TR201802758T4 - In vivo hücre ölümünün saptanmasına yönelik miRNA kullanmanın yöntemleri. - Google Patents

Abstract

Yaygın ve dokuya spesifik miRNA'ların düzeyleri ölçülerek in vivo hücre ölümünün saptanmasına dair invazif olmayan yöntemler açıklanır. Yöntem, hücre ölümünden kaynaklanan veya buna eşlik eden patolojilerin saptanmasına yönelik aynı zamanda farklı kimyasal veya fiziksel etkenler tarafından indüklenen bulaşıcı hastalığın, sitotoksik etkilerin ve spesifik fetal anormalliklerin varlığının diyagnozuna yönelik olarak uygulanabilir.

Description

Tarifnamenin bir açisinda ilgili bir miRNA, kan, amniyonik sivi, beyin- omurilik sivisi, plazma, süt, semen, serum, salya, tükürük ve üre gibi bir vücut 01 847-P-0001 sivisinda saptanabilir. Mevcut bulusun bir açisinda miRNA, üre içinde saptanir.

Bir diger düzenlemede miRNA, serum içinde saptanir.

Mevcut bulusun miRNA izolasyonunun mevcut yöntemi, ticari olarak mevcut anyon degisimli materyalleri kullanabilir. Güçlü veya zayif anyon degistiricileri kullanilabilir. Adsorpsiyon ve elüzyona yönelik seçilen solüsyonlar kullanilarak miRNA saflastirilabilir, konsantre edilebilir ve önemli ölçüde izole edilebilir.

Anyon degisimli kolon materyallerine miRNA”nin ilk baglanmasina yönelik bilindik iyonik kuvvette bir solüsyon kullanilarak, proteinler (zayif sekilde bagli kirletici maddeler) gibi diger elektronegatif moleküller dahil olmak üzere suda çözülebilir bilesenlerin çogu, kolon araciligiyla yikanabilir. Elüzyona yönelik olarak gereken iyonik kuvvete, nükleik asitlerin tamamen ayrisacagi en düsük iyonik kuvvete ideal olarak karsilik gelen pH”yi kontrol etmek üzere bir tampon ile karistirilabilen NaCI gibi bir tuzun bilindik konsantrasyonlari kullanilarak ulasilir. Nükleik asitlerden daha yüksek sertlige sahip anyon degisimli reçineye bagli kontamine edici maddeler bu sekilde, kolon içinde birakilabilir, diger bir deyisle, daha kuvvetli baglanan kirletici maddeler, nükleik asitlerden ayrilir.

Tercih edilen bir zayif degistirici, içinde primer, sekonder veya tersiyer amino gruplarinin (diger bir deyisle, proton eklenebilir aminler) degisim yerleri saglayabildigi degistiricidir. Güçlü baz anyon degistiricisi, degisim yerleri olarak kuaterner ainonyum gruplarina (diger bir deyisle, proton eklenemez ve daima pozitif yüklü) sahiptir. Degistiriciler, ayrilan miRNAsya yönelik ilgili absorpsiyon ve elüzyon iyonik kuvvetleri ve/veya pH”lerine göre seçilir. Solüsyon kuvvetleri, baglama kuvvetlerinden daha yüksektir.

Bulusun bir açisinda bir yöntem, üreden tranrenal miRNAinin izolasyonuna yönelik olarak saglanir, yöntem, bir özneden elde edilen ürenin saglanmasi; filtreleme veya santrifüjleme yoluyla üreden hücrelerin ve hücre artiklarinin istege bagli olarak ayrilmasi; üreye EDTA ve Tris-HCI”n1n eklenmesi, üreye silika 01 847-P-0001 içermeyen anyon degisimli reçinenin eklenmesi, karisimin inkübe edilmesi, üreden anyon degisimli ortamin giderilmesi ve reçineden miRNA,nin ayristirilmasini içerir. Üreden miRNA”n1n izole edilmesi yönteminin bir düzenlemesinde, üreye eklendikten sonra EDTA ve Tris-HCI konsantrasyonu, 10-100 mM araligindandir ve solüsyonun pH degeri, yaklasik 8.0 ile yaklasik 8.5 arasindadir.

Bir diger düzenlemede vücut sivisi istege bagli olarak, anyon degisimli ortam üzerinde adsorpsiyondan önce bir membran araciligiyla önceden filtrelenir.

Bir diger düzenlemede anyon degisimli ortam, katyonik kuaterner amonyum gruplari ile islevsel hale getirilen bir sefaroz bazli reçinedir Katyonik amonyum gruplari ile islevsel hale getirilen sefaroz bazli reçinelerin örnekleri, Q- SepharoseTM ANX-4 SepharoseTM Fast Flow, DEAE-Sepharose TM ve Q- Sepharose-XLTM DEAE Sepharose Fast Flow”u (GE Healthcare) içerir.

