ES2580379T3 - Biomarcadores de microARN indicativos de la enfermedad de Alzheimer - Google Patents
Biomarcadores de microARN indicativos de la enfermedad de Alzheimer Download PDFInfo
- Publication number
- ES2580379T3 ES2580379T3 ES12750628.5T ES12750628T ES2580379T3 ES 2580379 T3 ES2580379 T3 ES 2580379T3 ES 12750628 T ES12750628 T ES 12750628T ES 2580379 T3 ES2580379 T3 ES 2580379T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mirna
- mir
- sample
- disease
- alzheimer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title abstract description 26
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title description 27
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 abstract description 143
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 56
- 108091031326 miR-15b stem-loop Proteins 0.000 abstract description 15
- 108091033433 MiR-191 Proteins 0.000 abstract description 10
- 108091007427 let-7g Proteins 0.000 abstract description 10
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 abstract description 8
- 108091033753 let-7d stem-loop Proteins 0.000 abstract description 7
- 108091079658 miR-142-1 stem-loop Proteins 0.000 abstract description 7
- 108091071830 miR-142-2 stem-loop Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 abstract 3
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 abstract 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 89
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 13
- 108091040490 miR-545 stem-loop Proteins 0.000 description 13
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 108091029203 miR-301 stem-loop Proteins 0.000 description 11
- 108091026505 miR-301a stem-loop Proteins 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000013145 classification model Methods 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 4
- 108091064157 miR-106a stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000007635 classification algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 108091043994 let-7g stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091053972 let-7g-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091024867 let-7g-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 235000009027 Amelanchier alnifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000068687 Amelanchier alnifolia Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108091028066 Mir-126 Proteins 0.000 description 1
- 238000011495 NanoString analysis Methods 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010060854 Post lumbar puncture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091060293 miR-453 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091084213 miR-563 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091023451 miR-600 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000010238 partial least squares regression Methods 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012628 principal component regression Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Un método para facilitar el diagnóstico del deterioro cognitivo debido a la enfermedad de Alzheimer o a deterioro cognitivo leve (DCL) en un sujeto, que comprende: determinar el nivel de al menos un miARN en una muestra que contiene miARN circulante extracelular del sujeto, en el que la muestra no es líquido cefalorraquídeo (LCR), y en el que el al menos un miARN se selecciona de entre el grupo que consiste en miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, y combinaciones de los mismos, en el que una diferencia en el nivel del al menos un miARN frente al de un sujeto normal determinada en relación con un control adecuado es indicativa de enfermedad de Alzheimer o DCL en el sujeto.
Description
15
25
35
45
55
65
casos en los que el control adecuado es representativo del nivel de los biomarcadores de miARN en un sujeto que tiene la enfermedad de Alzheimer, en general, los niveles de uno o más de miR-191, miR-15b, Let-7d, let-7g, miR142-3p, miR-301a, y/o miR-545 comparables o inferiores a los de dicho control son indicativos de enfermedad de Alzheimer. En algunos casos en los que los niveles de uno o más biomarcadores de miARN se determinan en un sujeto de prueba, puede haber un descenso en el nivel de uno o más de biomarcadores de miARN, y ningún cambio o un aumento en el nivel de uno o más biomarcadores de miARN adicionales, en relación con un control adecuado. En dichos casos, una diferencia en el nivel de uno o más de los biomarcadores de miARN en relación con un control adecuado representativos del nivel de los biomarcadores de miARN en un sujeto normal indica que el sujeto de prueba tiene la enfermedad de Alzheimer. La determinación de dicha diferencia puede asistirse mediante la ejecución de un algoritmo de clasificación informático, tal como se describe en el presente documento.
4. Muestras biológicas
El nivel de uno o más biomarcadores de miARN pude determinarse en una muestra biológica procedente de un sujeto. Una muestra procedente de un sujeto es una que se origina a partir de un sujeto. Dicha muestra puede procesarse adicionalmente después de obtenerse del sujeto. Por ejemplo, puede aislarse ARN de una muestra. En este ejemplo, el ARN aislado de la muestra también es una muestra procedente de un sujeto. Una muestra biológica útil para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN puede obtenerse esencialmente a partir de cualquier fuente, ya que se ha comunicado expresión de miARN en células, tejidos y fluidos por todo el organismo. Sin embargo, en un aspecto de la invención, los niveles de uno o más biomarcadores indicativos de la enfermedad de Alzheimer pueden detectarse en una muestra obtenida de un sujeto de forma no invasiva. Los biomarcadores existentes para la enfermedad de Alzheimer (p. ej., Aβ1-42, p-tau, etc.) suelen medirse en una muestra procedente de líquido cefalorraquídeo (LCR) o de tejido cerebral. El LCR se obtiene más frecuentemente mediante punción lumbar, lo cual es un método doloroso asociado con factores de riesgo que incluyen hemorragia dentro del conducto raquídeo, cefalea por punción lumbar e infección. La detección de biomarcadores en muestras de tejido cerebral es actualmente inútil para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto vivo, y se usa principalmente para confirmar de forma póstuma un diagnóstico hecho por otros medios. Por consiguiente, se prefiere que la muestra se obtenga a partir de una fuente distinta del tejido cerebral. Los biomarcadores de miARN descritos en el presente documento son indicativos de la enfermedad de Alzheimer y pueden detectarse en muestras biológicas obtenidas de forma no invasiva.
En una realización preferida, la muestra biológica obtenida para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN es una muestra que contiene miARN circulantes, p. ej., miARN extracelulares. Los miARN extracelulares circulan libremente en una amplia gama de material biológico, incluyendo fluidos corporales, tales como fluidos del sistema circulatorio. p. ej., una muestra de sangre o una muestra de linfa, o de otro fluido corporal tal como LCR, orina o saliva. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno
o más biomarcadores de miARN es un fluido corporal, por ejemplo, sangre, fracciones de la misma, suero, plasma, orina, saliva, lágrimas, sudor, semen, secreciones vaginales, linfa, secreciones bronquiales, LCR, etc. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra que se obtiene de forma no invasiva. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene a partir de un fluido corporal distinto del LCR.
Los miARN circulantes incluyen miARN en células (miARN celular), miARN extracelulares en microvesículas (miARN asociado a microvesículas) y miARN extracelulares que no están asociados con células o microvesículas (miARN extracelular no vesicular). En algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN (p. ej., una muestra que contiene miARN circulante) puede contener células. En otras realizaciones, la muestra biológica puede estar libre o sustancialmente libre de células (p. ej., una muestra de suero). La muestra puede estar, del mismo modo, libre o sustancialmente libre de microvesículas. Por ejemplo, una muestra que está libre o sustancialmente libre de microvesículas es una en la cual el contenido de microvesículas de la muestra es suficientemente bajo para evitar la interferencia con la capacidad para determinar de forma precisa el nivel de miARN no vesicular en la muestra. En algunas realizaciones, una muestra que contiene miARN circulantes,
p. ej., miARN extracelulares, es una muestra procedente de sangre. Los ejemplos de muestra procedente de sangre incluyen, p. ej., una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, etc. En otras realizaciones, una muestra que contiene miARN circulantes es una muestra de linfa. También se encuentran miARN circulantes en orina y saliva y las muestras biológicas procedentes de estas fuentes son adecuadas del mismo modo para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN.
5. Determinación del nivel de biomarcadores de miARN en una muestra
El nivel de uno o más biomarcadores de miARN en una muestra biológica puede determinarse mediante cualquier método adecuado. Puede usarse cualquier método fiable para medir el nivel o cantidad de miARN en una muestra. En general, puede detectarse y cuantificarse miARN de cualquier muestra (incluyendo fracciones de la misma), tal como muestras de ARN aislado mediante diversos métodos conocidos para el ARNm, que incluyen, por ejemplo, métodos basados en amplificación (p. ej, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), amplificación en círculo rodante, etc.), métodos basados en hibridación (p. ej, matrices de hibridación (p. ej., micromatrices), análisis
15
25
35
45
55
65
de NanoString, análisis de transferencia de Northern, amplificación de señal de ADN ramificado (ADNr) hibridación in situ, etc.), y métodos basados en secuenciación (p. ej, secuenciación de última generación, por ejemplo, usando las plataformas Illumina o IonTorrent). Otras técnicas de ejemplo incluyen ensayo de protección de ribonucleasa (EPR) y espectroscopía de masas.
