CN114686593B - 与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA及其应用,提供了与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA,所述外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,所述外泌体miRNA包括miR‑484、miR‑548ap‑5p和miR‑6824‑3p中的至少一种,所述外泌体piRNA包括pir‑36340。通过对miR‑484、miR‑548ap‑5p、miR‑6824‑3p、pir‑36340进行检测,可有效判断乳腺癌的患病风险,并且外泌体SmallRNA含量稳定,易于获得,在检测过程中方法简单、速度较快,有利于推广应用。
Description
技术领域
本申请属于生物医学技术领域,尤其涉及一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA及其应用。
背景技术
乳腺癌多年来一直高居全球女性恶性肿瘤新发和死亡率榜首,2020年甚至超越肺癌成为全球所有性别中新发病例最多的癌症。乳腺癌的确切病因和发病机理尚不完全清楚,乳腺癌的防控仍以早诊早治为主。因此,分析乳腺癌的危险因素,建立风险评估模型,对高危个体进行风险预测和筛查,采取有针对性的干预措施,实现高危人群的精准防治具有非常重要的科学意义。乳腺癌风险预测模型是以流行病学及遗传危险因素为基础,预测具有某些危险因素的女性在未来一定时间内发生乳腺癌的风险。目前国际上应用最广的模型是以Gail 模型为代表的经验型模型和以BRCAPRO模型为代表的基因型模型。经验型模型主要包括Gail 模型和Claus 模型;基因型模型主要包括BRCAPRO 模型、BOADICEA 模型、MyriadⅡ模型及Couch 模型。经验型模型纳入的是初潮年龄、初产年龄和家族史等因素;基因型模型纳入了与乳腺癌发病相关的BRCA1 和BRCA2等基因。
随着现代分子医学技术的发展,外泌体在乳腺癌发病机制中的作用逐渐被人们所重视。外泌体是指由细胞通过胞吐或芽生等方式分泌的直径在30-150nm的囊泡,它来源于几乎所有类型的体细胞,其囊泡内包含的蛋白质、RNA和脂类,可参与调控重要的细胞生理活动,包括免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应和凝结等。而肿瘤细胞来源的外泌体被认为有望成为肿瘤的早期诊断标记物、靶向药物载体或治疗的潜在靶点。其中外泌体miRNA和piRNA被细胞生物学研究发现与乳腺癌细胞微环境形成、增殖分化、迁移有关。
目前乳腺癌相关基因的单核苷酸多态性(SNP)仍然是被广泛认可和应用的乳腺癌风险预测因素。国内外研究者已发现了许多与乳腺癌发病相关的SNP位点。利用这些位点所包含的遗传信息建立乳腺癌风险预测模型、制备诊断试剂、开发靶向药物等已得到应用。受技术的限制,外泌体小RNA在人群中的应用尚未得到推广。
发明内容
本申请的目的在于提供一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA及其应用,旨在解决现有技术中尚未有与乳腺癌相关的外泌体小RNA相关应用的问题。
为实现上述申请目的,本申请采用的技术方案如下:
第一方面,本申请提供一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA,外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,外泌体miRNA包括miR-484、miR-548ap-5p和miR-6824-3p中的至少一个,外泌体piRNA包括pir-36340。
第二方面,本申请提供一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,外泌体SmallRNA为与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA。
第三方面,本申请提供一种用于预测乳腺癌患病风险的试剂盒,试剂盒包括用于检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的试剂。
第四方面,本申请提供一种预测乳腺癌患病风险的系统,系统包括:
数据获取单元:用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平;
数据分析单元:利用风险评分公式处理将表达水平的数据并进行正态转换,计算相应的风险评分;
数据预测单元:确定阈值,将所述风险评分根据所述阈值进行区分,以预测乳腺癌患病风险。
本申请第一方面提供的一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA,外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,外泌体miRNA包括miR-484、miR-548ap-5p和miR-6824-3p,外泌体piRNA包括pir-36340;提供的外泌体miRNA和piRNA与乳腺癌细胞微环境形成、增殖分化、迁移有关,通过对miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340进行检测,可有效判断乳腺癌的患病风险,并且外泌体SmallRNA含量稳定,易于获得,在检测过程中方法简单、速度较快,有利于推广应用。
