CN116024328A - 外泌体中miRNA在制备神经退行性疾病鉴别诊断及早筛试剂盒中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了外泌体中miRNA在制备神经退行性疾病鉴别诊断及早筛试剂盒中的用途。本发明提供了检测外泌体中miR‑24‑3p、miR‑423‑5p和/或miR‑151a‑3p基因表达量的物质在制备鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品中的应用。本发明开发的神经退行性疾病早筛试剂盒，hsa‑miR‑24‑3p，hsa‑miR‑423‑5p，和hsa‑miR‑151a‑3p指标，具有高敏感性高特异性。因此，该发明的提取方法配合检测指标，由于其微创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反映动态检测阿尔茨海默和血管性痴呆患者的鉴别诊断以及疾病状态，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。

Description

外泌体中miRNA在制备神经退行性疾病鉴别诊断及早筛试剂盒中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及外泌体中miRNA在制备神经退行性疾病鉴别诊断及早筛试剂盒中的用途。

背景技术

《2021年世界阿尔茨海默病报告》显示，全球阿尔茨海默病及其他痴呆患病人数至少有6000万的痴呆患者，到了2050年，这个数字预计将达到1.52亿。其中，有约60-70％为阿尔茨海默病患者。其中全球大约75％的痴呆病例未被确诊，在低收入和中等收入国家更是有高达90％的痴呆病例未被确诊。我国根据2021年人口普查结果显示60岁以上人口有2.6亿，占13.50％。而我国65岁以上人群中阿尔茨海默病患病率为7％，已超1000万，接近全球痴呆患病人数的1/4，居全球之首，预计到2050年将突破4000万。血管性痴呆的发病率约为3％，患者有592万。包括血管性痴呆、阿尔茨海默症在内的老年痴呆类系列疾病的早诊、早干预，在中老年群体中形成巨大的公共卫生问题，也是我国健康中国战略布局的重要方向之一。

由于老年痴呆患者数量的庞大，经济便捷的筛查和鉴别辅助诊断方法尤为重要。为落实《健康中国行动(2019-2030)》计划，2020年8月31日国家卫生健康委办公厅发布《探索老年痴呆防治特色服务工作方案》，标志着我国首部国家层面的老年痴呆防治计划正式出台。普筛、普查、早期筛选出高危人群、患病人群，以及进行准确的早期诊断和鉴别诊断，对于阿尔茨海默和血管性痴呆两大类老年痴呆的精准防控策略至关重要。

对应地，简单便捷且精准的诊断方法研究十分重要。量表神经心理检查的方法受医生专业水平主观影响大，操作时间长，难以普及。临床中脑脊液检测生物标志物操作难以退推广。影像学手段可以用于阿尔茨海默和血管性痴呆辅助诊断，例如经颅多普勒超声(TCD)、头部X射线电子计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)等，这些检测方法价格高，需要贵重的设备，难以普及，且不能反映早期病情。血液检查生物标志物数量有限。综上，上述技术缺点为：1)难以做到阿尔茨海默和血管性痴呆的早期诊断及鉴别诊断；2)检测手段因各种原因不具有普适筛查性；3)检测结果并不具有足够的敏感性与特异性；4)操作的进行对医生要求较高。

液态活检技术正好可以解决这一难题，检测分析体液中的分子，可以做到无创和反复取材。外泌体是具有双层脂质膜结构的直径分布在30-150nm之间的细胞外囊泡，它可将蛋白质、脂质和核酸(miRNA、lncRNA、circRNA)等生物活性分子转移到受体细胞，广泛分布在血液、唾液、母乳或尿液等体液中。外泌体具有穿透血脑屏障的功能，因此可以用于筛选神经退行性疾病的相关疾病生物标志物，且不同于循环肿瘤细胞(CTC)等其他液态活检方式需要新鲜样本才能进行研究，外泌体在保存良好的陈旧样本中仍然形态稳定。