En algunas realizaciones, el ARN se convierte en ADN (ADNc) antes del análisis. El ADNc puede generarse mediante transcripción inversa de miARN aislado usando técnicas convencionales. Los kits de transcripción inversa de miARN se conocen y están disponibles comercialmente. Los ejemplos de kits adecuados incluyen, pero no se limitan al kit de transcripción mirVana™ TaqMan® miRNA Transcription kit (Ambion, Austin, TX), y el kit de transcripción TaqMan® miRNA Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se conocen cebadores universales o cebadores específicos, incluyendo cebadores de tallo-bucle y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Applied Biosystems, En algunas realizaciones, el miARN se amplifica antes de su medición. En otras realizaciones, el nivel de miARN se mide durante el método de amplificación. En otras realizaciones más, el nivel de miARN no se amplifica antes de su medición. Algunos métodos de ejemplo adecuados para determinar el nivel de miARN en una muestra se describen con detalle más adelante. Estos métodos se proporcionan únicamente a modo de ilustración, y será evidentes para un experto que pueden usarse del mismo modo otros métodos adecuados.
A. métodos basados en amplificación
Existen numerosos métodos basados en amplificación para detectar el nivel de secuencias de ácido nucleico de miARN, que incluyen, pero no se limitan a, PCR, RT-PCR, qPCR y amplificación en círculo rodante. Otras técnicas basadas en amplificación incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la ligasa, amplificación de sondas de ligamiento múltiple, transcripción in vitro (TIV), amplificación por desplazamiento de cadena (ADC), amplificación mediada por transcripción, amplificación de ARN (de Eberwine) y otros métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Una reacción de PCR típica incluye múltiples etapas, o ciclos, que amplifican selectivamente especies de ácido nucleico diana: una etapa de desnaturalización, en la cual se desnaturaliza un ácido nucleico diana; una etapa de hibridación, en la cual un conjunto de cebadores (es decir, cebadores directo e inverso) hibridan con cadenas complementarias de ADN, y una etapa de elongación, en la cual una ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores. Repitiendo estas etapas múltiples veces, un fragmento de ADN se amplifica para producir un amplicón, que corresponde a la secuencia diana. Las reacciones de PCR típicas incluyen 20 o más ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación. En muchos casos, las etapas de hibridación y elongación pueden realizarse de forma simultánea, en cuyo caso, el ciclo contiene solo dos etapas. Puede realizarse una reacción de transcripción inversa (que produce una secuencia de ADNc que tiene complementariedad con un miARN) antes de la amplificación por PCR. Las reacciones de transcripción inversa incluyen el uso de, p. ej., una ADN polimerasa basada en ARN (transcriptasa inversa) y un cebador.
Los kits para la PCR cuantitativa en tiempo real de miARN son conocidos y están disponibles comercialmente. Los ejemplos de kits adecuados incluyen, pero no se limitan a, TaqMan® miRNA Assay (Applied Biosystems) y mirVana™ qRT-PCR miRNA Detection kit (Ambion). El miARN puede ligarse a un oligonucleótido monocatenario que contiene secuencias de cebador universal, una secuencia poliadenilada, o una secuencia adaptadora antes de la transcriptasa inversa y amplificarse usando un cebador complementario a la secuencia de cebador universal, cebador poli(T), o cebador que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia adaptadora.
En algunos casos, pueden desarrollarse ensayos de qRT-PCR a medida para la determinación de niveles de miARN. Los ensayos de qRT-PCR a medida para la determinación de niveles de miARN en una muestra biológica,
p. ej., un fluido corporal, pueden desarrollarse usando, por ejemplo, métodos que implican un cebador de transcripción inversa extensa y PCR modificada de ácido nucleico bloqueado. Los ensayos a medida de miARN pueden comprobarse efectuando el ensayo en una serie de dilución de miARN sintetizados químicamente correspondientes a la secuencia diana. Esto permite la determinación del límite de detección y el intervalo de cuantificación lineal de cada ensayo. Además, cuando se usa una curva patrón, estos datos permiten una estimación de la abundancia absoluta de miARN medidos en muestras biológicas.
Las curvas de amplificación pueden comprobarse para verificar que los valores de Ct se evalúan en el intervalo lineal de cada gráfico de amplificación. Típicamente, el intervalo lineal abarca varios órdenes de magnitud. Para cada miARN candidato analizado, puede obtenerse una versión del miARN sintetizada químicamente y analizarse en una serie de dilución para determinar el límite de sensibilidad del ensayo, y el intervalo de cuantificación lineal. Pueden determinarse niveles de expresión relativos, por ejemplo, de acuerdo con el método del 2(-ΔΔ C(T)), tal como describen Livak et al., Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔ C(T)) Method. Methods (2001) dic; 25(4):402-8.
En algunas realizaciones, se amplifican dos o más miARN en un único volumen de reacción. Por ejemplo, la q-PCR múltiple, tal como la qRT-PCR, permite la amplificación y cuantificación simultánea de al menos dos miARN de interés en un volumen de reacción usando más de un par de cebadores y/o más de una sonda. Los pares de cebadores comprenden al menos un cebador de amplificación que se une específicamente a cada miARN, y las
15
25
35
45
55
65
sondas se marcan de forma que son distinguibles entre sí, permitiendo así la cuantificación simultánea de múltiples miARN.
La amplificación en círculo rodante es una reacción dirigida por ADN polimerasa que puede replicar sondas de oligonucleótido circularizadas con cinética bien lineal o bien geométrica en condiciones isotérmicas (véase, por ejemplo, Lizardi et al., Nat. Gen. (1998) 19(3):225-232; Gusev et al., Am. J. Pathol. (2001) 159(1):63-69; Nallur et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29(23):E118). En presencia de los dos cebadores, uno que hibrida con la cadena (+) de ADN, y otro que hibrida con la cadena (-), un patrón complejo de desplazamiento de cadena resulta en la generación de más de 109 copias de cada molécula de ADN en 90 minutos o menos. Pueden formarse copias de una molécula circular cerrada de ADN ligadas en tándem usando un cebador individual. El procedimiento también puede realizarse usando un ADN asociado a una matriz. El molde usado para la amplificación en círculo rodante puede someterse a transcripción inversa. Este método puede usarse como un indicador de alta sensibilidad de la secuencia y nivel de expresión del miARN a concentraciones de miARN muy bajas (véase, por ejemplo, Cheng et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (2009) 48(18):3268-72; Neubacher et al., Chembiochem. (2009) 10(8):1289-91).
B. Métodos basados en hibridación
El miARN puede detectarse usando métodos basados en hibridación, que incluyen pero no se limitan a matrices de hibridación (p. ej., micromatrices), análisis de NanoString, análisis de transferencia de Northern, amplificación de señal de ADN ramificado (ADNr) e hibridación in situ.
Las micromatrices pueden usarse para medir los niveles de expresión de números grandes de miARN de forma simultánea. Las micromatrices pueden fabricarse usando una variedad de tecnologías, que incluyen impresión con punzones de punta fina sobre portaobjetos de vidrio, fotolitografía usando máscaras prefabricadas, fotolitografía usando dispositivos de microespejos dinámicos, impresión con inyección de tinta, o electroquímica sobre matrices de microelectrodos. También son útiles las matrices de microfluidos de baja densidad TaqMan Low-Density Arrays, que están basadas en una matriz de reacciones de microfluidos de qRT-PCR, así como en métodos relacionados con qRT-PCR basada en microfluidos.
