치들을 산정하는 데 사용되었다. 선형 배수 변화들은 다음으로 프리즘 (그래프패드 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Prism Software), San Diego, CA-USA)을 사용하여 계산되고 분산 좌표들 상에 좌표 표시되었다 (주석: 집단 2를 위한 서명 확인 (실시예 2 참조)은 상기에 기술된 바와 같이 정확하게 시행되었지만, RT 및 전-증폭 프라이머 도구들은 단지 서명 및 정상화 대조군 특이적 프라이머들 (miR-301a, miR-191, miR-15b, let-7g, let-7d, miR-545, miR-142-3p, miR-106a 및 ath-159a)을 사용하여 제조되었다. miRNA-특이적 프라이머들 및 탐침들은 어플라이드 바이오시스템사로부터 카탈로그 번호들 제 000464호 (miR-142-3p), 제 001289호 (miR-545), 제 000380호 (let-7d), 제 000490호 (miR-191), 제 000528호 (miR-301a), 제 000383호 (let-7g), 제 000390호 (miR-15b), 제 000578호 (miR-106a), 및 제 000338호 (ath-159a) 하로 구입하였다.
실시예 2: 서명 생성 및 예측적 모델 제작
집단 1에서 AD 및 NC 시료들 간에 유의하게 서로 다른 발현을 가지는 것으로서 확인되고 검증된 miRNA들은 (배수 변화 > 1.5, p 수치 < 0.005) 예측적 모델 제작을 위해 선택되었다. 집단 1에서 각각의 AD (n = 11) 및 NC (n = 20) 시료들로부터 얻은 7개의 miRNA들 (let-7d, miR-191, miR-301a, miR-545, let-7g, miR-15b, miR-142-3p)의 발현 수치들은 서명 제작 모델을 위한 입력 정보로 사용되었다. 상세하게, 집단 1의 TaqMan qPCR로부터 획득된 각각의 miRNA들을 위한 상대적 Ct 수치들 (개별적 miRNA들의 관찰된 Ct 수치들 빼기 Ath-159a 및 miR-106a Ct 수치들의 기하학적 평균)은 NC 환자들로부터 AD를 분리하도록 선형 분류인자를 제작하는 데 사용되었다 (상대적 Ct 수치들은 표 4에 나타냄). 7개의 miRNA들의 모든 가능한 제로가 아닌 소집합들 (127개의 서명들)은 선형 판별식 분석 (LDA)에 사용되었다. LDA을 위해, MASS 소프트웨어 패키지가 R 버전 2.12.2의 윈도우 실행으로 사용되었다 (Venables, W. N. & Ripley, B. D. (2002) Modern Applied Statistics with S. 제 4판. Springer, New York. ISBN 0-387-95457-0). 패키지의 소스 암호는 http://cran.r-project.org/web/packages/MASS/index.html에서 입수가능하다. 다른 적합한 소프트웨어 패키지들이 사용되거나 개발될 수 있다. 곡선-아래-영역 (AUC) 수들도 역시 소프트웨어 패키지 "검증 (verification)" (attp://cran.r-project.org/web/packages/verification/index.html에서 입수가능한 소스 암호; Mason, S.J. and N.E. Graham. "Areas beneath the relative operating characteristics (ROC) and relative operating levels (ROL) curves: Statistical significance and interpretation", Q. J. R. Meteorol. Soc. 30 (1982) 291-303도 역시 참조)을 사용하여 R (버전 2.12.2)에서 계산되었다. 다른 적합한 소프트웨어 패키지들이 사용되거나 개발될 수 있다.