本申请第二方面提供的与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,采用4种外泌体小RNA miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340进行相关的诊断产品的制备,得到的产品在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行检测,在检测过程中,提高了检测速率,检测简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测乳腺癌患病风险。
本申请第三方面提供的用于预测乳腺癌患病风险的试剂盒,试剂盒包括用于检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的试剂,根据提供的试剂可快速检测相应的外泌体小RNA,简单快速,成本较低,速度快,效率高,可信度高,结果可靠。
本申请第四方面提供的用于预测乳腺癌患病风险的系统,提供的系统包括数据获取单元、数据分析单元、数据预测单元;该系统首先获取的外泌体小RNA的表达水平的数据,再利用特定的风险评分公式进行处理得到相应的风险评分,利用有统计学关键的因素建立风险评估模型,利用该模型可进行乳腺癌风险评估和筛查,准确快速预测乳腺癌患病风险,预测结果准确度较高,可信度较高,对识别出来的高危样本采取有针对性的干预措施,可广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的外泌体的粒径和浓度分析图。
图2是本申请实施例提供的外泌体透射电镜观察图。
图3是本申请实施例提供的外泌体特异表面蛋白标志物检测图。
图4是本申请实施例提供的外泌体small RNA火山图分析。
图5是本申请实施例提供的 Logistic回归模型ROC曲线分析。
图6是本申请实施例提供的流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81结果图。
图7是本申请实施例提供的粒径分析结果图。
图8是本申请实施例提供的ROC曲线分析图。
图9是本申请实施例提供的血浆外泌体miR-6824-3p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。
图10是本申请实施例提供的血浆外泌体miR-548ap-5p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。
图11是本申请实施例提供的血浆外泌体pir-36340p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。
图12是本申请实施例提供的血浆外泌体miR-484在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
本申请中,术语“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B的情况。其中A,B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中,“至少一个”是指一个或者多个,“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达,是指的这些项中的任意组合,包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如,“ a,b,或c中的至少一项(个)”,或,“a,b,和c中的至少一项(个)”,均可以表示:a, b, c, a-b(即a和b), a-c, b-c, 或a-b-c,其中a,b,c分别可以是单个,也可以是多个。
应理解,在本申请的各种实施例中,上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后,部分或全部步骤可以并行执行或先后执行,各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定,而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量,也可以表示各组分间重量的比例关系,因此,只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地,本申请实施例说明书中的质量可以是µg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的,用来将目的如物质彼此区分开,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如,在不脱离本申请实施例范围的情况下,第一XX也可以被称为第二XX,类似地,第二XX也可以被称为第一XX 。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA,外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,外泌体miRNA包括miR-484、miR-548ap-5p和miR-6824-3p中的至少一个,外泌体piRNA包括pir-36340。