Bir diger düzenlemede anyon degisimli ortam, Q-filtreleri veya Q-reçineleri gibi sefaroz bazli kuaterner amonyum anyon degisimli ortamdan seçilir.

Bulusun bir diger düzenlemesinde anyon degisimli ortam, ayrilan bir tasiyici üzerinde immobilize hale getirilir, burada bu tür bir tasiyici, ortam/nükleproteine bagli kompleksin tasinmasina veya saklanmasina yönelik olarak kullanilabilen bir kolon, tüp veya tasinabilir filtreleme sistemidir.

Mevcut bulusun bir diger düzenlemesinde örnegin ayni kisinin üre numunelerinde mevcut miRNA dizilerinin periyodik analizi, belirli bir organ veya dokuda bir patolojik proses hakkinda erken bilgi verebilir. Örnegin miRNA122, sadece karacigerde sentezlenir ve miktarindaki artislar, hepatit veya diger karaciger patolojisinin bir markörü olabilir. Alzheimer sendromu, nöronlarda spesifik olarak ifade edilen miRNA“nin konsantrasyonundaki artislara eslik edebilir. 01 847-P-0001 Bir diger düzenlemede, hastanin bedensel sivi numunesinde dokuya spesifik miRNAlnin daha detayli izlenmesi, hastaligin siddetinin tahminine yönelik ve terapötik tesebbüslerin etkililiginin degerlendirilmesine yönelik olarak kullanisli olacaktir.

Aksi iddia edilmedikçe burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bu bulusun ait oldugu teknikte uzman biri tarafindan yaygin olarak anlasildigi üzere ayni anlama sahiptir. ÖRNEKLER Örnekler, bulusun çesitli düzenlemelerini daha bütünüyle göstermek amaciyla gösterilir. Bu örnekler herhangi bir sekilde, ekli istemlerde belirtilen bulusun kapsamini sinirlayici olarak düsünülineinelidir.

Ureden miRNA9nin Ozütlenmesi: Üre toplama: Bu deneylere yönelik hastalardan veya gönüllülerden üre numuneleri, steril l 10 ml”lik bir üre toplama kabi içinde toplanmistir ve 10 ile 150 mM arasinda, tercihen 50 mM nihai konsantrasyona kadar EDTA ile hemen takviye edilmistir. Numuneler, -80°C'de 10 - 50 ml°de saklanmistir. Ürenin istege bagli Iiltrelenmesi, EDTA,nin eklenmesinden önce numune toplamanin hemen sonrasinda StericupTM (Millipore, Vacuum Driven Filtration System, 045 u DuraporeTM filtresi) üzerinde gerçeklestirilmistir.

Q Baglanma: 50 mlalik bir tüp içinde 20 mLslik üre, 50 mM EDTA (pH 8.0) ve takviye edilen ve oda sicakliginda 10 - 30 dakika sert sekilde karistirilan 50 mM Tris-HCFnin (pH 8.0) esit hacmi ile seyreltilmistir. Bagli nükleik asitler ile 01 847-P-0001 reçine, bir salincak kovali rotor kullanilarak bir masa üstü klinik santrifiij içinde oda sicakliginda 5 dakika 2000g”de santrifujleme yoluyla toplanmistir. ~ 500 ul üst faz disinda tamami, havalandirma yoluyla çikarilmistir. Reçine peleti, geriye kalan üst faz içinde yeniden süspanse edilmistir ve vakumun santriûijlenmesi yoluyla çalistirilan bir Mikro Bio-Spin Kromatografi Kolonu (Bio-Rad) veya es degerine aktarilmistir. Kolon içindeki reçine, 500 ul 2xSSC (300 mM NaCL/30 mM sodyum sitrat (pH 7.0)) ile veya kiyaslanabilir iyonik kuvvetli tampon (örnegin ile üç kez yikanmistir. Nükleik asit, yüksek iyonik kuvvetli Q-Sefarozdan (örnegin 1M NaCl veya LiCl) ayristirilabilir ancak asagida açiklanan yöntemler, RNAiyi daha iyi korur.

O-SepharoseTM ve TRIzolTM Faz Avirmadan Elüzyon: Bagli nükleik asitler, 500 ul TRIzolTM reaktifi (Invitrogen) ile ayrica ayristirilmistir. TRIZOPden nükleik asitlerin özütlenmesi, imalatçinin tavsiyelerine göre gerçeklestirilmistir. Kisaca faz ayrimina yönelik TRIzol eluati, 100 ul kloroform ile takviye edilmistir, güçlü sekilde karistirilmistir, 3 - 5 dakika oda sicakliginda inkübe edilmistir ve 4°C,de faz, yeni bir santritîij tüpü içine aktarilmistir. Akabinde nükleik asitler çökeltilmistir veya ilave olarak temizlenmistir ve bir silika kolonu üzerinde tuzundan arindirilmistir.