시료 코드 및 예측 정확도, 민감도, 특이도 및 AUC 수들을 계산하는 데 사용된 입력 파일들의 설명은 하기에 설명된다. 이러한 암호는 미지의 시료들을 3개의 miRNA들 ("miR-545", "let-7g", "miR-15b")의 대표적인 서명을 사용하여 AD 또는 정상으로서 분류하는 방식을 보여준다. 7개 검증된 miRNA들의 임의의 조합을 기초로 한 분류화를 수행하기 위한 암호는 유사할 것이고, 7개 검증된 miRNA들의 임의의 조합을 기초로 한 서명들이 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 7개 검증된 miRNA들로부터 선택된 임의의 조합을 위해 또는 개별적 miRNA들을 위해 우리는 집단 1로부터 획득된 훈련 데이타를 기초로 한 LDA 모델의 계수들 (coefficient)을 결정하여 선형 판별식 모델을 작성할 수 있다. 일단 우리가 집단 1을 기초로 한 모델을 결정하였던 경우라면, 우리는 임의의 새로운 시료의 경우 시료가 획득되었던 개인이 AD 개인, 또는 정상 개인인지 여부를 예측할 수 있다. 새로운 시료를 위한 예측을 하기 위하여, 우리는 서명에서 각각의 개별적 miRNA에 대한 miRNA 발현 수준들을 결정하는 것이 필요하다. 이들 수치들을 기초로 하여, 모델은 새로운 시료가 AD를 가진 개인으로부터 나오는 ("사후") 확률을 되돌려줄 것이다. 이러한 확률의 컷-오프 수치는 모델의 민감도 및 특이도를 결정한다. 우리의 예측들을 위해, 우리는 0.5의 역치에서 정확도, 민감도 및 특이도를 결정하였다 (즉, AD일 시료의 확률이 0.5 이상인 경우라면, 우리의 모델은 이를 AD로서 분류하였다).
대표적인 입력 파일들은 train.txt, validation.txt, train_an.txt 및 validation_an.txt의 형태로 존재할 수 있다. "train.txt"는 매트릭스의 형태로 집단 1의 발현 프로파일을 포함하는 파일이고, 행들은 시료들이고 열들은 miRNA들이다. 첫 번째 행은 miRNA들의 명칭들을 포함하고 첫 번째 열들은 시료들의 명칭을 포함한다. "train_an.txt" 파일은 시료들의 주해를 포함한다. 2개의 컬럼들이 존재하고, 첫 번째 열은 시료들의 명칭을 포함하고 두 번째 열은 시료들의 주해를 포함한다 (본 경우에 "정상" 및 "AD"). 파일들 "validation.txt" 및 "validation_an.txt"는 정확하게 동일한 포맷으로 집단 2를 위한 데이타 및 주해를 포함한다. 변수들 예측$클래스 (prediction$class) 및 예측$사후 (prediction$posteri)는 집단 2로부터 얻은 시료들의 예측된 주해 및 해당하는 확률을 포함한다.
예측 정확도, 민감도, 특이도 및 AUC 수들을 계산하는 데 사용될 수 있는 대표적인 암호는 다음과 같다:
Figure 112014007171218-pct00001
7개 검증된 miRNA들의 임의의 조합을 기초로 한 분류화를 수행하기 위하여, 상기에 나타낸 것과 유사한 시료 코드가 사용될 수 있다. 대안적으로, 예측에 또는 데이타 집합으로부터 얻은 예측 정확도, 민감도, 특이도 및 AUC를 계산하는 데 유용한 다른 소프트웨어 암호가 상기에 기술된 시료 코드를 대신하여 사용될 수 있다.
실시예 3: miRNA 바이오마커들은 개체들의 상태를 정상으로서 또는 알츠하이머병을 가진 것으로서 예측한다.
실시예 2에서 기술된 바와 같이 7개의 검증된 miRNA들 (let-7d, let-7g, miR-15b, miR-142-3p, miR-191, miR-301a 및 miR-545)은 프리시젼메드사로부터 획득된 20명의 AD 및 17명의 NC 환자들을 포함하는 두 번째 집단 ("집단 2")으로부터 얻은 인간 혈장 시료들의 분류화 결과들을 기초로 하여 평가되었다. 집단 2의 환자들을 위한 연령, 성별, 진단, 및 MMSE 점수들은 표 5에서 제공된다. 예측적 모델의 결과는 정확도, 민감도, 특이도 및 곡선 아래 영역 (AUC) 수들을 기초로 하여 평가되었다.
전체 RNA 추출은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 각각의 집단 1 시료로부터 얻은 500 μL의 혈장만을 사용하여 수행되었고, TaqMan RT-qPCR 분석이 어어졌다. 우리는 서명 miRNA들이 매우 밀접하게 복제되었기 때문에 그리고 탁월한 p-수치들로 두 개 집단들 간의 평균 배수 변화들과의 유의한 상관성을 달성하였다 (도 3, 표 6).