因此，开发出快速有效的外泌体内miRNAs分离和检测方法对于临床应用至关重要。

发明内容

本发明一个目的是提供检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质的用途。

本发明提供了检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品中的应用。

上述应用中，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、血管性痴呆和/或额颞叶痴呆。

或本发明提供了检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品中的应用。

或本发明提供了检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品中的应用。

上述应用中，所述外泌体来源于受试者的体液。

进一步的，上述体液具体为受试者的唾液、血液或尿液。

上述应用中，所述检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质包括特异结合各个基因的抗体或探针，或者特异扩增各个基因的引物对。

上述应用中，所述特异扩增miR-24-3p基因的引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成；

所述特异扩增miR-423-5p基因的引物对由序列5所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成；

所述特异扩增miR-151a-3p基因的引物对由序列6所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成。

上述检测外泌体中各个基因表达量的物质还包括特异扩增内参基因的引物；

上述内参基因为miR181a-5p基因或miR-378a-3p基因。

hsa-miR181a-5p miRNA正向引物(5-3)：ACATTCAACGCTGTCGGTGAGT；

hsa-miR-378a-3p miRNA正向引物(5-3)：AACACGCTGAGATGAAGCACTG；

通用反向(下游)引物(5'-->3')：CAGTGCAGGGTCCGAGGT(序列7)。

上述特异扩增hsa-miR181a-5p基因的引物由hsa-miR181a-5p miRNA正向引物和通用反向(下游)引物组成；

上述特异扩增hsa-miR-378a-3p基因的引物由hsa-miR-378a-3p miRNA正向引物和通用反向(下游)引物组成。

上述外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p作为标志物在开发或设计如下任一产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品；

2)筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品；

3)区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品。

本发明另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其包括上述第一个目的中的检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质；

所述产品具有如下任一种功能：

1)鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品；

2)筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品；

3)区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品。

上文中，上述鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断的群体为神经退行性疾病患者或疑似神经退行性疾病患者。

上述筛查或辅助筛查针对的群体为神经退行性疾病患者或疑似神经退行性疾病患者。

上述产品还包括从体液中提取外泌体的试剂和从外泌体中裂解获取RNA的试剂。

上文中，从体液中提取外泌体的试剂包括四氧化三铁-二氧化钛磁珠；提取方法见实施例；

从外泌体中裂解获取RNA的试剂包括RNA捕获磁珠；提取方法见实施例。

上述体液具体为唾液和尿液或血清。

本发明涉及基于唾液和尿液、以及血清中外泌体内涵miRNA靶标标志物的快捷提取和扩增，具体包括(1)从稀释后的血清基质、或者尿液原液、或者唾液原液中，利用磁性四氧化三铁-氧化物纳米颗粒富集法进行富集外泌体；(2)并通过RNA磁珠法富集纯化外泌体内含miRNAs靶标；(3)利用加A法进行反转录-定量聚合酶链扩增实验，实现靶miRNA的检测；(4)通过疾病对应性，锁定一组关键靶标，在尿液、唾液中对其检测，与神经退行性疾病早筛及鉴别诊断有良好的性能。

本发明的有益效果在于：

(1)外泌体是存在于复杂基质中的，它的分离技术主要包括超高速离心、超滤、免疫亲和捕获、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱和微流体技术等，分别具备各自优劣，但都费事费力，人外周血中含有大量血清脂蛋白、糖蛋白、铁蛋白，尺寸与外泌体近似。另外，唾液中有大量粘蛋白，会干扰后续提取和检测。本发明涉及的外泌体及其内含miRNA的便捷式提取方法，通过稀释+富集的办法，可以减少干扰因素，提高外泌体目标物，使得达到检测限，从而弥补传统外泌体提取方法的不足。本发明提取流程简单易操作，适用于无创采集的体液，对于外泌体中含量低的生物标志物的检测可提高检测灵敏度，能够更好更快速得到外泌体及其内含稳定的miRNA生物标志物，适用于普查筛查大样本调查的液体诊断监控技术。