本申请实施例第一方面提供的一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA,外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,外泌体miRNA包括miR-484、miR-548ap-5p和miR-6824-3p中的至少一个,外泌体piRNA包括pir-36340;提供的外泌体miRNA和piRNA与乳腺癌细胞微环境形成、增殖分化、迁移有关,通过对miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340进行检测,可有效判断乳腺癌的患病风险,并且外泌体SmallRNA含量稳定,易于获得,在检测过程中方法简单、速度较快,有利于推广应用。
本申请提供的与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA为血浆或血清中的外泌体提取的RNA,由外泌体提取得到的外泌体SmallRNA带有原细胞的来源信息,更能够准确、有效判断乳腺癌的患病风险;而游离于血浆中普通的SmallRNA,由于来源不明确,因此不利于进行患病风险判断。
在一些实施例中,SmallRNA为外泌体中的长度在200nt以下的非编码RNA分子,包括micro RNA(miRNA)、small interference RNA (siRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)和tRNA-derived small RNAs(tsRNA)等。
在一些实施例中,miR-484的序列如Seq.ID No.1所示,Seq.ID No.1为TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT。
在一些实施例中,miR-548ap-5p的序列如Seq.ID No.2所示,Seq.ID No.2为AAAAGTAATTGCGGTCTTT。
在一些实施例中,miR-6824-3p的序列如Seq.ID No.3所示,Seq.ID No.3为TCTCTGGTCTTGCCACCCCAG。
在一些实施例中,pir-36340的序列如Seq.ID No.4所示,Seq.ID No.4为GGTCGCTGGTTCGTTTCCGGCTCGAAGGACC。
在一些实施例中,外泌体SmallRNA包括miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340中的一个或多个。通过检测提供的四种外泌体SmallRNA中的一个或多个,可以进一步更好地做分析。
在一些实施例中,外泌体SmallRNA包括miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340中的任意二个。
在一些实施例中,外泌体SmallRNA包括miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340中的任意三个。
本申请实施例第二方面提供一种与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,外泌体SmallRNA为与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA。
本申请实施例第二方面提供的与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,采用4种外泌体小RNA miR-484、miR-548ap-5p、miR-6824-3p、pir-36340进行相关的诊断产品的制备,得到的产品在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行检测,在检测过程中,提高了检测速率,检测简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测乳腺癌患病风险。
在一些实施例中,产品包括试剂盒、芯片、系统中的至少一种。由于提供的外泌体SmallRNA在检测方面具有特异性较强,灵敏度较高的特点,应用于试剂盒、芯片或系统的制备,可提高活动性肺结核患病风险的预测准确度及可信度。
本申请实施例第三方面提供一种用于预测乳腺癌患病风险的试剂盒,试剂盒包括用于检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的试剂。
本申请实施例第三方面提供的用于预测乳腺癌患病风险的试剂盒,试剂盒包括用于检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的试剂,根据提供的试剂可快速检测相应的外泌体小RNA,简单快速,成本较低,速度快,效率高,可信度高,结果可靠。
在一些实施例中,试剂包括分离、提纯、纯化外泌体的试剂。采用试剂盒提供的试剂提取样品中的外泌体。进一步,提取得到的外泌体选择NTA外泌体浓度和粒径检测方法、外泌体透射电镜检测方法、外泌体表面蛋白流式细胞术检测方法中的至少一种检测方法进行检测。通过对获取并进行检测得到的外泌体进一步采用检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的试剂检测外泌体SmallRNA。
在一些实施例中,样品包括但不限于血清、血浆、细胞培养物上清或其它体液。
在一些实施例中,试剂包括芯片法、测序法以及实时定量PCR反应中使用的试剂。通过采用试剂盒中的不同试剂,用于对外泌体SmallRNA进行检测,以确定外泌体SmallRNA的表达水平。