En un ejemplo de detección por micromatriz, se aplican diversos oligonucleótidos (p. ej., oligos 200+ C6 5' amino modificado) correspondientes a secuencias de miARN codificantes humanas a portaobjetos tridimensionales CodeLink (GE Health/Amersham Biosciences) a una concentración final de alrededor de 20 µM y se procesan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La primera cadena de ADNc sintetizada a partir de 20 µg de ARN total purificado con TRIzol se marca con ddUTP biotinilado usando el kit de marcaje terminal Enzo BioArray End Labeling kit (Enzo Life Sciences Inc.). La hibridación, tinción y lavado pueden realizarse de acuerdo con un protocolo modificado Antisense Genome Array de Affymetrix.
El escáner Axon B-4000 y el programa informático Gene-Pix Pro 4.0 u otro programa informático adecuado pueden usarse para escanear imágenes. Las manchas no positivas tras la sustracción del fondo y los valores atípicos detectados con el procedimiento de ESD se eliminan. Los valores de intensidad de señal resultantes se normalizan con respecto a la mediana de los valores por chip y después se usan para obtener las medias geométricas y los errores típicos para cada miARN. Cada señal de miARN puede transformarse a log en base 2, y puede llevarse a cabo una prueba t de una muestra. Pueden realizarse hibridaciones independientes para cada muestra sobre chips con cada miARN aplicado múltiples veces para aumentar la consistencia de los datos.
Las micromatrices pueden usarse para la identificación del perfil de expresión de miARN en enfermedades Por ejemplo, puede extraerse ARN de una muestra y, opcionalmente, los miARN se seleccionan por tamaño de entre el ARN total. Pueden unirse engarzadores de oligonucleótidos a los extremos 5' y 3' de los miARN y los productos de ligamiento resultantes se usan como moldes para una reacción de RT-PCR. El cebador de PCR de la cadena codificante puede tener un fluoróforo unido a su extremo 5', marcando así la cadena codificante del producto de PCR. Este producto de PCR se desnaturaliza y después se hibrida a la micromatriz. Un producto de PCR, denominado como el ácido nucleico diana que es complementario a la secuencia correspondiente de la sonda de captura del miARN de la micromatriz hibridará, por medio del apareamiento de bases, con la mancha a la cual se fijan las sondas de captura. Después las manchas generarán fluorescencia cuando se exciten usando un escáner de micromatrices con láser.
La intensidad de fluorescencia de cada mancha se evalúa después en cuanto al número de copias de un miARN particular, usando un número de controles positivos y negativos y métodos de normalización de los datos de la matriz, lo cual resultará en la evaluación del nivel de expresión de un miARN particular.
El ARN total que contiene el miARN extraído de una muestra de fluido corporal también puede usarse directamente sin selección por tamaño de los miARN. Por ejemplo, el ARN puede marcarse en 3' usando ARN ligasa de T4 y un engarzador corto de ARN marcado con fluoróforo. Los miARN marcados con fluoróforo complementarios a las secuencias correspondientes de las sondas de captura del miARN de la matriz hibridan, por medio del apareamiento de bases, con la mancha a la cual se fijan las sondas de captura. La intensidad de fluorescencia de cada mancha se evalúa después en cuanto al número de copias de un miARN particular, usando un número de controles positivos y
15
25
35
45
55
65
negativos y métodos de normalización de los datos de la matriz, lo cual resultará en la evaluación del nivel de expresión de un miARN particular.
Pueden emplearse varios tipos de micromatrices que incluyen pero no se limitan a, micromatrices de oligonucleótidos aplicados, micromatrices de oligonucleótidos prefabricadas o matrices de oligonucleótidos aplicados largos.
También pueden detectarse miARN sin amplificación usando el sistema nCounter Analysis System (NanoString Technologies, Seattle, WA). Esta tecnología emplea dos sondas a base de ácido nucleico que hibridan en solución
(p. ej., una sonda indicadora y una sonda de captura). Tras la hibridación, se elimina el exceso de sondas, y los complejos sonda/diana se analizan de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los kits de ensayo nCounter de miARN están disponibles de NanoString Technologies, los cuales son capaces de distinguir entre miARN muy similares con gran especificidad.
Los miARN también pueden detectarse usando amplificación de señal de ADN ramificado (ADNr) (véase, por ejemplo, Urdea, Nature Biotechnology (1994), 12:926-928). Los ensayos para miARN basados en amplificación de señal de ADNr están disponibles comercialmente. Uno de dichos ensayos es el QuantiGene® 2.0 miRNA Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA).
También pueden usarse transferencia de Northern e hibridación in situ para detectar miARN. En la técnica se conocen métodos adecuados para realizar la transferencia de Northern y la hibridación in situ.
C, Métodos basados en secuenciación
Pueden usarse del mismo modo métodos avanzados de secuenciación disponibles. Por ejemplo, pueden detectarse miARN usando Illumina ® Next Generation Sequencing (p. ej., los métodos de secuenciación por síntesis o TruSeq, usando, por ejemplo, los sistemas HiSeq, HiScan, GenomeAnalyzer, o MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA)). También pueden detectarse miARN usando los sistemas Ion Torrent Sequencing (Ion Torrent Systems, Inc., Gulliford, CT), u otros métodos adecuados de secuenciación por semiconductores.
D. Herramientas adicionales de detección de miARN
Puede usarse espectroscopia de masas para cuantificar miARN usando cartografía con ARNasa. Los ARN aislados pueden digerirse enzimáticamente con endonucleasas de ARN (ARNasas) que tienen alta especificidad (p. ej., ARNasa de T1, que escinde en el lado 3' de todos los restos de guanosina no modificados) antes de su análisis mediante EM o estrategias de EM en tándem (EM/EM). La primera estrategia desarrollada utilizó la separación cromatográfica conectada de productos de digestión de endonucleasa mediante HPLC de fase inversa acoplada directamente a IEN-EM. La presencia de modificaciones postranscripcionales puede desvelarse mediante cambios de masa con respecto a los esperados basados en la secuencia de ARN. Los iones con valores anómalos de masa/carga pueden aislarse después para la secuenciación en tándem por EM para localizar la situación en la secuencia del nucleósido modificado postranscripcionalmente.
También se ha usado espectrometría de masas por desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés) (EM-MALDI), como una estrategia analítica para obtener información sobre los nucleósidos modificados postranscripcionalmente. Las estrategias basadas en MALDI pueden diferenciarse de las estrategias basadas en IEN por la etapa de separación. En EM-MALDI, se usa el espectrómetro de masas para separar el miARN.
Para analizar una cantidad limitada de miARN intactos, puede emplearse un sistema del CL capilar acoplado con nano EM-IEN, usando un espectrómetro de masas híbrido Orbitrap-de trampa iónica (LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific) o un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar en tándem (QSTAR® XL, Applied Biosystems) equipado con una fuente de iones por nanopulverización hecha a medida, una válvula de nanovolumen (Valco Instruments), y un sistema de nano HPLC sin división ("splitless") (DiNa, KYA Technologies). El analito/TEAA se carga en una columna de captura de nano-CL, se desala, y después se concentra. Los miARN intactos se eluyen de la columna de captura y se inyectan directamente en una columna capilar Cl 8, y se someten a cromatografía mediante HPLC-RP (HPLC de fase inversa) usando un gradiente de disolventes de polaridad creciente. El eluyente cromatográfico se pulveriza desde una punta pulverizadora unida a la columna capilar, usando un voltaje de ionización que permite escanear los iones en el modo de polaridad negativa.