Nükleik asit çökeltmesi':Nükleik asit çökeltmesine yönelik olarak yukarida açiklanan çökeltme, 1 ul 20 mg/mL glikojen (Roche) ve 300 ul %100 izopropil alkol ile takviye edilmistir. Nükleik asitler, santrifüjleme yoluyla toplanmistir, pelet, 200 ul %70 etanol ile iki kez yikanmistir, oda sicakliginda 5 dakika kurutulmustur ve akabinde nükleik asitler, 30 nl 0.1 mM EDTA/ 1x RNA Secure (Ambion) içinde çözünmüstür. Numuneler, herhangi bir kalinti RNaz aktivitesini inaktive etmek üzere 10 dakika 60 °C7de inkübe edilmistir.

Nükleik asitlerin Silika Kolonu ile temizlenmesi.' Bir silika kolonuna (Qiagen PCR temizleme kolonlari veya es degeri) baglanmaya yönelik %96 etanolün 3 hacmi, 01 847-P-0001 TRIzol üst fazdan nükleik asit preparatina eklenmistir ve oda sicakliginda inkübasyondan 3 dakika sonra karisim, kolon üzerine yüklenmistir. Kolon, 500 ul 2 M LiCl/%80 etanol ile iki kez ve 500 iil %80 etanol ile iki kez yikanmistir.

Nükleik asitler, 50 pl 0.] mM EDTA/lX RNA Secure (Ambion) ile ayristirilmistir. Numuneler, herhangi bir kalinti RNazi inaktive etmek üzere 10 dakika 60 °Cide inkübe edilmistir.

DNaz I ve RNaz A Sindirimi: Yukarida açiklanan protokol ile üreden özütlenen materyalin nükleik asit kimligini dogrulamak üzere mevcut preparat, DNaz l ve/veya RNaz A ile sindirilmistir. DNaz I sindirimi, RNaz içermeyen DNaz I“in (NEB) 2 birimini içeren DNaz I Reaksiyon Tamponu (NEB) içinde gerçeklestirilmistir. RNaz A sindirimi, 50 ng/mL kaynatilmis RNaz A ile takviye edilen TE tamponu içinde gerçeklestirilmistir. Numuneler, 60 dakika 37 °C”de inkübe edilmistir ve yükleme boyasinin eklenmesinden sonra numuneler, %5 poliakrilamid 1x TBE jelleri üzerinde elektroforeze maruz birakilmistir ve ile boyanmistir. Sekil 17de gösterildigi üzere izole materyal, düsük moleküler agirlikli nükleik asitleri, agirlikli olarak RNA ve bunlarin parçalarini temsil eder. Ek olarak (bakiniz Sekil 1) karsilastirmaya yönelik olarak, Q-reçineden nükleik asitler, 3 M NaCl (seritler 2 ve 3) ve TrizolTM (seritler 4 ve 5) ile ayristirilmistir.

Sekil l,de seritler 1 ve 5, sirasiyla Q-Sefarozdan yüksek tuz ve TriZol elüzyonu ile nükleik asitleri temsil eder; seritler 2 ve 6; 3 ve 7; 4 ve 8, sirasiyla DNaz, RNaz veya DNaz arti RNaz ile muameleden sonra nükleik asitleri temsil eder.

Ayrica RNA,nin mevcudiyetini ve moleküler boyutunu göstermek üzere, saIlastirilmis nükleik asitlerin RNA alikotlari DNazl ile sindirilmistir (seritler 3 ve 01 847-P-0001 Serumdan RNAinin Özütlenmesi Bu deneylere yönelik olarak 1.2 ml TRIzol LS, 0.4 mlilik seruma eklenmistir ve karisim, 14,000 rpm'de santrifüjlenmistir (10). Üst faz, bir 2 mlilik Eppendorf tüpü içine aktarilmistir, 0.3 ml kloroforrn eklenmistir ve karisim, 15 saniye çalkalanmistir. 15 dakika 14,000”de santrifüjlemeden sonra üst faz, bir 5 ml”lik tüp içine aktarilmistir ve etanol, %70ilik nihai konsantrasyona kadar eklenmistir.

Karisim, bir vakum vakum manifoldu üzerinde bir Quiagen Quick kolonu üzerine yüklenmistir ve kolon, 0.5 ml 2M LIG-%80 EtOH ile iki kez, 0.5 ml %80 etanol- 80 mM sodyum asetat (pH 5.0) ile ve son olarak 0.5 ml %95 etanol ile bir kez yikanmistir. Kolon, 14,000 rpm”de 3 dakika 1.5 ml Eppendorf tüpü içinde santrifüjlenmistir ve RNA, 40 pl H20 ile ayristirilmistir.