(2)本发明针对临床和大健康市场上的刚需和痛点，主要解决目前临床使用的以解剖结构为基础的传统影像和神经心理检查存在的问题和瓶颈。本发明开发的神经退行性疾病早筛试剂盒，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-423-5p，和hsa-miR-151a-3p作为指标，具有高敏感性高特异性。因此，该发明的提取方法配合检测指标，由于其微创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反映动态检测阿尔茨海默和血管性痴呆患者的鉴别诊断以及疾病状态，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。

附图说明

图1为外泌体电镜检测结果图。

图2为Western blot检测外泌体中标志性蛋白结果图。

图3为miRNA芯片筛选结果，上图为尿液中miRNA表达量，下图为唾液中miRNA表达量。横坐标为正常对照组的表达量，纵坐标为AD/VaD组的表达量。每一点代表一种miRNA。两条直线之间的点代表两组样本中表达量无明显差异的miRNA，直线上方的点代表AD/VaD组的表达量高于正常对照组的miRNA，直线下方的点代表AD/VaD组的表达量低于正常对照组的miRNA。

图4为内参基因在不同组织和细胞的细胞外囊泡中的表达量示意图。

图5为靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p、内参基因hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-378a-3p熔解曲线图。

图6为外泌体内部包含靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p和内参基因hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-378a-3p扩增批间差异示意图。

图7为靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p在阿尔茨海默和正常人中唾液外泌体和尿液外泌体中表达水平对比图。

图8为正常人、阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VaD)、额颞叶痴呆(FTD)唾液外泌体中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3pmiRNA相对表达结果图。

图9为唾液中hsa-miR-24-3p miRNA区分正常对照(30例)和AD(30例)、VaD(20例)和FTD(5例)的ROC曲线图。

图10为唾液中hsa-miR-151a-3pmiRNA区分正常对照(30例)和AD(30例)、VaD(20例)和FTD(5例)的ROC曲线图。

图11为唾液中hsa-miR-423-5p miRNA区分正常对照(30例)和AD(30例)、VaD(20例)和FTD(5例)的ROC曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和正常志愿者的miRNA的筛选

本实施例中的样本为10例阿尔茨海默患者、10例血管性痴呆患者以及10正常志愿者的唾液、尿液和血液。匹配不同组别间的年龄、性别，及并发症史等。

一、氧化物富集法进行外泌体富集和RNA的提取

1、实验试剂

①洗涤缓冲液：20mM Tris-HCl,150mM NaCl,10mM CaCl₂，余量为水；

②清洗收集液：0.01mM PBS,PH 7.2

用化学共沉淀法制备二氧化锆包覆的四氧化三铁磁珠，方法如下：将FeSO₄·7H₂O(终浓度0.18mol/L)和FeCl₃·6H₂O(终浓度0.12mol/L)溶解于水-无水乙醇(体积比＝5:1)混合液中，以800rpm速度搅拌并通氮气30min。随后加热升温到70℃，在搅拌状态下加入体积百分比25％氨水溶液使混合液pH达到10～11。继续搅拌15min，然后缓慢滴加质量体积比为8.5％(终浓度)的八水氧氯化锆。加热到80℃恒温反应90min。反应液静置降温到30℃后，用外加磁场(3000高斯)吸附磁性颗粒，去掉上清，用去离子水清洗3次，真空冷冻干燥获得二氧化锆包覆的四氧化三铁磁珠(粒径80-120nm，堆积密度0.8-1.0g/cm³)。