Los métodos adicionales para la detección y medición de miARN incluyen, por ejemplo, ensayo de invasión de cadena (Third Wave Technologies, Inc.), ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS), ADNc, ADNMT (ADN metálico; Advance Technologies, Saskatoon, SK), y métodos de moléculas individuales tales como el desarrollado por US Genomics. Pueden detectarse múltiples miARN en un formato de micromatriz usando una estrategia novedosa que combina una reacción enzimática superficial con la generación de imágenes por RPS (RPSI) amplificada por nanopartículas. La reacción superficial de las polimerasas de poli(A) crea colas de poli(A) en miARN hibridados sobre micromatrices de ácidos nucleicos bloqueados (ANB). Las nanopartículas modificadas por ADN se
15
25
35
45
55
65
molécula de colorante conjugado con estreptavidina comprende Phycolink® Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme). Los expertos en la técnica conocen otras moléculas de colorante conjugadas.
Los marcadores incluyen, pero no se limitan a: emisores de luz, dispersantes de luz, compuestos que absorben luz, los cuales generan o inactivan una señal fluorescente, quimioluminiscente o bioluminiscente detectable (véase, p. ej., Kricka, L., Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego (1992) y Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press (1997).). En algunas realizaciones se usa una sonda fluorescente con marcaje doble que incluye un fluoróforo indicador y un fluoróforo inactivador. Se apreciará que se eligen pares de fluoróforos que tienen espectros de emisión distintos de modo que puedan distinguirse fácilmente.
En ciertas realizaciones, los marcadores son restos estabilizadores de la hibridación que sirven para potenciar, estabilizar, o influir sobre las cadenas dobles de hibridación, p. ej., intercalantes y colorantes de intercalación (incluyendo, pero sin limitarse a, bromuro de etidio y SYBR Green), agentes que se unen al surco menor, y grupos funcionales de reticulación (véase, p. ej., Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure", en Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)).
En otras realizaciones, pueden usarse métodos que se basan en la hibridación y/o ligamiento para cuantificar miARN, que incluyen métodos de ligamiento de oligonucleótidos (OLA, por sus siglas en inglés) y métodos que permiten que una sonda distinguible que hibrida con la secuencia diana de ácido nucleico se separe de una sonda no unida. Como ejemplo, pueden usarse sondas de tipo HARP, tal como se desvela en la publicación de patente de EE.UU. n.º 2006/0078894, para medir la cantidad de miARN. En dichos métodos, tras la hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, la sonda se modifica para distinguir la sonda hibridada de la sonda no hibridada. A partir de ahí, la sonda puede amplificarse o detectarse. En general, una región de inactivación de la sonda comprende un subgrupo de nucleótidos dentro de la región de hibridación diana de la sonda. Para reducir o evitar la amplificación o detección de una sonda HARP que no está hibridada con su ácido nucleico diana, y permitir, por tanto, la detección del ácido nucleico diana, se lleva a cabo una etapa de inactivación de la sonda tras la hibridación usando un agente que es capaz de distinguir entre una sonda HARP que está hibridada con su secuencia de ácido nucleico diana y la correspondiente sonda HARP no hibridada. El agente es capaz de inactivar o modificar la sonda HARP no hibridada de forma que no puede amplificarse.
También puede usarse una reacción de ligamiento de sonda para cuantificar miARN. En una técnica de amplificación de sonda dependiente de ligamiento múltiple (MLPA, por sus siglas en inglés) (Schouten et al., Nucleic Acids Research 30:e57 (2002)), pares de sondas que hibridan en posiciones inmediatamente adyacentes sobre el ácido nucleico diana, se ligan entre sí dirigidas por la presencia del ácido nucleico diana. En algunos aspectos, las sondas MLPA tienen sitios de unión de cebadores de PCR flanqueantes. Las sondas MLPA se amplifican de forma específica cuando se ligan, permitiendo así la detección y cuantificación de biomarcadores de miARN.
6. Determinación del estado de la enfermedad de Alzheimer usando biomarcadores de miARN
Los biomarcadores de miARN descritos en el presente documento pueden usarse de forma individual o en combinación en pruebas diagnósticas para evaluar el estado de la enfermedad de Alzheimer de un sujeto. El estado de la enfermedad incluye la presencia de la enfermedad de Alzheimer. El estado de la enfermedad también puede incluir vigilar la evolución de la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, vigilando el avance de la enfermedad. Basándose en el estado de la enfermedad de Alzheimer de un sujeto, pueden estar indicados procedimientos adicionales, que incluyen, por ejemplo, pruebas diagnósticas o procedimientos terapéuticos adicionales.
El poder de una prueba diagnóstica para predecir correctamente el estado de la enfermedad se usa habitualmente en cuanto a la precisión del ensayo, la sensibilidad del ensayo, la especificidad del ensayo, o el "área bajo la curva" (ABC), por ejemplo, el área bajo la curva de la característica operativa del receptor (COR). Tal como se usa en el presente documento, la precisión es la medida de la fracción de muestras mal clasificadas. La precisión puede calcularse como el número total de muestras clasificadas correctamente dividido por el número total de muestras, p. ej., en una población de prueba. La sensibilidad es una medida de los "verdaderos positivos" que se ha predicho que son positivos mediante una prueba, y puede calcularse como el número de muestras de enfermedad de Alzheimer identificadas correctamente dividido por el número total de muestras de enfermedad de Alzheimer. La especificidad es una medida de los "verdaderos negativos" que se ha predicho que son negativos mediante una prueba, y puede calcularse como el número de muestras normales identificadas correctamente dividido por el número total de muestras normales. El ABC es una medida del área bajo una curva de la característica operativa del receptor, que es un gráfico de la sensibilidad frente al índice de falsos positivos (1-especificidad). Cuanto mayor es el ABC, más poderoso es el valor predictivo de la prueba. Otras medidas útiles de la utilidad de una prueba incluyen el "valor predictivo positivo", que es el porcentaje de positivos reales que se analizan como positivos, y el "valor predictivo negativo", que es el porcentaje de negativos reales que se analizan como positivos. En una realización preferida, el nivel de uno o más biomarcadores de miARN en las muestras procedentes de sujetos que tienen diferentes estados de la enfermedad de Alzheimer muestran una diferencia estadísticamente significativa de al menos p≤0,05, p. ej., p ≤ 0,05, p≤0,01, p≤0,005, p≤0,001, etc., en relación con los sujetos normales, determinada en relación con un control adecuado. En otra realización preferida, las pruebas diagnósticas que usan biomarcadores de miARN descritas en el presente documento de forma individual o en combinación muestran una precisión de al menos alrededor de un 75
15
25
35
45
55
65
tablas, y sus usos en los métodos y kits descritos en el presente documento.
Por consiguiente, se proporcionan métodos para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, determinando el nivel de dos o más miARN en una muestra que contiene miARN circulante del sujeto, en el que una diferencia en el nivel de los miARN frente al de un sujeto normal (determinada en relación con un control adecuado) es indicativa de enfermedad de Alzheimer en el sujeto. Los miARN incluyen preferentemente uno o más de miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, y Let-7d, y pueden incluir opcionalmente miR-301a, miR-545, o miR-301a y miR-545. Las combinaciones de ejemplo de dos o más biomarcadores de miARN incluyen, por ejemplo, miR-545, let7g, y miR15b; miR-15b y miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g y miR-15b; miR-191 y miR-15b; Let-7g y miR-15b; miR-191, miR-301a, y miR-545; miR-301a, let-7g, y miR-15b; y miR-191, miR-301a, miR-545, y miR-15b.
También se proporciona un método de diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto determinando los niveles de dos o más miARN en una muestra que contiene miARN circulante del sujeto, comparando los niveles de los dos o más miARN de la muestra con un conjunto de datos que representan los niveles de los mismos miARN presentes en sujetos normales y en sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer, y diagnosticar al sujeto como que tiene o no tiene la enfermedad de Alzheimer basándose en la comparación. En dicho método, el conjunto de datos sirve como un control adecuado o patrón de referencia para la comparación con la muestra del sujeto. La comparación de la muestra del sujeto con el conjunto de datos puede estar asistida mediante un algoritmo de clasificación, que computa si existe o no una diferencia estadísticamente significativa entre los niveles colectivos de los dos o más miARN de la muestra y los niveles de los mismos miARN presentes en sujetos normales y en sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer.