在一些具体实施例中,提供芯片法使用的试剂采用芯片法检测外泌体SmallRNA;或,提供测序法使用的试剂采用测序法检测外泌体SmallRNA;或,提供实时定量PCR反应使用的试剂采用实时定量PCR法检测外泌体SmallRNA。
在一些实施例中,试剂盒还包括一个回归模型,回归模型包括一个风险评分公式,所示风险评分公式如下:
风险评分=(-0.096×miR-6824-3p的表达水平)+(-3.32×miR-548ap-5p的表达水平)+(-0.48×piR-36340的表达水平)+(-0.078×miR-484的表达水平)-14.841。通过风险评分公式可以计算得出相应的风险评分,以预测乳腺癌患病风险。
本申请实施例第四方面提供一种预测乳腺癌患病风险的系统,系统包括:
数据获取单元:用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平;
数据分析单元:利用风险评分公式处理将表达水平的数据并进行正态转换,计算相应的风险评分;
数据预测单元:确定阈值,将所述风险评分根据所述阈值进行区分,以预测乳腺癌患病风险。
本申请实施例第四方面提供的用于预测乳腺癌患病风险的系统,提供的系统包括数据获取单元、数据分析单元、数据预测单元;该系统首先获取的外泌体小RNA的表达水平的数据,再利用特定的风险评分公式进行处理得到相应的风险评分,利用有统计学关键的因素建立风险评估模型,利用该模型可进行乳腺癌风险评估和筛查,准确快速预测乳腺癌患病风险,预测结果准确度较高,可信度较高,对识别出来的高危样本采取有针对性的干预措施,可广泛应用。
具体的,预测乳腺癌患病风险的系统包括数据获取单元,提供的数据获取单元主要用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
在一些实施例中,获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平的步骤中,包括:
S01. 提供样本,将样本进行分离、纯化得到外泌体,并对外泌体进行鉴定,得到样本目标外泌体;
S02. 提取样本目标外泌体的总RNA,对Small RNA进行全测序,对测序结果进行Small RNA表达差异分析,确定与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
步骤S01中,样本选自血清、血浆、细胞培养物上清或其它体液中的至少一种。进一步,对样本利用试剂盒法或超速离心法进行分离、纯化得到外泌体。
在一些实施例中,对外泌体进行鉴定的方法选自NTA外泌体浓度和粒径检测鉴定方法、外泌体透射电镜检测鉴定方法、外泌体表面蛋白流式细胞术检测鉴定方法中的至少一种。通过鉴定后,得到样本目标外泌体。
步骤S02中,提取样本目标外泌体的总RNA,对Small RNA进行全测序,对测序结果进行Small RNA表达差异分析,确定与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
在一些实施例中,对测序结果进行Small RNA表达差异分析的步骤中包括:以标准化的 TPM 值来表示 Small RNA 的表达量,采用DESeq2软件进行分析,筛选条件为:Foldchange > 2,FDR<0.05,得到表达差异显著的Small RNA,再对表达差异显著的Small RNA绘制火山图进行观察,确定与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
具体的,预测乳腺癌患病风险的系统包括数据分析单元,数据分析单元主要是利用风险评分公式处理将表达水平的数据并进行正态转换,计算相应的风险评分。
在一些实施例中,数据分析单元包括建立模型,通过模型得到风险评分公式。其中,模型构建的方法包括:利用“进入法”对hsamiR6824-3p、has-miR-548ap-5p、pir-36340和has-miR-484进行二元Logistic回归分析,构建Logistic回归模型。
进一步,所建立的模型的ROC曲线特征为:对上述Logistic回归模型的预测概率进行ROC曲线分析。检验变量为预测概率,状态变量为组别,计算ROC曲线下面积(AUC值)。
在一些实施例中,回归模型包括一个风险评分公式,所示风险评分公式如下:
风险评分=(-0.096×miR-6824-3p的表达水平)+(-3.32×miR-548ap-5p的表达水平)+(-0.48×piR-36340的表达水平)+(-0.078×miR-484的表达水平)-14.841。
具体的,预测乳腺癌患病风险的系统包括数据预测单元,数据预测单元为确定阈值,将所述风险评分根据所述阈值进行区分,以预测乳腺癌患病风险。
在一些实施例中,数据预测单元还包括乳腺癌患病风险的阈值,当风险评分的数值高于阈值时,判断患乳腺癌患病的风险高;当风险评分的数值低于阈值时,判断患乳腺癌患病的风险低。
在一些实施例中,二元logistics回归模型按照统计学原理选择阈值为0.5,根据模型计算风险评分并计算预测概率,预测概率大于0.5的为阳性,小于0.5的为阴性。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种与乳腺癌有关的SmallRNA在制备乳腺癌早期风险预测产品中的应用,其中,产品选自用于乳腺癌筛查阳性风险预测模型的构建。
预测乳腺癌筛查阳性风险的系统,系统包括:
(1)数据获取单元:用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
具体步骤如下:包括:
①样品确定与收集