③预处理液：70％乙醇水溶液；

④上样缓冲液/平衡缓冲液：10mM的柠檬酸(pH＝6)缓冲液(溶剂为水)；

⑤洗脱缓冲液：0.01％(体积百分含量)氨水，pH＝10。

2、唾液、尿液、血液中的外泌体内涵miRNAs提取实验步骤：

样本量推荐范围：唾液原液1mL-2mL、尿液1mL-2mL；血清500μl(需用洗涤缓冲液2倍稀释后上样)。

(1)磁珠悬液：将上述1自制的四氧化三铁-二氧化钛磁珠用20％乙醇水溶液(体积百分比)配成50mg/ml的磁珠悬液。

(2)平衡磁珠：

①每个样本取500μl(25mg)的磁珠悬液，将离心管放置在磁分离器上，放置30s，移弃上清。500μl的70％乙醇水溶液(预处理液)温和洗涤磁珠5min，将离心管放置在磁分离器上，放置30s，移弃上清。重复一次洗涤。

②用500μl的洗脱缓冲液洗涤磁珠10min，将离心管放置在磁分离器上，放置30s，移弃上清。

③500μl上样缓冲液平衡磁珠60s，将离心管放置在磁分离器上，放置30s，移弃上清。共3次平衡。

(3)捕获外泌体

①将样本对应加入到平衡好的磁珠中，混悬，室温孵育20min。将离心管放置在磁分离器上，放置30s，移弃上清。

②使用100μl洗脱缓冲液孵育40min，磁性分离，移取上清至新的离心管中，得到外泌体溶液。

(4)捕获RNA

①上一步得到的外泌体溶液中加入200μl RNA捕获磁珠(诺唯赞生物科技股份有限公司,N412-01)吹打混匀后室温孵育5min。将离心管放置在磁分离器上，放置30秒，移弃上清，保留RNA捕获磁珠。

②加入500μl新鲜配制的80％乙醇水溶液漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清，重复漂洗1次。

③磁珠暴露在空气中自然干燥后加入适量体积的Nuclease-free H₂O，吹打混匀室温孵育5min，得到磁珠悬浮液。

将磁珠悬浮液置于磁力架5min后转移上清至新的离心管中，得到外泌体RNA。

二、唾液、尿液、血液中的外泌体及其内涵miRNAs的鉴定

1、唾液、尿液、血液中的外泌体的鉴定

由于血清/血浆(枸橼酸钠采血管)过柱后再与氧化物富集后，无法洗脱得到的是外泌体与氧化物的结合物，因此选择分开表征，第一步对过柱后去除脂蛋白的外泌体溶液进行电镜实验；第二步通过特异标志物进行免疫印迹实验(western blot)实验证明氧化物的确有效富集了外泌体。

1)电镜实验：首先使用含有2.5％(体积百分含量)戊二醛的0.01mM PBS,PH 7.2对上述一的(3)得到的外泌体溶液进行固定，吸取20μl滴在200目的铜网formvar碳支持膜(中镜科仪，BZ20022a)上静置10min，多余溶液用滤纸贴边吸干，在室温下用饱和乙酸双氧铀溶液负染1min，用滤纸贴边吸干剩余溶液后用透射电镜表征。

所有样本均检测，均得到外泌体。其中1例阿尔茨海默患者来自唾液的外泌体电镜检测结果如图1，可以看出，得到外泌体。

2)免疫印迹实验(western blot)实验

分别取30μl来自血清和唾液的外泌体溶液分别加入具有还原剂的上样缓冲液，用12％ SDS-PAGE分离后用半干转膜仪器转移至0.45μm PVDF膜上，室温下用含5％牛血清白蛋白的封闭液封闭1h。分别加入外泌体标志蛋白抗体anti-TSG101(1:1000，Abcamab125011)和anti-CD 81(1:200，Abcam，ab79559)，于4℃孵育过夜。经1×TBST缓冲液洗脱后，在室温下加入HRP标记二抗羊抗鼠IgG抗体(1:5000，中杉金桥ZB-5305)孵育90min，经TBST洗3次后，显影液显色。