7. Generación de algoritmos de clasificación para cualificar el estado de la enfermedad de Alzheimer
En algunas realizaciones, los datos que se generen usando muestras tales como "muestras conocidas" pueden usarse después para "entrenar" un modelo de clasificación. Una "muestra conocida" es una muestra que se ha preclasificado, p. ej., se ha clasificado como procedente de un sujeto normal, o de un sujeto que tiene la enfermedad de Alzheimer. Los datos que preceden de los espectros y se usan para formar el modelo de clasificación pueden denominarse como "un conjunto de datos de entrenamiento". Una vez entrenado, el modelo de clasificación puede reconocer patrones en datos procedentes de espectros generados usando muestras conocidas. El modelo de clasificación puede usarse después para clasificar las muestras desconocidas en clases. Esto puede ser útil, por ejemplo, para predecir si una muestra biológica particular se asocia con una cierta afección biológica (p. ej., enfermo frente a no enfermo).
En algunas realizaciones, los datos para el conjunto de datos de entrenamiento que se usa para formar el modelo de clasificación pueden obtenerse directamente a partir de PCR cuantitativa (por ejemplo, valores de Ct obtenidos usando el método ΔΔCt), o a partir de identificación del patrón de expresión de alto rendimiento, tal como análisis de micromatriz (por ejemplo, recuentos totales o recuentos normalizados a partir de un ensayo de expresión de miARN,
p. ej., el ensayo de expresión de miARN nCounter).
Los modelos de clasificación pueden formarse usando cualquier método de clasificación estadística (o de "aprendizaje") adecuado que intenta segregar cuerpos de datos en clases basadas en parámetros objetivos presentes en los datos. Los métodos de clasificación pueden ser bien supervisados o bien no supervisados. Se describen ejemplos de procesos de clasificación supervisados y no supervisados en Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, vol. 22, n.º 1, enero de 2000.
En una clasificación supervisada, los datos de entrenamiento que contienen ejemplos de categorías conocidas se presentan a un mecanismo de aprendizaje, que aprende uno o más conjuntos de relaciones que definen cada una de las clases conocidas. Después pueden aplicarse nuevos datos al mecanismo de aprendizaje, que clasifica después los nuevos datos usando las relaciones aprendidas. Los ejemplos de procesos de clasificación supervisados incluyen procesos de regresión lineal (p. ej., regresión lineal múltiple (RLM), regresión de mínimos cuadrados parciales (RMCP) y regresión de componentes principales (RCP)), arboles de decisión binarios (p. ej., procesos de particionamiento recursivo tales como ACR -árboles de clasificación y regresión-), redes neurales artificiales como redes de retropropagación, análisis discriminantes (p. ej., clasificador bayesiano o análisis de Fischer), clasificadores logísticos, y clasificadores de vectores de soporte (máquinas de vectores de soporte).
En otras realizaciones, los modelos de clasificación que se crean pueden formarse usando métodos de aprendizaje no supervisados. La clasificación no supervisada intenta aprender clasificaciones basadas en similitudes en el conjunto de datos de entrenamiento, sin preclasificar los espectros a de los cuales procede el conjunto de datos de entrenamiento. Los métodos de aprendizaje no supervisados incluyen análisis de conglomerados. Un análisis de conglomerados intenta dividir los datos en "conglomerados" o grupos que idealmente deberían tener miembros que son muy similares entre sí, y muy diferentes a los miembros de otros grupos. La similitud se mide después usando cierta distancia métrica, que mide la distancia entre las unidades ("items") de datos, y agrupa las unidades de datos que están más cercanas entre sí. Las técnicas de agrupación incluyen el algoritmo de K-medias de MacQueen y el algoritmo del mapa autoorganizado de Kohonen.
15
25
35
45
55
65
ajustar un umbral mayor para los experimentos de Nanostring podría ser útil para reducir el número de candidatos falsos positivos.
Materiales y métodos
Extracción de ARN total
El ARN total se extrajo usando un protocolo mirVana PARIS modificado (Life Technologies; AM 1556) como se ha descrito (Mitchell, P.S. et al. PNAS. 2008 jul 29; 105(30):10513-8). Se añadió 1 ml de plasma humano a una cantidad equivalente de tampón desnaturalizante 2 x y después se adicionaron 10 µl de Ath-159a 0,05 µM y 40 pM de Neg-A (UUGUGGCGAGCGGAAUGGAAU) (miARN sintéticos usados para la normalización y el control de la eficacia de la extracción). Se realizó extracción con fenol dos veces, y el ARN total se eluyó finalmente en 70 µl de agua siguiendo la recomendación del protocolo (AM1556).
Identificación del patrón de expresión de alto rendimiento de los miARN
Se concentraron 45 µl de ARN total purificado hasta 9 µl y se usaron como molde para el ensayo de expresión de miARN nCounter (Nanostring Technology, Seattle, WA-EE.UU.). La preparación de la muestra se efectuó de la forma recomendada (Nanostring; C-0009-02) usando 3 µl de ARN total concentrado como cantidad de partida para todas las muestras por triplicado. Dado que la cantidad de ARN total recuperado no fue suficiente para detectarlo de forma fiable usando equipos basados en espectros convencionales tales como Nanodrop, se adoptó una estrategia de volumen equivalente en la que se usaron 3 µl de ARN total concentrado como material de partida para todos los ensayos basados en Nanostring (utilizada también en Mitchell, P.S. et al. PNAS. 2008 jul 29;105(30):10513-8). Las reacciones se prepararon para una hibridación de toda la noche durante 16 horas a 65 ºC. Al día siguiente, las muestras se procesaron a través del puesto nCounter Prep Station (Nanostring Technology, Seattle, WA-EE.UU.). v.20081003) tal como recomienda el protocolo del fabricante, seguido de procesamiento a través del equipo nCounter Digital Analyzer (Nanostring Technology, Seattle, WA-EE.UU.). v.20081009). La resolución del analizador se ajustó a 600 CDV. Los datos se descargaron y se analizaron en Excel tal como se recomienda (guía para el análisis de datos de nCounter). Brevemente, los datos se normalizaron primero con respecto a la variación entre carriles usando los controles de ensayo positivos proporcionados. Esto se siguió de una normalización de la media global usando los recuentos de los miARN con expresión superior a 100. Después se comprobó cada valor normalizado para garantizar que fuera al menos 2 DT superior al promedio de la señal de fondo registrada para ese carril. Cualquier valor por debajo de ese se convirtió en cero. Los valores de factor de cambio se calcularon tomando el promedio de todos los valores de expresión en las muestras de EA/DCL y CN para los miARN individuales.