각각의 집단 2 시료들로부터 얻은 각각의 후보 miRNA들 (let-7d, let-7g, miR-15b, miR-142-3p, miR-191, miR-301a 및 miR-545)을 위한 상대적 Ct 수치들 (개별적 miRNA들의 관찰된 Ct 수치들 빼기 Ath-159a 및 miR-106a Ct 수치들의 기하학적 평균)은 다음으로 상기에 기술된 바와 같은 집단 1 데이타를 기초로 하여 개발되었던 서명 miRNA 예측 알고리즘을 위한 입력정보로서 사용되었다 (표 7). 모든 잠재적 서명들은 표 8에서 나열된다. > 75% 정확도를 가진 서명들은 표 9에 나타내고, 한편으로 > 89% 정확도를 가진 서명들은 표 10에 나타낸다. 전반적인 서명 정확도는 잘못 분류된 시료들 (AD 또는 NC)의 분획으로서 계산되었다. 민감도는 진정한 양성들을 확인하는 예측적 모델들의 능력을 특징으로 하고, 본 연구에서 AD 시료들의 전체 수로 분할된 정확하게 확인된 AD 시료들의 수로서 계산되었다. 한편으로, 특이도는 NC 시료들의 전체 수로 분할된 정확하게 확인된 NC 시료들 (진정한 음성들)의 수이었다. AUC는 수여자 작동 특징 (ROC) 곡선 아래의 영역으로서 계산되었고, 이는 민감도 대비 위양성율 (1-특이도)의 좌표이다. ROC 곡선은 예측 확률을 위한 역치를 변화시켜서 생성되었다.
miR-545, let-7g 및 miR-15b의 조합은 가장 높은 특이도 (94.1%), 민감도 (95%) 및 AUC (0.953)를 유도하였다. 서명 조합들은 단지 2개 miRNA들 (예로, miR-15b 및 miR-545)로부터 7개의 miRNA들 (예로, miR-191, miR-301a, miR-545, let-7g, let-7d, miR-15b 및 miR-142-3p)까지의 범위를 가졌다 (표 8A 내지 표 8C 참조). 각각의 서명은 후보 miRNA 바이오마커들의 서로 다른 조합들을 가졌고, 변화하는 특이도 및 민감도를 유도하였다 (표 9A 내지 표 9B 참조). 또한, 우리는 개별적 miRNA들을 위한 서명 정확도를 역시 조사하였다 (표 11). 서명 정확도는 조합 서명들과 비교하여 개별적 miRNA들의 경우에 더 낮았다. 특이도의 견지에서 최고의 독립형 miRNA들은 둘 다 100% 특이도를 가진 miR-142-3p 및 miR-301이었다. 그러나 miR-142-3p는 miR-301a의 경우 25%의 민감도와 비교 시 더 나은 민감도 (65%)를 가졌다. Let-7g 및 miR-191는 95%로 최고의 민감도를 가졌지만, miR-191만이 76%의 강화된 특이도를 가졌다. miR-191, miR-15b 및 let-7d는 독립형 miRNA들의 최고의 전반적 정확도를 가졌다.
표 1은 집단 1 환자 시료들을 나타낸다.