Bu Örnek, ölen hücrelerden miRNA°nin böbrek bariyerini geçtigini ve bir hastanin üresi içinde saptanabildigini gösterir. Üre içinde insan miRNA moleküllerinin saptanmasi Bu Örnekte analiz edilen mikro RNA türleri, üç farkli tür diger bir deyisle, tüin dokularda veya birçok dokuda ifade edilen yaygin miRNAilar, dokuya spesifik miRNA*lar ve içinde ifadenin, belirli bir doku veya hücre tipinde önemli ölçüde degistirildigi miRNAslar halinde gruplanabilir. Tablo 1 ile gösterildigi üzere 20 farkli miRNA, 16 saglikli gönüllü ve kayitli donörün üresinden elde edilmistir ve akabinde, ticari olarak mevcut miRNA ifade analiz kiti (ABI) kullanilarak gerçek zamanli RT-PCR ile saptanmistir. Karsilik gelen sentetik miRNA oligonükleotitler, standartlar olarak kullanilmistir. Reaksiyonlar, tedarikçi tarafindan önerildigi üzere kati bir sekilde gerçeklestirilmistir.

Tablo 1. Saptanan miRNA 01 847-P-0001 Beyinde fazla üretilmistir Beyinde fazla üretilmistir Beyne spesifiktir Beyinde fazla üretilmistir Yaygin, Beyinde fazla üretilmistir Beyne spesifîktir Beyne spesifîktir Beyinde fazla üretilmistir Beyin, Tiroit 01 847-P-0001 Beyin ve diger birçok doku Beyne spesifiktir Karacigere spesifiktir Kalp ve Kasta asiri üretilmistir Kalp ve Kasta asiri üretilmistir Yaygin Yaygin Ince bagirsak ve kolonda asiri üretilmistir Plasentada asiri üretilmistir 01 847-P-0001 Plasentada asiri üretilmistir Plasentada asiri 51 8 üretilmistir miRNAlnin tüm üç türü, üriner RNA”nin çogu preparati içinde saptanmistir. En yüksek kopya sayisi, yaygin miRNAHiin özelligi olmustur. Ancak dokuya spesifik miRNA veya belirli bir doku veya hücre tipinde asiri üretilen miRNA ayrica saptanabilir olmustur. Ölen hücrelerden miRNAsnin bir kisminin bozunmadigi ancak kan akisi içinde görüldügü ve son olarak üre içine salgilandigi tartismasiz sekilde gösterilmistir. Örnek, insan nazofarinjeal karsinom (NPC) hücrelerinden miRNA7nin, hastanin böbrek bariyerini geçebildigini ve gerçek zamanli RT-PCR ile hastanin üresinde saptanabildigini gösterir. Üre içinde Virüs tijrevli miRNA Bazi virüslerin ayrica miRNAîari kodladigi ve ürettigi bilinir. Epstein-Barr virüsünün (EBV), nazofarinjeal karsinomun (NPC) gelisiminde yer almasi nedeniyle mevcut sistem, NPC7den viral miRNAinin, bir hastanin üresine ulasip ulasmadigini ve burada saptanip saptanmadigini bulmak üzere kullanilmistir. NPC hastalarindan üre numuneleri, bu basvurunun Örnek 1`inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklanmistir. EBV enfeksiyonu, üre içinde virüse spesifik DNA dizilerinin saptanmasi yoluyla dogrulanmistir. Saglikli donörlerden toplanan 01 847-P-0001 üre, EBV,ye spesifik DNA dizilerine yönelik olarak negatif olmustur. Iki EBVSye spesifik miRNA (BART, bu çalismada analiz edilmistir: BART3-3P CGC ACC ACU AGU CAC CAG GUG U SEQ ID NO 21 BART1-3P UAG CAC CGC UAU CCA CUA UGU CU SEQ ID NO 22 Ters transkripsiyon, 15 ;ilde gerçeklestirilmistir, RT reaksiyonunun onda biri, Sigmadan JumpStart DNA polimerazi kullanilarak PCR amplifikasyonuna maruz birakilmistir. Asagidaki primerler, 500 nM konsantrasyonda kullanilmistir: Ürünler, %15 poliakrilamid je (PAAG) içinde analiz edilmistir.