对自愿报名参加的城市常住居民(40-74岁户籍或常住人群)预约至医院进行临床筛查,其中对45岁以上(含45岁)的女性采用超声检查结合X线摄片检查,对45岁以下的女性采用超声检查,如出现可疑或阳性结果加X线摄片检查。对所有参加筛查的对象采集静脉血(5mlEDTA采血管),离心分离血细胞和血浆后保存待用。
影像学检查采用美国放射学会(ACR)制定并为国际广泛采用的乳腺影像报告及数据系统(BI-RADS,Breast Imaging Reporting and Data System)对影像诊断结果进行记录、分析。BI-RADS分类1-2类为阴性,BI-RADS分类4-5类为阳性。分别随机选取阴性和阳性人群进行外泌体检测。
②外泌体分离
血浆样品恢复至室温后,采用试剂盒法分离外泌体。以exoEasy Maxi Kit(QIAGEN公司)试剂盒为例(本发明的外泌体分离包括但不仅限于该品牌试剂盒)。简要操作方法如下:
使用注射器过滤器或滤网预过滤血浆去除大于 0.8 μm 的颗粒,向 1 体积样品中加入 1 体积缓冲液 XBP,轻轻颠倒试管 5 次,混合均匀,让混合物升温至室温;
将样品-XBP 混合物加入 exoEasy 离心柱并以 500 x g 离心 1 分钟,丢弃流出液并将柱放回同一个收集管中,加入 10 ml 缓冲液 XWP 并以 5000 x g 离心 5 分钟以去除柱中残留的缓冲液,将流通液与收集管一起丢弃,将离心柱转移到新的收集管中;
将400 μl-1 ml Buffer XE 加到膜上并孵育1分钟,以500 x g 离心 5 分钟以收集洗脱液,将洗脱液重新转移到 exoEasy 旋转柱膜上并孵育1分钟,以5000 x g 离心5分钟以收集洗脱液并转移到EP管中保存待用。
③外泌体鉴定
将分离的外泌体抽选部分进行鉴定,包括NTA外泌体浓度和粒径检测、外泌体透射电镜检测和外泌体表面蛋白流式细胞术检测。NTA外泌体浓度和粒径检测使用Nanosightns30(Malvern公司)仪器;外泌体透射电镜检测HT-7700透射电镜(Hitachi公司)仪器;外泌体表面蛋白流式细胞术检测采用Accuri C6 flow cytomenter(BD公司)仪器按照设备标准操作程序操作。
④提取样本目标外泌体的总RNA
外泌体中的RNA提取可选用常规的RNA提取方法,也可以使用专门的外泌体RNA提取试剂盒(一步法),本例以QIAGEN exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit试剂盒(QIAGEN公司)为例进行说明,提取步骤包括:
向 1 体积样品中加入 1 体积缓冲液 XBP。轻轻颠倒试管 5 次,立即混合均匀,将样品和XBP的混合物添加到exoEasy旋转柱上,并以500 x g的速度旋转1分钟。丢弃流通液并将色谱柱放回同一收集管中;
加入10 ml XWP并以5000 x g旋转5分钟以洗涤柱子并去除残留的缓冲液。将流出液与收集管一起丢弃,将离心柱转移到新的收集管中,向膜中加入700 µl QIAzol。以5000x g旋转5分钟以收集裂解物并完全转移到2 ml管中,短暂涡旋含有裂解物的管并在室温(15~25°C) 下孵育5分钟;
添加 3.5 µl miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(1.6 x 108 份/µl 工作溶液),向装有裂解液的管中加入90 µl氯仿并盖紧,剧烈摇晃15秒,在室温(15–25°C)下孵育2–3分钟,在4°C下以12,000 x g 离心15分钟,离心后,如果将使用同一台离心机进行下一步离心,则将离心机加热至室温 (15–25°C);
将上层水相转移到新的收集管中。避免任何相间材料的转移。添加2倍体积的100%乙醇(例如,对于400 µl水相,添加800 µl 乙醇)并通过上下移液数次彻底混合,不要离心,立即将多达700 µl 的样品(包括可能形成的任何沉淀物)移到 2 ml 收集管中的 RNeasyMinElute 离心柱中,轻轻合上盖子,在室温 (15–25°C)下以≥8000 x g (≥10,000 rpm)离心 15 秒,丢弃流通,使用剩余的样品再重复一次,丢弃流通;
向 RNeasy MinElute 离心柱中加入700 µl Buffer RWT,轻轻合上盖子,以 ≥8000 x g(≥10,000 rpm)离心15秒,丢弃流液,将500 µl Buffer RPE移到RNeasyMinElute离心柱上。轻轻合上盖子,以 ≥8000 x g(≥10,000 rpm)离心15秒,丢弃流液,将500 µl Buffer RPE移到RNeasy MinElute离心柱上,盖上盖子,以≥8000 x g (≥10,000rpm) 离心2分钟,丢弃带有流通液的收集管。
将 RNeasy MinElute 离心柱放入新的 2 ml 收集管中。打开离心柱的盖子,全速离心 5 分钟,使膜干燥,丢弃带有流通液的收集管,将 RNeasy MinElute 离心柱放入新的1.5 ml 收集管中。将 14 µl 无 RNase 的水直接添加到离心柱膜的中心。轻轻盖上盖子,让柱子静置 1 分钟,然后全速离心 1 分钟以洗脱 RNA。
④对Small RNA进行全测序,对测序结果进行Small RNA表达差异分析,确定与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
提取的外泌体RNA使用仪器法进行测序分析,使用NextSeq CN500 测序平台 SE75模式进行测序。以标准化的 TPM 值来表示Small RNA 的表达量。对Small RNA的表达量进行正态转换:正态数据=(原数据-平均数)/标准差。