시료 ID 진단 MMSE 방문횟수 연령 성별
1 알츠하이머병 (AD) 17 3회 83 M
2 알츠하이머병 (AD) 17 3회 80 M
3 알츠하이머병 (AD) 22 3회 91 M
4 알츠하이머병 (AD) 16 3회 78 F
5 알츠하이머병 (AD) 23 2회 74 M
6 경미한 인지 손상 (MCI) 23 1회 82 F
7 경미한 인지 손상 (MCI) 23 2회 80 F
8 경미한 인지 손상 (MCI) 27 2회 79 F
9 알츠하이머병 (AD) 24 2회 88 M
10 알츠하이머병 (AD) 18 2회 76 F
11 경미한 인지 손상 (MCI) 26 1회 63 F
12 알츠하이머병 (AD) 14 2회 78 F
13 경미한 인지 손상 (MCI) 23 2회 79 F
14 알츠하이머병 (AD) 15 2회 74 M
15 경미한 인지 손상 (MCI) 25 1회 80 M
16 경미한 인지 손상 (MCI) 26 1회 74 F
17 경미한 인지 손상 (MCI) 26 1회 84 M
18 경미한 인지 손상 (MCI) 23 1회 76 M
19 알츠하이머병 (AD) 15 2회 72 F
20 알츠하이머병 (AD) 16 2회 82 F
21 정상 대조군 (NC) 30 4회 60 F
22 정상 대조군 (NC) 30 3회 71 M
23 정상 대조군 (NC) 27 4회 60 M
24 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 63 F
25 정상 대조군 (NC) 30.0 4회 68 F
26 정상 대조군 (NC) 30.0 1회 60 M
27 정상 대조군 (NC) 30.0 4회 64 M
28 정상 대조군 (NC) 27.0 4회 77 M
29 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 69 M
30 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 60 F
31 정상 대조군 (NC) 30.0 1회 72 M
32 정상 대조군 (NC) 30.0 1회 66 F
33 정상 대조군 (NC) 30.0 3회 71 M
34 정상 대조군 (NC) 29.0 2회 60 F
35 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 61 M
36 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 69 M
37 정상 대조군 (NC) 30.0 2회 74 F
38 정상 대조군 (NC) 30.0 1회 71 F
39 정상 대조군 (NC) 27.0 1회 63 M
40 정상 대조군 (NC) 30.0 1회 74 F
표 2는 miRNA 서열들 및 기탁번호들을 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00002
표 3은 집단 1 시료들 (20명 AD 또는 MCI 및 20명 대조군)의 경우 나노스트링 및 TaqMan 플랫폼들 간의 후보 miRNA 바이오마커들을 위한 평균 배수 변화 상관성을 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00003
표 4는 집단 1 시료들 (11명 AD 및 20명 NC)을 사용한 TaqMan qPCR로부터 유래한 상대적 Ct 수치들을 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00004
표 5는 집단 1 환자 시료들을 나타낸다.
시료 ID 진단 MMSE 방문 횟수 연령 성별
1 알츠하이머병 (AD) 14 1 78 F
2 알츠하이머병 (AD) 15 1 76 M
3 알츠하이머병 (AD) 17 2 75 M
4 알츠하이머병 (AD) 13 2 76 F
5 알츠하이머병 (AD) 22 2 61 M
6 알츠하이머병 (AD) 18 2 70 F
7 알츠하이머병 (AD) 9 2 77 F
8 알츠하이머병 (AD) 21 1 66 F
9 알츠하이머병 (AD) 18 2 67 F
10 알츠하이머병 (AD) 15 1 70 F
11 알츠하이머병 (AD) 6 2 71 F
12 알츠하이머병 (AD) 18 2 74 M
13 알츠하이머병 (AD) 17 1 72 M
14 알츠하이머병 (AD) 18 1 69 F
15 알츠하이머병 (AD) 18 1 76 M
16 알츠하이머병 (AD) 15 1 62 M
17 알츠하이머병 (AD) 20 1 63 M
18 알츠하이머병 (AD) 22 1 59 F
19 알츠하이머병 (AD) 18 1 62 M
20 정상 대조군 (NC) 30 2 62 M
21 정상 대조군 (NC) 30 2 63 F
22 정상 대조군 (NC) 30 2 66 M
23 정상 대조군 (NC) 30 2 64 F
24 정상 대조군 (NC) 29 2 62 F
25 정상 대조군 (NC) 30 2 75 F
26 정상 대조군 (NC) 24 2 75 M
27 정상 대조군 (NC) 30 2 63 F
28 정상 대조군 (NC) 30 2 60 F
29 정상 대조군 (NC) 30 2 69 M
30 정상 대조군 (NC) 30 2 68 M
31 정상 대조군 (NC) 30 2 66 M
32 정상 대조군 (NC) 30 1 64 F
33 정상 대조군 (NC) 30 1 60 F
34 정상 대조군 (NC) 30 1 63 M
35 정상 대조군 (NC) 29 1 67 M
36 정상 대조군 (NC) 30 1 68 M
37 정상 대조군 (NC) 16 2 62 M
Figure 112014007171218-pct00005
표 7은 집단 2 시료들 (20명 AD 및 17명 NC)을 사용한 TaqMan qPCR로부터 유래한 상대적 Ct 수치들을 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00006
표 8a는 후보 miRNA 바이오마커 서명들을 나타낸다. 표 8b는 후보 miRNA 바이오마커 서명들을 나타낸다. 표 8c는 후보 miRNA 바이오마커 서명들을 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00007
Figure 112014007171218-pct00008
Figure 112014007171218-pct00009
Figure 112014007171218-pct00010
Figure 112014007171218-pct00011
Figure 112014007171218-pct00012
표 9a는 예측을 위해 집단 2 시료들을 사용한 > 75%의 정확도를 가지는 miRNA 서명들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)를 나타낸다. 표 9b는 예측을 위해 집단 2 시료들을 사용한 > 75%의 정확도를 가지는 miRNA 서명들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)를 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00013
Figure 112014007171218-pct00014