检测结果如图2所示，可以看出，成功检测到来自于血清和唾液中外泌体的标志蛋白TSG101和CD81的表达，表明提取获得外泌体。

同样的方法进行检测，所有样本用上述方法均提取获得外泌体。

2、唾液和尿液中的外泌体内涵miRNAs的鉴定

1)反转录

将上述一得到的来自于唾液和尿液的外泌体RNA分别按照如下反转录得到cDNA：使用poly(a)聚合酶和ATP进行poly(a)-尾反应，对miRNA进行反转录。使用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211，天根生物)，可保证miRNA 3’末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。miRNA反转录体系的配制：2X RT buffer5μl，RTmix(酶和反转录引物)1μl，RNA模板4μl，共10μl体系。

内含通用反转录引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVNVN＝V:A、C、G；N:A、C、G和T；

反转录程序如下：42℃60min进行miRNA加A尾反应和逆转录反应；95℃3min酶失活反应。

2)miRNA芯片筛选

miRNA芯片(Agilent Human miRNA(8*60K)array)由上海伯豪生物技术有限公司分析完成。

将上述一得到的来自于唾液和尿液的外泌体RNA用miRNA芯片检测。

芯片筛选结果如图3所示，从芯片筛选结果中发现靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p在10例阿尔茨海默患者、10例血管性痴呆患者以及10正常志愿者的唾液和尿液的组别间统计学差异显著。

因此，靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p可作为区分正常志愿者和阿尔茨海默患者或血管性痴呆患者的标志物。

实施例2、筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和正常志愿者的方法建立

一、内参基因的选择

5S和U6被排除在基因组学建议的参考基因之外。基于在外泌体中含量要高，且稳定表达、多种基质通用性等特点，目前选取了miR181a-5p和miR378a-3p作为尿液、唾液和血液外泌体的定量标准以及后续的内参基因选择，具体含量参见图4，上图为miR181a-5p在各种细胞外囊泡中的表达量，下图为miR378a-3p在各种细胞外囊泡中的表达量。

二、筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者、额颞叶痴呆患者和正常志愿者的QPCR检测方法的建立

1、获得外泌体中的RNA

按照实施例1的一的方法，获得RNA。

2、反转录得到cDNA；

3、QPCR检测

以上述cDNA为模板，用如下引物和检测体系进行QPCR检测：

在进行下游荧光定量检测时，为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制，得到合适的Ct值(15-28之间)，可将cDNA反应液稀释10-100倍后使用。

采用

Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。

研发中使用

qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)(Q131，诺唯赞)。

上述QPCR检测体系如下：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μl；F(miRNA正向引物)0.4μl；Rp(通用QPCR反向引物)0.4μl；反转录cDNA模板4μl；ddH2O5.2μl，共20μl体系。

上述引物序列如下：

靶基因hsa-miR-24-3p miRNA序列：UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG(序列1)

hsa-miR-24-3p miRNA正向引物(5-3)：AGTGGCATGGCTCAGTTCAG(序列4)

靶基因hsa-miR-423-5p miRNA序列：UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU(序列2)

hsa-miR-423-5p miRNA正向引物(5-3)：AACAGTGTGAGGGGCAGAGAG(序列5)

靶基因hsa-miR-151a-3pmiRNA序列：CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG(序列3)

hsa-miR151a-3p miRNA正向引物：AACCACTCTAGACTGAAGCTCCT(序列6)

内参基因hsa-miR-181a-5p miRNA序列：AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

hsa-miR181a-5p miRNA正向引物(5-3)：ACATTCAACGCTGTCGGTGAGT

内参基因hsa-miR-378a-3p miRNA序列：UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC

hsa-miR-378a-3p miRNA正向引物(5-3)：AACACGCTGAGATGAAGCACTG

通用反向(下游)引物(5'-->3')：CAGTGCAGGGTCCGAGGT(序列7)

上述各个基因和通用反向(下游)引物分别组成引物对，进行扩增。

上述QPCR程序：95℃15min，5个预扩增(94℃for 20s,63℃for 30s,and 72℃for34s,)35个循环(94℃for 20s,and 60℃for 34s)plate read；Melting curve analysis；END。