(2)数据分析单元:利用风险评分公式处理将表达水平的数据,计算相应的风险评分;
其中,二元Logistic回归分析方法包括:选取620条表达差异显著的small RNA(Fold change > 2,FDR<0.05),利用SPSS软件进行二元Logistic回归分析,回归分析采用向前-LR法。
提供的风险评分公式如下:风险评分=(-0.096×miR-6824-3p的表达水平)+(-3.32×miR-548ap-5p的表达水平)+(-0.48×piR-36340的表达水平)+(-0.078×miR-484的表达水平)-14.841。
(3)数据预测单元:用于将风险评分取阈值=0.5进行区分,以预测乳腺癌患病风险。
预测乳腺癌患病风险:选取有显著表达差异的small RNA进行二元Logistic回归分析,利用模型中的变量与系数建立模型,对模型进行ROC曲线分析,获得模型预测效能;取阈值=0.5,当风险评分的数值高于阈值时,判断患乳腺癌患病的风险高;当风险评分的数值低于阈值时,判断患乳腺癌患病的风险低。
结果分析
(一)外泌体鉴定的结果分析
将分离的外泌体抽选部分进行鉴定,包括NTA外泌体浓度和粒径检测、外泌体透射电镜检测和外泌体表面蛋白流式细胞术检测。
图1为NTA外泌体浓度和粒径检测,由图1可知,图示外泌体几乎集中在109nm处,为外泌体常见粒径范围。图2为提取外周血外泌体后对外泌体进行透射电镜观察的图片,由图2可知,得到的外泌体外泌体形态、大小正常。图3为对外泌体进行外泌体表面蛋白标志物的流式细胞术检测结果,由图3可知,图3的A为流式细胞仪检测散点图,图3的B为外泌体表面蛋白CD63阴性对照分析结果,图3的C为外泌体表面蛋白CD63分析结果,图3的D为外泌体表面蛋白CD81阴性对照分析结果,图3的E为外泌体表面蛋白CD81分析结果,图3示外泌体的特异表面蛋白标志物CD63和CD81的阳性率分别为 61.5% 和 67.1%。
(二)Small RNA 的表达测定及分析
对Small RNA表达进行差异分析,共发现620条small RNA表达有显著差异,其中526条表达上调,94条表达下调,对表达差异显著的small RNA绘制火山图进行观察,图4为外泌体small RNA的火山图,图4表达差异显著的Small RNA(Fold change > 2,FDR<0.05)有620条,其中表达上调的有526条(红色点),表达下调的有94条(绿色点)。
(三)数据分析与预测结果
选取620条表达差异显著的small RNA(Fold change > 2,FDR<0.05),利用SPSS软件进行二元Logistic回归分析,回归分析采用向前-LR法,其中,方程中有意义的变量为hsamiR6824-3p、hsamiR548ap-5p、pir36340和hsamiR484Logistic回归模型方程中的变量及参数如表1所示,得到的风险评分公式如下:风险评分=(-0.096×miR-6824-3p的表达水平)+(-3.32×miR-548ap-5p的表达水平)+(-0.48×piR-36340的表达水平)+(-0.078×miR-484的表达水平)-14.841。进一步,对Logistic回归模型进行ROC曲线分析,如图5所示,ROC曲线图的曲线下面积(AUC值)=0.998,该模型有极佳的辨识度和诊断效能。
表1
实施例2
一种与乳腺癌有关的SmallRNA在制备乳腺癌风险预测中的应用,其中,产品选自用于SmallRNA在制备乳腺癌早期风险预测产品中的应用。
乳腺癌筛查阳性风险预测模型系统,系统包括:
(1)数据获取单元:用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
具体步骤如下:包括:
选取人群全血样品,使用广州市锐博生物科技有限公司的RiboTM ExosomeIsolation Reagent (for plasma or serum) 试剂盒提取血浆中外泌体。提取的外泌体通过流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81,并经粒径分析来进行鉴定。鉴定合格后对提取的外泌体使用美基生物HiPure Serum/Plasma miRNA Kit试剂盒提取RNA。再使用广州市锐博生物科技有限公司miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit和Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒检测目标SmallRNA的表达水平。
(2)数据分析单元:根据基因扩增Cq值计算基因相对定量结果,应用发明建立的模型进行风险评分,计算预测概率,计算模型预测效果。
将has-miR-6824-3p、has-miR-548ap-5p、pir-36340、has-miR-484的表达水平(Mean Cq)进行正态转换:正态数据=(原数据-平均数)/标准差。代入模型公式进行评分:风险评分=(-0.096×miR-6824-3p的表达水平)+(-3.32×miR-548ap-5p的表达水平)+(-0.48×piR-36340的表达水平)+(-0.078×miR-484的表达水平)-14.841。利用风险评分(Score)进行二元逻辑回归分析,获得回归系数E和常量C。
计算每个样品的预测概率=EXP(C+E*Score)/(1+EXP(C+E*Score))