표 10은 예측을 위해 집단 2 시료들을 사용한 최고 8개의 miRNA 서명 조합들을 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역)를 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00015
도 11은 예측을 위해 집단 2 시료들 (20명 AD 및 17명 대조군)을 개별적으로 사용한 각각의 후보 miRNA를 위한 정확도, 특이도, 민감도 및 AUC (곡선 아래 영역, 1의 최대 가능한 수치)를 나타낸다.
Figure 112014007171218-pct00016
SEQUENCE LISTING <110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD. <120> MICRORNA BIOMARKERS INDICATIVE OF ALZHEIMER'S DISEASE <130> ESN-122PC <140> PCT/US2012/044202 <141> 2012-06-26 <150> 61/501,720 <151> 2011-06-27 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 uuguggcgag cggaauggaa u 21 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ucagcaaaca uuuauugugu gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 agagguagua gguugcauag uu 22 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 caacggaauc ccaaaagcag cug 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagugcaaua guauugucaa agc 23 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 uuuggauuga agggagcucu a 21

Claims (48)

  1. 대상에서 알츠하이머병 또는 경미한 인지 손상(MCI)의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    대상으로부터의 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 시료에서 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 시료는 뇌척수액(CSF)이 아니고, 하나 이상의 miRNA는 miR-15b, miR-191, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 단계를 포함하고,
    적합한 대조군과 비교하여 결정되는 정상 대상에서의 것에 대한 상기 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 상기 대상에서 알츠하이머병 또는 MCI를 나타내는 것인, 방법.
  2. 0 내지 26의 MMSE 점수를 가진 대상에서 인지 손상의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    대상으로부터의 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 시료에서 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 시료는 뇌척수액(CSF)이 아니고, 하나 이상의 miRNA는 miR-15b, miR-191, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 단계를 포함하고,
    적합한 대조군과 비교하여 결정되는 정상 대상에서의 것에 대한 상기 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 상기 대상에서 인지 손상을 나타내는 것인, 방법.
  3. 21 내지 26의 MMSE 점수를 가진 대상에서 인지 손상의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    대상으로부터의 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 시료에서 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 시료는 뇌척수액(CSF)이 아니고, 하나 이상의 miRNA는 miR-15b, miR-191, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 단계를 포함하고,
    적합한 대조군과 비교하여 결정되는 정상 대상에서의 것에 대한 상기 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 상기 대상에서 인지 손상을 나타내는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서 miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g 및 Let-7d로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 miRNA의 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 정상 대상에서의 것에 대한 상기 miRNA의 수준의 차이가 감소인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서 miR-301a; miR-545; 및 miR-301a 및 miR-545로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 miRNA의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서 적어도 2개의 miRNA의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서 적어도 3개의 miRNA의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-545, Let-7g 및 miR-15b인 방법.
  9. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-15b 및 miR-545인 방법.
  10. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-301a, miR-545, Let-7g 및 miR-15b인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA는 miR-191 및 miR-15b인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA는 Let-7g 및 miR-15b인 방법.
  13. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-191, miR-301a 및 miR-545인 방법.
  14. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-301a, Let-7g 및 miR-15b인 방법.