Validación de biomarcadores de miARN candidatos usando qPCR TaqMan
Los biomarcadores de miARN candidatos identificados usando la plataforma de alto rendimiento Nanostring se validaron después usando el ensayo RT-qPCR TaqMan de miARN de tallo-bucle (Life Technologies). Brevemente, Se creó un grupo de cebadores de RT con cebadores de RT específicos de miARN (miR-301a, miR-1975, miR-191, miR-15b, miR-126, let-7g, Let-7d, miR-545, miR-1274, miR-142-3p, miR-600, miR-453, miR-563, miR-106a y ath159a) a una concentración final de 0,05x en TE 1x. Los cebadores y sondas específicos de miARN se adquirieron de Life Technologies. Se preparó una reacción de RT de 15 µl que contenía 6 µl del grupo de cebadores de RT, 0,3 ml de dNTPS (100 mM), 3 µl de Multiscribe RT (50U/µl), 1,5 µl del tampón de transcripción inversa 10x y 0,2 ml de RNAseIN (20U/µl) y agua. Todos los componentes de la transcripción inversa estaban contenidos en el kit miRNA RT kit (Life Technologies; n.º 4366596). Se añadieron tres µl de ARN total (dilución 1:10) como molde para cada muestra y la reacción se incubó en hielo durante 5 min seguido de 30 min a 16 °C, 30 min a 42 °C, y 5 min at 85 °C para la inactivación de la enzima. La reacción se almacenó después a 4 ºC. Después se creó un segundo grupo de cebadores de preamplificación con cada cebador y sonda de PCR (20x) para los mismos ensayos mezclados a una concentración final de 0,2x en TE 1x. Se preparó una reacción de preamplificación que contenía mezcla maestra de preamplificación 2x (Life Technologies; n.º 4391128), 3,75 µl del grupo de cebadores de preamplificación a medida y agua (ajustando el volumen de reacción a 22,5 µl). Después se añadieron 2,5 µl del producto de la RT y se sometió a ciclos a través del programa de preamplificación [95 °C durante 10 min, 55 °C durante 2 min, y 72 °C durante 2 min seguido de 12 ciclos de 95 °C durante 15 seg y 60 °C durante 4 min]. Esto se siguió de una incubación a 99,9 ºC durante 10 min, y después la reacción se diluyó añadiendo 175 µl de TE 0,1x (pH 8,0) y se mezcló mediante inversión. Después se usaron dos µl del producto de preamplificación para las reacciones convencionales individuales de qPCR TaqMan (por duplicado) siguiendo el protocolo convencional ((Life Technologies; P/N 4364031-Rev D) en un equipo ABI7500. Los valores de Ct se calcularon ajustando un umbral manual de 0,2 y una línea basal automática para todas las reacciones en un único estudio (SDS 2,4, Life Technologies) para un análisis uniforme.
Se usó el método ΔΔCt (Life Technologies, véase también Livak KJ, Schmittgen TD, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔ C(T)) Method. Methods. (2001) dic;25(4):402-8) para el análisis, usándose la media geométrica tanto de hsa-miR-106a como de ath-159a como control endógeno, y usándose los valores promedio de Ct relativos de los pacientes CN para calibrar todos los valores individuales. Después se calcularon los valores de factores de cambio lineal y se representaron en gráficos de dispersión usando
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
el programa Prism (GraphPad Prism Software, San Diego, CA-EE.UU.). (Nota: La validación de distintivo para la cohorte 2 (véase el ejemplo 2) se hizo exactamente como se describe anteriormente, pero los grupos de RT y preamplificación se prepararon usando únicamente cebadores específicos de distintivo y control de normalización (miR-301a, miR-191, miR-15b, let-7g, Let-7d, miR-545, miR-142-3p, miR-106a y ath-159a). Los cebadores y sondas específicos de miARN se adquirieron de Life Technologies, con los n.º de cat. 000464 (miR-142-3p), 001289 (miR545), 000380 (let-7d), 000490 (miR-191), 000528 (miR-301a), 000383 (let-7g), 000390 (miR-15b), 000578 (miR106a), y 000338 (ath-159a)).
Ejemplo 2: Generación de distintivos y construcción del modelo predictivo
Los miARN identificados y validados como que tenían una expresión significativamente diferente entre muestras de EA y CN en la cohorte 1 (factor de cambio >1,5, valor de p <0,005) se seleccionaron para la construcción del modelo predictivo. Los valores de expresión de 7 miARN (let-7d, miR-191, miR-301a, miR-545, let-7g, miR-15b, miR-142-3p) de cada una de las muestras de EA (n=11) y CN (n=20) de la cohorte 1 se usaron como entrada para un modelo de construcción de distintivos. En particular, se usaron los valores relativos de Ct (valores de Ct observados de miARN individuales menos la media geométrica de los valores de Ct de Ath-159a y miR-106a) para cada uno de los 7 miARN obtenidos a partir de la qPCR TaqMan de las muestras de la cohorte 1 para construir un clasificador lineal para separar las muestras de EA de las de CN (los valores de Ct relativos se muestran en la tabla 4). Se usaron todos los subgrupos no cero de los 7 miARN (127 distintivos) para el análisis discriminatorio lineal (ADL). Para el ADL, se usó el paquete informático MASS en la implementación de Windows de la versión R 2.12.2 (Venables, W. N. y Ripley, B. D. (2002) Modern Applied Statistics with S. Cuarta edición. Springer, New York. ISBN 0-387-95457-0). El código fuente del análisis está disponible en: http://cran.r-project.org/web/packages/MASS/index.html. Pueden usarse o desarrollarse otros paquetes informáticos adecuados. Los cifras del área bajo la curva (ABC) también se calcularon en R (versión 2.12.2) usando el paquete informático "verificación" (código fuente disponible en http://cran.r-project.org/web/packages/verification/index.html; véase también Mason, S.J. y N.E. Graham. "Areas beneath the relative operating characteristics (ROC) and relative operating levels (ROL) curves: Statistical significance and interpretation," Q. J. R. Meteorol. Soc. 30 (1982) 291-303). Pueden usarse o desarrollarse otros paquetes informáticos adecuados.
Más adelante se expone un código y una descripción de muestra de los archivos de entrada usados para calcular las cifras de precisión, sensibilidad, especificidad y ABC de la predicción. Este código muestra cómo clasificar muestras desconocidas como EA o normales usando un distintivo significativo de tres miARN ("miR-545","let-7g","miR-15b"). El código para realizar una clasificación basada en cualquier combinación de los 7 miARN validados sería similar, y debería entenderse que pueden usarse distintivos basados en cualquier combinación de estos 7 miARN. Podemos construir un modelo discriminante lineal para cualquier combinación o para un miARN individual seleccionado de entre los 7 miARN validados determinando los coeficientes del modelo de ADL Una vez hemos determinado el modelo basado en la cohorte 1, podemos predecir para cualquier muestra nueva si el individuo a partir del cual se obtuvo la muestra es un individuo con EA, o un individuo normal. Para hacer una predicción para una muestra nueva necesitamos determinar los niveles de expresión de miARN para cualquier miARN individual del distintivo. Basándose en estos valores, el modelo devolverá la probabilidad ("a posteriori") de que la nueva muestra es de un individuo que tiene EA. El valor límite de esta probabilidad determina la sensibilidad y especificidad del modelo. Para nuestras predicciones, determinamos la precisión, sensibilidad y especificidad a un umbral de 0,5 (es decir, si la probabilidad de una muestra de ser de EA es mayor de 0,5, nuestro modelo la clasifica como EA).
Los archivos de entrada de ejemplo pueden estar en forma de train.txt, validation.txt, train_an.txt y validation_an.txt. "Train.txt" es el archivo que contiene el perfil de expresión para la cohorte 1 en forma de matriz, en la que las filas son las muestras y las columnas son los miARN. La primera fila contiene los nombres de los miARN y la primera columna los nombres de las muestras. El archivo "train_an.txt" contiene la anotación de las muestras. Hay dos columnas, en las que la primera columna contiene el nombre de la muestra y la segunda columna la anotación de las muestras ("normal" y "AD" -EA en inglés-en este caso). Los archivos ""validation.txt" y "validation_an.txt" contienen los datos y anotaciones para la cohorte 2 exactamente en el mismo formato. Las variables prediction$class y prediction$posteri contienen la anotación predicha y la probabilidad correspondiente de las muestras de la cohorte 2.