使用Applied Biosystems 7500Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR检测，△△CT法进行相对定量处理数据，得到hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p的表达量(相对于hsa-miR181a-5p内参基因的表达量)。

采用prism 9.0软件对数据进行处理，组间数据比较采用独立样本t检验，P<0.05有差异即有统计学意义。

在唾液和尿液中，三种指标hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p在阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和额颞叶痴呆患者中的表达量均呈现不同程度上升，均以倍数(fold)为单位，10倍为阈值线，相对于正常人群(非神经退行性疾病患者，且没有其他疾病)变化倍数10倍以上定义为阳性。

倍数(fold)为患者指标表达量/正常人群指标表达量。

因此，根据上述QPCR检测各个受试者中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p的表达量，计算受试者各个基因表达量与正常人对应基因表达量的比值，记作某个基因的倍数；

若受试者hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p或hsa-miR-151a-3p基因的倍数大于10，则该受试者为或候选为神经退行性疾病患者，若小于等于10,则该受试者不为或候选不为神经退行性疾病患者；

或，若受试者hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p或hsa-miR-151a-3p基因的倍数大于10，则该受试者为或候选为神经退行性疾病患者，若小于等于10,则该受试者不为或候选不为神经退行性疾病患者。

进一步确定MCI-eAD、VaD和FTD的唾液外泌体中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p miRNA指标相对表达，发现唾液中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p miRNA区分三类疾病的阈值线分别为表1所示。

表1为唾液中三种miRNA在不同疾病区分中阈值范围(单位：倍数fold)

上表中，范围判定方法，左边数字不包括在范围内，右边数字包括在范围内。如45～80，指大于45且小于等于80，不包括45，包括80。

因此，可用唾液外泌体中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3pmiRNA的基因倍数区分MCI-eAD、VaD和FTD：

若受试者唾液外泌体中hsa-miR-24-3p的基因的倍数为10-20，则该受试者为或候选为AD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-24-3p的基因的倍数为30-60，则该受试者为或候选为VaD；

或，若待检唾液外泌体中hsa-miR-24-3p的基因的倍数为60-100，则该受试者为或候选为FTD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-423-5p的基因的倍数为80-120，则该受试者为或候选为AD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-423-5p的基因的倍数为60-80，则该受试者为或候选为VaD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-423-5p的基因的倍数为10-60，则该受试者为或候选为FTD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-151a-3p的基因的倍数为10-45，则该受试者为或候选为AD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-151a-3p的基因的倍数为45-80，则该受试者为或候选为VaD；

或，若受试者唾液外泌体中hsa-miR-151a-3p的基因的倍数为80-120，则该受试者为或候选为FTD。

上述数值范围表示，左边数字不包括在范围内，右边数字包括在范围内。

三、QPCR检测方法稳定性检测

按照实施例2的二的方法，针对同一个样本(例如正常志愿者的唾液中)，提取的多个批次的外泌体以及其内含miRNAs，采用上述二的方法进行不同批次间扩增。每组实验6次重复。

方法扩增的特异性用熔解曲线图5表示，QPCR扩增时阴性对照(cDNA模板用水替代)无扩增以显示引物扩增特异性。

重复性用不同扩增日内不同批间差表示，可使qPCR体系的批间差异小于8％，靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p、和内参基因hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-378a-3p扩增批间差异参见图6。

四、检测唾液和尿液样本对轻度认知障碍(MCI)-早中期阿尔茨海默(early AD，eAD)做诊断的临床样本灵敏度和特异性

待测样本为20例轻度认知障碍(MCI)-早中期阿尔茨海默(early AD，eAD)(又名MCI-eAD)的唾液和尿液样本，20例正常志愿者的唾液和尿液样本。

按照实施例2的二的方法，进行检测。

结果如图7所示，基于RT-qPCR方法，对于靶基因hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p在唾液和尿液中，在MCI-eAD的相对表达水平较健康人具有不同程度升高(样本例数每组例数n＝20,***表示统计学差异P<0.001**表示统计学差异P<0.01)，表达量倍数为10～70倍，因此，证明该基因的表达量可以较好对阿尔茨海默疾病进行诊断。