  15. 제5항에 있어서, miRNA는 miR-191, miR-301a, miR-545 및 miR-15b인 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 대상으로부터의 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 시료에서 2개 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, miRNA는
    (a) miR-545, Let-7g 및 miR-15b,
    (b) miR-15b 및 miR-545,
    (c) miR-301a, miR-545, Let-7g 및 miR-15b,
    (d) miR-191 및 miR-15b,
    (e) Let-7g 및 miR-15b,
    (f) miR-191, miR-301a 및 miR-545,
    (g) miR-301a, Let-7g 및 miR-15b, 및
    (h) miR-191, miR-301a, miR-545, 및 miR-15b
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (ii) 상기 시료에서 2개 이상의 miRNA의 수준을 정상 대상 및 알츠하이머병 또는 MCI를 갖는 대상에 존재하는 동일한 miRNA의 수준을 나타내는 데이타 집합과 비교하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 대조군과 비교한 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 소프트웨어 분류화 알고리즘을 실행하여 결정되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 혈액, 림프, 소변 및 타액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 무-세포 시료인 방법.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 미세소포가 없는 시료인 방법.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 혈장인 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 혈청인 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머병의 진단을 위한 정보를 제공하는 하나 이상의 추가적인 검사를 수행하는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 추가적인 검사는 간이-정신 상태 검사(MMSE), 간이-인지 검사, ADAS-인지 검사 및 시계-그리기 검사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 추가적인 검사는 알츠하이머병에 대한 하나 이상의 추가적인 바이오마커를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA의 수준이 miRNA와 특이적으로 혼성화하는 제제를 사용하여 검출되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA의 수준이 증폭, 혼성화 또는 서열결정 방법을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, miRNA의 수준이 정량적 PCR을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  29. 대상에서 알츠하이머병의 경과를 감시하는 방법으로서,
    (a) 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 대상으로부터의 첫 번째 시료에서 miR-15b, miR-191, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 시료가 뇌척수액(CSF)이 아닌 것인 단계;
    (b) 순환하는 세포외 miRNA를 함유하는 상기 대상으로부터의 두 번째 시료에서 상기 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하는 단계로서, 시료는 뇌척수액(CSF)이 아니고, 상기 두 번째 시료는 상기 첫 번째 시료 이후에 획득된 것인 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 단계 (b)에서 결정된 수준을 비교하는 단계로서, 단계 (a)에서 결정된 상기 수준과 비교하여 단계 (b)에서 결정된 상기 수준의 감소가 알츠하이머병의 진행을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 시료에서 하나 이상의 추가적인 miRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고, 추가적인 miRNA는 miR-301a; miR-545; 및 miR-301a 및 miR-545로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 대상에서 알츠하이머병 또는 경미한 인지 손상(MCI)을 진단하기 위한 키트로서,
    (i) 대상으로부터의 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 하나 이상의 miRNA의 존재를 선택적으로 검출하는 제제로서, 하나 이상의 miRNA는 miR-15b, miR-191, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 제제; 및
    (ii) 순환하는 miRNA를 함유하는 시료에서 상기 하나 이상의 miRNA의 수준을 결정하기 위한 설명서로서, 상기 시료가 뇌척수액이 아니고, 적합한 대조군과 비교하여 결정되는 바와 같은 정상 대상에서의 것에 대한 상기 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 상기 대상에서 알츠하이머병 또는 MCI를 나타내는 것인 설명서
    를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병 또는 MCI를 진단하기 위한 키트.
  32. 제31항에 있어서, 시료에서 하나 이상의 추가적인 miRNA의 존재를 선택적으로 검출하는 제제를 더 포함하고, 상기 추가적인 miRNA는 miR-301a; miR-545; 및 miR-301a 및 miR-545로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 키트.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 제제는 miRNA와 특이적으로 혼성화하는 것인 키트.
  34. 제31항에 있어서, 시료는 혈액, 림프, 소변 및 타액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 키트.
  35. 제34항에 있어서, 시료는 무-세포 시료인 키트.
  36. 제35항에 있어서, 시료는 미세소포가 없는 시료인 키트.
  37. 제5항에 있어서, 적합한 대조군과 비교한 하나 이상의 miRNA의 수준의 차이가 소프트웨어 분류화 알고리즘을 실행하여 결정되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 대상에서의 것에 대한 miRNA의 수준의 차이가 감소인 방법.
  39. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 포유동물인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
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