El código de ejemplo que puede usarse para calcular las cifras de precisión, sensibilidad, especificidad y ABC de la predicción es como sigue:
Claims (1)
-
imagen1 imagen2
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161501720P | 2011-06-27 | 2011-06-27 | |
| US201161501720P | 2011-06-27 | ||
| PCT/US2012/044202 WO2013003350A2 (en) | 2011-06-27 | 2012-06-26 | Microrna biomarkers indicative of alzheimer's disease |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2580379T3 true ES2580379T3 (es) | 2016-08-23 |
Family
ID=46724591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12750628.5T Active ES2580379T3 (es) | 2011-06-27 | 2012-06-26 | Biomarcadores de microARN indicativos de la enfermedad de Alzheimer |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9771617B2 (es) |
| EP (1) | EP2723894B1 (es) |
| JP (2) | JP6154809B2 (es) |
| KR (1) | KR102082016B1 (es) |
| CN (1) | CN103781919B9 (es) |
| AU (1) | AU2012275556B2 (es) |
| BR (1) | BR112013033488B8 (es) |
| CA (1) | CA2840196C (es) |
| ES (1) | ES2580379T3 (es) |
| IL (1) | IL230034B (es) |
| MX (1) | MX341840B (es) |
| RU (1) | RU2639509C2 (es) |
| WO (1) | WO2013003350A2 (es) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2742155B1 (en) * | 2011-08-08 | 2018-01-24 | Advanced Genomic Technology LLC | Biomarker for alzheimer's disease and/or mild cognitively impairment |
| WO2015050835A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Advanced Genomic Technology, Llc | Circulating biomarkers for alzheimer's disease and/or mild cognitive impairment |
| WO2015134551A1 (en) * | 2014-03-03 | 2015-09-11 | Banyan Biomarkers, Inc. | Micro rna markers for diagnosis of a neurological condition |
| KR101583450B1 (ko) * | 2014-12-01 | 2016-01-11 | 전주대학교 산학협력단 | 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커 |
| ES2741591T3 (es) | 2015-03-13 | 2020-02-11 | Univ Hiroshima | Método para ayudar a la detección de la enfermedad de Alzheimer o una discapacidad cognitiva moderada |
| US10358676B2 (en) * | 2015-04-03 | 2019-07-23 | Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital | Methods and kits for detecting Kawasaki disease |
| KR101734645B1 (ko) * | 2015-05-18 | 2017-05-11 | (주)에이엔티랩스 | 초기 알츠하이머 병 또는 경도 인지 장애 진단 방법 |
| WO2017047529A1 (ja) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | 株式会社 島津製作所 | 脳内のアミロイドβ蓄積状態を評価するマルチプレックスバイオマーカー及びその分析方法 |
| ES2734678T3 (es) * | 2015-12-22 | 2019-12-11 | Siemens Ag | Firmas específicas en enfermedad de alzheimer por perfiles de miarn multicéntricos |
| US10262423B2 (en) * | 2016-03-29 | 2019-04-16 | Verily Life Sciences Llc | Disease and fall risk assessment using depth mapping systems |
| WO2017186719A1 (en) * | 2016-04-25 | 2017-11-02 | Instytut Biologii Doswiadczalnej Im. Marcelego Nenckiego Polska Akademia Nauk | Microrna biomarkers in blood for diagnosis of alzheimer's disease |
| KR101998457B1 (ko) * | 2016-05-10 | 2019-07-10 | 조선대학교산학협력단 | 알츠하이머 질병의 진단을 위한 바이오마커 |
| KR101992539B1 (ko) * | 2016-10-21 | 2019-09-30 | 서울대학교산학협력단 | miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법 |
| WO2018228875A1 (en) * | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Nestec S.A. | Micro-rna biomarkers of blood-brain barrier dysfunction |
| JP2020524509A (ja) * | 2017-06-19 | 2020-08-20 | セント・ジョーンズ・ユニバーシティＳｔ． Ｊｏｈｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | アルツハイマー病の診断のための循環血清マイクロｒｎａバイオマーカー及び方法 |
| US11492669B2 (en) | 2017-07-12 | 2022-11-08 | Texas Tech University System | MicroRNA-455-3p as a peripheral biomarker for Alzheimer's disease |
| US11078535B2 (en) | 2017-07-18 | 2021-08-03 | The Trustees Of Indiana University | Presymptomatic micro RNA targets for treatment of neurodegeneration pathology |
| CN111511929A (zh) * | 2017-10-25 | 2020-08-07 | 蜂鸟诊断有限责任公司 | 作为用于阿尔茨海默氏病的生物标志物的miRNA |
| WO2019094780A2 (en) * | 2017-11-12 | 2019-05-16 | The Regents Of The University Of California | Non-coding rna for detection of cancer |
| WO2019117306A1 (ja) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | 国立大学法人広島大学 | アルツハイマー病の検出を補助する方法 |
| CN108277271A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-07-13 | 范瑶飞 | 一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA |
| JP7414237B2 (ja) * | 2018-02-13 | 2024-01-16 | 東レ株式会社 | 認知症の検出のためのキット又はデバイス及び方法 |
| US20210262030A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-08-26 | Universitat Autonoma De Barcelona | Circulating mirnas as biomarkers for diagnosis of mild cognitive impairment and alzheimers disease |
| US20210292840A1 (en) * | 2018-07-25 | 2021-09-23 | Srnalytics, Inc. | Small rna predictors for alzheimer's disease |
| JP6884810B2 (ja) * | 2019-05-08 | 2021-06-09 | キユーピー株式会社 | 情報提供装置、情報提供方法及びｍｉＲＮＡ重要度テーブル生成方法 |
| CN116171332A (zh) * | 2020-07-24 | 2023-05-26 | 奥塔哥创新有限公司 | 用于认知疾病的生物标志物 |
| US20240096490A1 (en) * | 2021-01-29 | 2024-03-21 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Systems and methods for diagnosing neurodegenerative diseases |
Family Cites Families (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965364A (en) | 1990-10-09 | 1999-10-12 | Benner; Steven Albert | Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives |
| US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
| US5767259A (en) | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| DE69738687D1 (de) | 1996-04-12 | 2008-06-26 | Phri Properties Inc | Sonden, kits und assays |
| SE506700C2 (sv) | 1996-05-31 | 1998-02-02 | Mikael Kubista | Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra |
| US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
| WO1999022018A2 (en) | 1997-10-27 | 1999-05-06 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US6383752B1 (en) | 1999-03-31 | 2002-05-07 | Hybridon, Inc. | Pseudo-cyclic oligonucleobases |
| EP1236173A2 (en) | 1999-10-27 | 2002-09-04 | Biowulf Technologies, LLC | Methods and devices for identifying patterns in biological systems |
| US6528254B1 (en) | 1999-10-29 | 2003-03-04 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid sequence |
| US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| KR101054732B1 (ko) | 2000-07-18 | 2011-08-05 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크레터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 | 생물학적 데이터의 숨겨진 패턴에 근거한 생물학적 상태의 식별 방법 |
| US6350580B1 (en) | 2000-10-11 | 2002-02-26 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure |
| US7113896B2 (en) | 2001-05-11 | 2006-09-26 | Zhen Zhang | System and methods for processing biological expression data |
| CA2459347C (en) | 2001-09-04 | 2012-10-09 | Exiqon A/S | Locked nucleic acid (lna) compositions and uses thereof |
| US6593091B2 (en) | 2001-09-24 | 2003-07-15 | Beckman Coulter, Inc. | Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer |
| US20020193950A1 (en) | 2002-02-25 | 2002-12-19 | Gavin Edward J. | Method for analyzing mass spectra |
| US20030225031A1 (en) * | 2002-05-21 | 2003-12-04 | Quay Steven C. | Administration of acetylcholinesterase inhibitors to the cerebral spinal fluid |
| JP2004161636A (ja) | 2002-11-11 | 2004-06-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 軽度認知障害または注意欠陥多動性障害治療剤 |
| CN101824409B (zh) | 2003-04-25 | 2015-11-25 | 贝克顿·迪金森公司 | 通过核酸扩增检测1型和2型单纯疱疹病毒 |
| US9119846B2 (en) | 2003-04-29 | 2015-09-01 | Neurim Pharmaceuticals (1991) Ltd. | Method and composition for enhancing cognition in alzheimer's patients |