Sekil 2 ile gösterildigi üzere BART3 ve BART 1 miRNA türleri, NPC hastalarindan üre içinde saptanmistir ancak saglikli bir donörden üre nuinunesi içinde saptanmamistir. Bu veri tekrar, üriner sistemin disinda konumlanan ölen hücrelerden miRNA,nin, üre içinde saptanabildigini gösterir. Sekil 2,de serit l, markörleri temsil eder; seritler 2 ve 3, nazofarinjeal karsinomlu hastalari temsil eder; seritler 4 ve 5, kontrol hastalarini temsil eder ve serit 6, ilgili sentetik miRNAllari temsil eden pozitif kontrolü temsil eder. 01 847-P-0001 Bu örnek, felçten kaynaklanan nöronal ölümün, hastalarin üresi içinde nörona spesifik miRNAinin konsantrasyonlarinin ölçümleri yoluyla in vi'vo kaydedilebildigini gösterir.

Beyin felç diyagnozu Bu deneylere yönelik olarak beyin felçli hastalar, beyne spesifik miRNA veya felçten sonra beyinde asiri üretilen miRNAsnin konsantrasyonlarindaki degisikliklerin analizine yönelik olarak ineelenmistir. Mevcut olarak, bu miRNAllarin hangi beyin hücre türünde ve hangi beyin bölgesinde ifade edildiginin bilinmesi nedeniyle 9 farkli beyne Spesifik miRNA çalisilmistir.

Hastalar: Üre numuneleri, acil servis bölümü araciligiyla bir hastanede kabul edilen hastalardan toplanmistir. Beyin felcinin diyagnozu, klinik semptomlara bagli olmustur. Üre numuneleri, felçten 12 veya 24 saat sonra toplanmistir.

Kontrol üre numuneleri, felç semptomlari olmaksizin yas eslemeli gönüllüler tarafindan verilmistir. Numuneler, bu basvurunun Örnek l'inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklaninistir. miRNA türleri: üreden alinan miRNA, Örnek l,de açiklanan prosedüre göre özütlenmistir. 675 ul üreden izole edilene es deger bir RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminin 1/10,una, imalatçi tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zamanli PCR yapilmistir. Elde edilen veriler, üre içindeki kreatinin konsantrasyonu basina yeniden hesaplama yoluyla ayri böbrek filtreleme oranlarina yönelik olarak normalize edilmistir. Bu deneylere yönelik olarak, ayni yas grubundan saglikli donörlerden toplanan üre numuneleri, taban çizgi olarak kullanilmistir. Farkli miRNA türleri, asagidaki gibi gösterilir: 01 847-P-0001 hsa-mir-128a hsa-mir-9 hsa-mir-127 hsa-mir- 137 hsa-mir- l 29 hsa-mir-2 19 hsa-mir-2 l 8 Sekiller 3A ila 3G'de kisaca açiklanan sonuçlar, beyin felcinden sonra, beyin hücre ölümünün kinetiklerini yansitan birçok beyne spesifik miRNA°nin (12821, Bu örnek, felçten sonra hastanin üresindeki miRNA konsantrasyonlarina ait kinetiklerin, hastalik sonucu hakkinda bilgi sagladigini gösterir.

Beyin felcini izleme Deneylere yönelik olarak beyin felçli hastalar, beyne spesifik miRNA konsantrasyonlarindaki degisiklikler arasindaki korelasyonun ve hastalik gelisiminin analizine yönelik olarak incelenmistir.

Hastalar: Üre numuneleri, acil servis bölümü araciligiyla bir hastanede kabul edilen hastalardan toplanmistir. Beyin felcinin diyagnozu, klinik semptomlara ve MR] analizine bagli olmustur. Üre numuneleri, felçten 12, 24, 48 veya bir hafta saat sonra toplanmistir. Hastanin klinik durumu, felçten 30 gün sonra degerlendirilmistir. Kontrol üre numuneleri, felç semptomlari olmaksizin yas eslemeli gönüllüler tarafindan verilmistir. Nuinuneler, bu basvurunun Örnek l,inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklanmistir. 01 847-P-0001 miRNA türleri: üreden alinan miRNA, Örnek lsde açiklanan prosedüre göre özütlenmistir ve TaqMan miRNA analizleri (Applied Biosystems) ile analiz edilmistir. 400 yil üreden izole edilene es deger bir RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminrn 1/10°una, imalatçi tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zainanli PCR yapilmistir. Elde edilen veriler, üre içindeki kreatinin konsantrasyonu basina yeniden hesaplama yoluyla ayri böbrek filtreleme oranlarina yönelik olarak normalize edilmistir. Bu deneylere yönelik olarak, ayni yas grubundan saglikli donörlerden toplanan üre numuneleri, taban çizgi olarak kullanilmistir.