五、检测唾液样本对MCI-eAD、血管性痴呆(VaD)、以及其他类别痴呆(如额颞叶痴呆，FTD)的辅助鉴别诊断的灵敏度和特异性

待测样本为30例正常志愿者的唾液样本和55例神经退行性疾病患者，其中：55例神经退行性疾病患者中，30例轻度认知障碍(MCI)-早中期阿尔茨海默(early AD，eAD)(又名MCI-eAD，图中记作AD)的唾液样本，20例血管性痴呆(VaD)的唾液样本，5例额颞叶痴呆(FTD)的唾液样本。

按照实施例2的二的方法，进行检测。

结果如图8所示，正常人(n＝30)、MCI-eAD(n＝30)、VaD(n＝20)和FTD(n＝5)的唾液外泌体中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3p miRNA指标相对表达结果图，可以看出，能够区分其他类型的神经退行性疾病患者和正常人，和正常相比统计学差异(*P<0.05；**P<0.01)。

实施例5、辅助区分MCI-eAD、血管性痴呆(VaD)和正常样本的临床性能分析

待测样本为30例正常志愿者的唾液样本，55例神经退行性疾病患者，其中：30例轻度认知障碍(MCI)-早中期阿尔茨海默(early AD，eAD)(又名MCI-eAD，图中记作AD)的唾液样本，20例血管性痴呆(VaD)的唾液样本，5例额颞叶痴呆(FTD)的唾液样本。

按照实施例2的方法，进行检测。

结果如图9-图11所示，唾液中hsa-miR-24-3p miRNA区分正常对照(30例)与AD(30例)、VaD(20例)或FTD(5例)的ROC曲线图，曲线下面积(AUC)分别为0.8011、0.8683、0.7133；唾液中hsa-miR-151a-3pmiRNA区分正常对照(30例)和AD(30例)、VaD(20例)和FTD(5例)的ROC曲线图，曲线下面积(AUC)分别为0.8956、0.8033、0.9533；唾液中hsa-miR-423-5pmiRNA区分正常对照(30例)和AD(30例)、VaD(20例)和FTD(5例)的ROC曲线图，曲线下面积(AUC)分别为0.8411、0.9433、0.8933。

上述结果表明，正常人(n＝30)和神经退行性疾病如MCI-eAD(n＝30)、VaD(n＝20)和FTD(n＝5)的唾液外泌体中hsa-miR-24-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-151a-3pmiRNA指标在两类疾病辅助鉴别诊断的临床性能分析。

Claims (8)

1.检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、血管性痴呆和/或额颞叶痴呆。

3.检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品中的应用；

或检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质在制备区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品中的应用。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述外泌体来源于受试者的体液。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质包括特异结合各个基因的抗体或探针，或者特异扩增各个基因的引物对。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

特异扩增miR-24-3p基因的引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成；

特异扩增miR-423-5p基因的引物对由序列5所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成；

特异扩增miR-151a-3p基因的引物对由序列6所示的单链DNA分子和序列7所示的单链DNA分子组成。

7.外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p作为标志物在开发或设计如下任一产品中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品；

2)筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品；

3)区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品。

8.一种产品，其包括检测外泌体中miR-24-3p、miR-423-5p和/或miR-151a-3p基因表达量的物质；

所述产品具有如下任一种功能：

1)鉴定或辅助鉴定或诊断或辅助诊断神经退行性疾病产品；

2)筛查或辅助筛查阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品；

3)区分或辅助区分阿尔茨海默患者、血管性痴呆患者和/或额颞叶痴呆患者的产品。

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