| WO2006017151A2 (en) | 2004-07-09 | 2006-02-16 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Identification of makers in esophageal cancer, colon cancer, head and neck cancer and melanoma |
| US20060078894A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Winkler Matthew M | Methods and compositions for analyzing nucleic acids |
| JP2006176503A (ja) * | 2004-11-26 | 2006-07-06 | Tohoku Univ | 脳血管障害を伴うアルツハイマー病治療薬 |
| RU2418068C2 (ru) * | 2005-08-17 | 2011-05-10 | Сирна Терапьютикс, Инк. | Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк |
| WO2007044937A2 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods to modulate memory |
| CA2661558A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Novartis Ag | Biomarkers for alzheimer's disease progression |
| WO2008153692A2 (en) * | 2007-05-22 | 2008-12-18 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Microrna expression profiling of cerebrospinal fluid |
| EP2155911B1 (en) | 2007-05-23 | 2013-08-28 | Dharmacon, Inc. | Micro-RNA scaffolds, non-naturally occurring micro-RNAs, and methods for optimizing non-naturally occurring micro-RNAs |
| US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| WO2009009439A2 (en) | 2007-07-06 | 2009-01-15 | The Regents Of The University Of California | Snps associated with fatty acid composition of bovine meat and milk |
| WO2009009457A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Alzheimer's disease-specific micro-rna microarray and related methods |
| CN101755208B (zh) * | 2007-07-25 | 2014-05-07 | 路易斯维尔大学研究基金会公司 | 作为诊断标记物的外来体相关微rna |
| DK2182983T3 (da) | 2007-07-27 | 2014-07-14 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Behandling af amyloidogene sygdomme med humaniserede anti-abeta antistoffer |
| TR201802758T4 (tr) | 2007-08-22 | 2018-03-21 | Trovagene Inc | In vivo hücre ölümünün saptanmasına yönelik miRNA kullanmanın yöntemleri. |
| AU2008298744B8 (en) | 2007-09-14 | 2015-01-15 | The Ohio State University Research Foundation | MiRNA expression in human peripheral blood microvesicles and uses thereof |
| US8414893B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-04-09 | Amgen Inc. | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
| US20110160290A1 (en) | 2008-05-21 | 2011-06-30 | Muneesh Tewari | Use of extracellular rna to measure disease |
| CN101386848A (zh) * | 2008-08-12 | 2009-03-18 | 南京大学 | 细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用 |
| CN107254538A (zh) * | 2008-11-12 | 2017-10-17 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 | 使用外来体来确定表现型的方法和系统 |
| US8637525B2 (en) | 2009-07-31 | 2014-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Compounds for the reduction of beta-amyloid production |
| EP2287336A1 (fr) * | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Exhonit Therapeutics SA | Procédés et méthodes de diagnostic de la maladie d'Alzheimer |
| JP5902088B2 (ja) * | 2009-09-10 | 2016-04-13 | フレミング・ヴェリンＦｌｅｍｍｉｎｇ ＶＥＬＩＮ | マイクロｒｎａの製造方法およびその治療的応用 |
| US8648017B2 (en) | 2009-11-04 | 2014-02-11 | Diamir, Llc | Methods of using small RNA from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases |
| GB201011420D0 (en) | 2010-07-06 | 2010-08-18 | United Arab Emirates Universit | Method for diagnosis |
| SG188338A1 (en) | 2010-09-22 | 2013-04-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | 4,7-DIHYDRO-PYRAZOLO[1,5-a]PYRAZIN-6-YLAMINE DERIVATIVES USEFUL AS INHIBITORS OF BETA-SECRETASE (BACE) |
| CA2823621C (en) | 2010-12-30 | 2023-04-25 | Foundation Medicine, Inc. | Optimization of multigene analysis of tumor samples |
| US8945829B2 (en) | 2011-03-22 | 2015-02-03 | Cornell University | Distinguishing benign and malignant indeterminate thyroid lesions |
| US9023359B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-05-05 | Kymab Limited | Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
-
2012
- 2012-06-26 BR BR112013033488A patent/BR112013033488B8/pt active IP Right Grant
- 2012-06-26 JP JP2014518915A patent/JP6154809B2/ja active Active
- 2012-06-26 WO PCT/US2012/044202 patent/WO2013003350A2/en active Application Filing
- 2012-06-26 ES ES12750628.5T patent/ES2580379T3/es active Active
- 2012-06-26 CA CA2840196A patent/CA2840196C/en active Active
- 2012-06-26 EP EP12750628.5A patent/EP2723894B1/en active Active
- 2012-06-26 CN CN201280041358.8A patent/CN103781919B9/zh active Active
- 2012-06-26 MX MX2013015392A patent/MX341840B/es active IP Right Grant
- 2012-06-26 US US14/128,888 patent/US9771617B2/en active Active
- 2012-06-26 KR KR1020147001923A patent/KR102082016B1/ko active IP Right Grant
- 2012-06-26 RU RU2014102357A patent/RU2639509C2/ru active
- 2012-06-26 AU AU2012275556A patent/AU2012275556B2/en active Active
-
2013
- 2013-12-19 IL IL230034A patent/IL230034B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-08-01 JP JP2016150989A patent/JP2016214256A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103781919A (zh) | 2014-05-07 |
| AU2012275556B2 (en) | 2016-02-04 |
| US9771617B2 (en) | 2017-09-26 |
| RU2014102357A (ru) | 2015-08-10 |
| AU2012275556A1 (en) | 2013-05-02 |
| CA2840196C (en) | 2022-09-20 |
| EP2723894A2 (en) | 2014-04-30 |
| MX341840B (es) | 2016-09-05 |
| JP2016214256A (ja) | 2016-12-22 |
| CA2840196A1 (en) | 2013-01-03 |
| RU2639509C2 (ru) | 2017-12-21 |
| KR20140044375A (ko) | 2014-04-14 |
| US20140378439A1 (en) | 2014-12-25 |
| BR112013033488B8 (pt) | 2022-11-22 |
| KR102082016B1 (ko) | 2020-02-26 |
| IL230034B (en) | 2021-02-28 |
| CN103781919B (zh) | 2017-07-04 |
| WO2013003350A3 (en) | 2013-04-11 |
| JP2014520529A (ja) | 2014-08-25 |
| EP2723894B1 (en) | 2016-05-11 |
| BR112013033488B1 (pt) | 2022-03-03 |
| BR112013033488A2 (pt) | 2017-03-01 |
| WO2013003350A2 (en) | 2013-01-03 |
| JP6154809B2 (ja) | 2017-06-28 |
| CN103781919B9 (zh) | 2017-09-15 |
| MX2013015392A (es) | 2014-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2580379T3 (es) | Biomarcadores de microARN indicativos de la enfermedad de Alzheimer | |
| JP6730525B2 (ja) | 化学組成物とそれを利用する方法 | |
| ES2956732T3 (es) | Métodos de detección de ácidos nucleicos diana en una muestra | |
| ES2890327T3 (es) | Modelos predictivos basados en miARN para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata | |
| US11230736B2 (en) | Methods for assessing pregnancy outcome | |
| US9677130B2 (en) | Methods to detect and quantify RNA | |
| US20160040253A1 (en) | Method for manufacturing gastric cancer prognosis prediction model | |
| US20140194312A1 (en) | Complex sets of mirnas as non-invasive biomarkers for dilated cardiomyopathy | |
| US20140274789A1 (en) | Complex sets of mirnas as non-invasive biomarkers for psoriasis | |
| KR101992539B1 (ko) | miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법 | |
| JP5258760B2 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
| WO2019012542A1 (en) | DETECTION OF SPECIFIC DNA FROM A FABRIC | |
| US11466323B2 (en) | Dual-probe digital droplet PCR strategy for specific detection of tissue-specific circulating DNA molecules | |
| US20170130267A1 (en) | Methods for predicting acute rejection in heart recipients | |
| Anand | Using PNA Probes for Hybridization-Based Analysis of miRNAs in Capillary Electrophoresis | |
| US20130331278A1 (en) | Complex set of mirnas as non-invasive biomarkers for prostate diseases | |
| KR20230055951A (ko) | miR-625-3p의 건선 중증도 진단용 바이오마커로서의 용도 | |
| AU2013204118A1 (en) | MicroRNA biomarkers indicative of Alzheimer's Disease |