Sekiller 4A ve B,de kisaca açiklanan sonuçlar, beyin felcinden sonra Tr-miRNA 129 ve Tr-miRNA 219'daki degisikliklere ait dinamiklerin, farkli hastalarda farkli oldugunu ve hastalik gelisimi ile iliskili oldugunu açik sekilde gösterir. Hasta kötülesmeye karsilik gelir. Ayni zamanda transrenal nörona spesifik miRNA'sinin, normallesmeye karsi egilimi olan iki hasta, önemli gelisme göstermistir.

Alzheimer hastaliginin divagnozu Alzheimer hastaligi, özellikle beyin zari ve hipokampüsteki nöronlarin ölümünden kaynaklanan bir ilerleyen nörolojik hastaliktir. Diyagnoz, nörolojik incelemeye ve demansin diger kaynaklarinin ortadan kaldirilmasina bagliyken tanimlayici diyagnoz, sadece otopside yapilabilir. Mevcut bulus, Alzheimer hastaligini karakterize eden asiri nöronal ölümün, hastanin üresinden izole edilen spesifik beyin miRNAilarinin düzeylerinin ölçülmesi yoluyla izlenebildigini gösterir.

Bu deneylere yönelik olarak Alzheimer hastaligi ile teshis edilen hastalar, nöronal 01 847-P-0001 ölümün bir sonucu olarak beyne spesifik veya asiri üretilen miRNA°nin konsantrasyonlarindaki degisikliklerin analizine yönelik olarak incelenmistir.

Hastalar: Üre ve serum numuneleri, Alzheimer hastaliginin çesitli evreleri ile teshis konulan hastalardan toplanmistir. Kontrol üre ve serum numuneleri, Alzheimer hastaliginin semptomlari olmaksizin yas eslemeli gönüllüler tarafindan verilmistir. Numuneler, bu basvurunun Örnek l'inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklanmistir. Bazi üre numuneleri, hücreleri ve hücre artiklarini silmek üzere Örnek 1'de açiklandigi üzere toplamadan sonra filtrelenmistir. miRNA türleri.' Üre ve serumdan alinan RNA, Örnek l”de açiklanan prosedüre göre özütlenmistir.

Bir dizi deneyde 750 pl üreden izole edilene es deger bir RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminin 1/ 10”una, imalatçi (Applied Biosystems) tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zamanli PCR yapilmistir. Elde edilen veriler, üre içindeki kreatinin konsantrasyonu basina yeniden hesaplama yoluyla ayri böbrek filtreleme oranlarina yönelik olarak normalize edilmistir. Sekil 5, birçok beyne spesifik miRNA”ya ait konsantrasyonlarin, Alzheimer hastalarinin üresinde arttigini açik sekilde gösterir.

Bir diger deneyler dizisinde filtrelenen üre veya serumdan izole RNA analiz edilmistir. 0.6 ml üreden veya 50 pl serumdan izole edilene es deger bir RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminin 1/109una, imalatçi (Applied Biosystems) tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zamanli PCR yapilmistir. Üriner miRNAsya yönelik olarak elde edilen veriler, üre içindeki kreatinin konsantrasyonu basina yeniden hesaplama yoluyla ayri böbrek filtreleme oranlarina yönelik olarak normalize edilmistir. Plazma miRNA7ya yönelik olarak elde edilen veriler, yaygin miRNA- 16 basina norrnalize edilmistir. Sekiller 6 ve 7, bazi nörona spesifik miRNA 01 847-P-0001 düzeylerinin, yas eslemeli kontrollere kiyasla Alzheimer hastalarinin filtrelenen üre ve serumunda daha yüksek oldugunu gösterir.

Parkinson hastaligi Parkinson hastaligi, motor becerilerinden ve konusinadan sikayet edenleri siklikla olumsuz etkileyen bir merkez sinir sistemi dejeneratif bozuklugudur. Mevcut bulus, Parkinson hastaligini karakterize eden dopaminerjik nöronlarin asiri selüler ölümünün, hastanin üresinden izole edilen spesifik beyin miRNA°larinin düzeylerinin ölçülmesi yoluyla izlenebildigini gösterir.

Bu deneylere yönelik olarak Parkinson ile teshis edilen hastalar, nöronal ölümün bir sonucu olarak beyne spesifik miRNA veya asiri üretilen miRNA”nin konsantrasyonlarindaki degisikliklerin analizine yönelik olarak incelenmistir.

Hastalar: Üre numuneleri, Parkinson hastaliginin çesitli evreleri ile teshis konulan hastalardan toplanmistir. Kontrol üre numuneleri, Parkinson hastaliginin semptomlari olmaksizin yas eslemeli gönüllüler tarafindan verilmistir.

Numuneler, bu basvurunun Örnek l”inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklanmistir. miRNA türleri.' Bu deneylere yönelik olarak, üreden alinan RNA, Örnek lade açiklanan prosedüre göre özütlenmistir. 750 ul üreden izole edilene es deger RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminin 1/109una, imalatçi (Applied Biosystems) tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zamanli PCR yapilmistir. Elde edilen veriler, üre içindeki kreatinin konsantrasyonu basina yeniden hesaplama yoluyla ayri böbrek filtreleme oranlarina yönelik olarak normalize edilmistir. Sekil 8, birçok beyne 01 847-P-0001 spesifik miRNA”ya ait konsantrasyonlarin, Parkinson hastaligina sahip hastalarin üresinde arttigini gösterir.

Karsilastirmali Örnek 8: Gebelik ile Ilgili veya Fetal Hastaliklara yönelik Dogum Öncesi Test miRNA moleküllerine yönelik böbrek bariyerinin geçirgenligine dair temel bulgu, dogustan hastaliklarin tamamen invazif olmayan dogum öncesi diyagnozunu gerçeklestirmek üzere matemal ürenin kullanimina yönelik bir yöntem sunar.

Asagidaki sekilde bu tür invazif olmayan bir tarama gerçeklestirilebilir.

Ilk olarak ürenin bir numunesi, bir gebe hastadan toplanir. Istendiginde üre numunesi içindeki miRNA akabinde, yukarida açiklanan yöntemler kullanilarak bozunumu önlemek üzere izole edilir, saflastirilir ve/veya muamele edilir.

MIRNA profilleme akabinde, kantitatif PCR kullanilarak gerçeklestirilir veya miRNA dizilimi ve elde edilen veriler, yukarida diger patolojilere yönelik olarak açiklandigi üzere farkli fetal patoloj ileri belirlemek üzere kullanilir.

Karsilastirmali Örnek 9: Down sendorumu Deneylere yönelik olarak, normal ve Down sendromlu fetüsler ile gebe kadinlar arasinda maternal üredeki beyne spesifik miRNA konsantrasyonlarindaki farklar incelenmistir.

Hastalar: Üre numuneleri, amniyosentez yoluyla Down sendromu ile teshis edilen gebe kadinlardan toplanmistir. Kontrol üre numuneleri, normal gebelikler ile yas esleineli kadinlar tarafindan verilmistir. Numuneler, bu basvurunun Örnek 1,inde açiklanan prosedürlere göre toplanmistir ve saklanmistir. 01 847-P-0001 miRNA türleri: üreden alinan miRNA, Örnek lsde açiklanan prosedüre göre özütlenmistir. 750 pl üreden izole edilene es deger bir RNA miktarina, ters transkripsiyonlu PCR yapilmistir ve RT-PCR karisiminin 1/10,una, imalatçi tarafindan saglanan protokol kullanilarak gerçeklestirilen son gerçek zamanli PCR yapilmistir. Elde edilen veriler, plasentaya spesifik miRNA 518 basina normalize edilmistir. Sekil 9, ilgili kontrollere kiyasla yetersiz hücre ölümü gösteren normal hamilelikler ile kadinlarin üresine kiyasla Down sendromlu fetüsler ile hamile kadinlarin üresinde beyne spesifik miRNA 9°un daha düsük konsantrasyonunu gösterir.

Claims (12)

ISTEMLER

1. In vi'vo hücre ölümünü saptamaya ve ölçmeye yönelik bir yöntemdir, yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) bir hastadan bedensel sivinin bir numunesinden elde edilen hücresiz nükleik asitlerdeki spesifik miRNA dizilerinin düzeylerinin analiz edilmesi, burada bedensel sivi numunesi, kan, seium ve üreden seçilir, söz konusu miRNA dizileri, in vi'vo hücre ölümünü gösterir ve hastanin vücudu boyunca ölen hücrelerden olusur; ve (b) hastada bir hastaligin veya anormal tibbi kosulun durumunun belirlenmesi, burada söz konusu hastalik veya anormal tibbi kosul sunlardir: (i) bir patojen enfeksiyon, tercihen burada patojen bir virüstür ve daha tercihen burada virüs, bir Epstein-Barr virüsüdür; (ii) bir beyin felci; (iv)Parkinson hastaligi.

2. Istem l'e göre bir yöntemdir, burada söz konusu hastalik, bir doku veya organda asiri veya yetersiz hücre Ölümü ile iliskilendirilen bir bozukluktur, istege bagli olarak burada asiri veya yetersiz in vivo hücre ölümü, belirli dokunun bir bozuklugu ile iliskilendirilir.

3. lstem l'e göre göre bir yöntemdir, burada söz konusu in vivo hücre ölümü, belirli bir dokunun ve/veya organin bir bozuklugu ile iliskilendirilir.

4. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntemdir, burada söz konusu analiz etme adimi, söz konusu spesifik miRNA dizilerinin bir parçasina önemli ölçüde tamamlayici olan bir primer ve/veya prob ile söz konusu miRNA dizilerinin saptanmasini içerir.

Istem l'e göre bir yöntemdir, burada söz konusu analiz etme adimi, hibridizasyon, döngüsel prob reaksiyonu, polimeraz zincir reaksiyonu, iç içe polimeraz zincir reaksiyonu, tek iplikli konformasyon polimorfizmlerini analiz etmek üzere PCR ve ligaz zincir reaksiyonundan olusan gruptan seçilen bir teknigi içermesidir.

Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntemdir, ayrica söz konusu üre numunesindeki nükleik asit bozunumun azaltilmasi adimi içerir.

Istem 63ya göre bir yöntemdir, burada söz konusu üre numunesindeki nükleik asit bozunumunun azaltilmasi adimi, RNAz inhibitörünün (inhibitörler) eklenmesi, isi inaktivasyonu veya guanidin-HCI, guanidin izotiyosiyanat, N-lauroilsarkozin ve sodyum dodesilsülfattan olusan gruptan seçilen bir bilesik ile söz konusu üre numunesinin muamele edilmesini içerir.

Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntemdir, burada söz konusu üre numunesi, 12 saatten daha az mesane içinde tutulmustur.

Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntemdir, burada saptanan miRNA dizilerinden en az biri, hsa-miR-129, hsa-miR-218, hsa-miR-219, hsa-iniR-l28a, hsa-miR-l38, hsa-miR-l 34 ve hsa-miR-l24aldan seçilir.

Bir üre nuinunesinde spesifik hücresiz miRNA,larin kantitatif analizi ile bir hastada hastaligin izlenmesinin ve/Veya tedavinin izlenmesinin bir yönteinidir, yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) bir hastadan bir üre numunesinin periyodik olarak elde edilmesi, söz konusu miRNA dizileri, i'ri vi'vo hücre ölümünü gösterir ve hastanin vücudu boyunca ölen hücrelerden olusur; ve (b) önceki istemlerden herhangi birine göre miRNA,nin bir veya daha fazla spesifik dizisine yönelik olarak söz konusu numunenin analiz edilmesi, burada söz konusu analiz etme, prob(lar) ve/veya miRNA*n1n söz konusu spesifik dizilerinin bir parçasina önemli ölçüde tamamlayici olan prob(lar) ile miRNA,nin söz konusu bir veya daha fazla spesifik dizisinin saptanmasini içerir, burada söz konusu hastaligi ve/veya bunun tedavisini izleme asagidakilerdir: (i) bir patojen enfeksiyon, tercihen burada patojen bir virüstür ve daha tercihen burada virüs, bir Epstein-Barr virüsüdür; (ii) bir beyin felci; (iii) Alzheimer hastaligi; veya (iv) Parkinson hastaligi.

11. Bir hastanin vücudundaki spesifik bir hücre tipi, doku veya organdan olusan miRNA°nin saptanmasina ve ölçülmesine yönelik bir yöntemdir, yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) bir hastadan bedensel sivinin bir numunesinden elde edilen hücresiz nükleik asitlerdeki spesifik miRNA dizilerinin düzeylerinin analiz edilmesi, burada bedensel sivi nuinunesi, kan, serum ve üreden seçilir, söz konusu miRNA dizileri, hastadaki spesifik bir hücre tipi, doku veya organdan olusur; ve (b) kronik patolojiyi gösteren spesifik miRNA dizilerinin düzeylerindeki alterasyonlarin veya fiziksel veya kiinyasal ajanlarin sitotoksik etkisinin saptanmasi, burada kronik patoloji, frontotemporal demans, kardiyomiyositlerin ölümü ile iliskilendirilen kronik kalp yetmezligi, akciger hücrelerinin ölümü ile iliskilendirilen amfizem, pankreas beta hücrelerinin ölümü ile iliskilendirilen diyabet tip 1, böbrek hücrelerinin ölümü ile iliskilendirilen gloinerülonefrit ve kronik olarak enfekte olmus organlar veya dokularda hücre ölümünden seçilir.

12. Istem ll”in bir yöntemidir, burada fiziksel veya kimyasal ajanlarin sitotoksik etkisi, kemik ilik hücrelerini öldüren dozlar, gastrointestinal sistemin epitel hücrelerinin ölümüne yol açan dozlar ve beyin nöronlarini öldüren dozlar ile iliskilendirilen radyasyondan ve dogal veya sentetik toksik bilesikler tarafindan indüklenen farkli organ ve dokulardaki hücre ölümü ile iliskilendirilen kimyasal sitotoksisiteden seçilir.