(3)数据预测单元:
确定阈值,将所述风险评分根据所述阈值进行区分,以预测乳腺癌患病风险。阈值取0.5时,大于0.5为阳性,小于0.5为阴性。预测结果与临床筛查结果进行比较。
结果分析
(一)外泌体鉴定的结果分析
将分离的外泌体抽选部分进行鉴定,包括流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81和粒径分析
图6为流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81结果图,图6的A为流式细胞仪检测散点图,图6的B为外泌体表面蛋白CD63阴性对照分析结果,图6的C为外泌体表面蛋白CD63分析结果,图6的D为外泌体表面蛋白CD81阴性对照分析结果,图6的E为外泌体表面蛋白CD81分析结果,图6可知,外泌体的特异表面蛋白标志物CD63和CD81的阳性率分别为15.3% 和21.9%。
图7为粒径分析结果图,粒径主峰在100.9nm,粒径20nm-200nm百分比(%)为77.22%。
(二)模型预测结果及模型预测效果
随机选取60名参与乳腺癌筛查的人群全血样品按照上述步骤计算每个样品的预测概率,阈值取0.5,大于0.5为阳性,小于0.5为阴性。预测结果与临床筛查(BI-RADS分类1-2类为阴性,BI-RADS分类4-5类为阳性)结果进行比较。
比较结果如下:
表2.随机样品进行模型预测结果比较
利用预测概率进行ROC曲线分析,结果:AUC=0.676。(见图8,60例随机抽取样品的模型预测概率ROC曲线分析,曲线下面积/AUC=0.676,模型有较好的区分度)
实施例3
一种与乳腺癌有关的SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,其中,产品选自用于SmallRNA在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用。
乳腺癌筛查阳性早期诊断的系统,系统包括:
(1)数据获取单元:用于获取样本中与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA的表达水平。
具体步骤如下:包括:
另外随机选取60名参与乳腺癌筛查的人群全血样品,使用广州市锐博生物科技有限公司的RiboTM Exosome Isolation Reagent (for plasma or serum) 试剂盒提取血浆中外泌体。提取的外泌体通过流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81,并经粒径分析来进行鉴定。鉴定合格后对提取的外泌体使用美基生物HiPure Serum/PlasmamiRNA Kit试剂盒提取RNA。再使用广州市锐博生物科技有限公司miDETECT ATrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit和Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒检测目标SmallRNA的表达水平。
(2)数据分析单元:根据基因扩增Cq值计算基因相对定量结果。
以cel-miR-39-3p为参考基因,分别计算has-miR-6824-3p、has-miR-548ap-5p、pir-36340、has-miR-484的在60个样品中的相对表达量。按照筛查结果分组,根据相对表达量进行T检验分析组间差异,并以阳性组为1绘制相对定量柱状图进行表达情况对比分析。
结果分析
(一)外泌体鉴定的结果分析
将分离的外泌体抽选部分进行鉴定,包括流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81和粒径分析
图6为流式细胞仪检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81结果图,由图6可知,外泌体的特异表面蛋白标志物CD63和CD81的阳性率分别为15.3% 和21.9%。图7为粒径分析结果图,粒径主峰在100.9nm,粒径20nm-200nm百分比(%)为77.22%。
(二)定量PCR基因相对定量结果分析
如图9所示,血浆外泌体miR-6824-3p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。结果显示:血浆外泌体miR-6824-3p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达有统计学差异,阳性组miR-6824-3p表达水平显著高于阴性组。
如图10所示,血浆外泌体miR-548ap-5p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。结果显示:血浆外泌体miR-548ap-5p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达有统计学差异,阳性组miR-548ap-5p表达水平显著低于阴性组。
如图11所示,血浆外泌体pir-36340p在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。结果显示:血浆外泌体pir-36340在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达有统计学差异,阳性组pir-36340表达水平显著低于阴性组。
如图12所示,血浆外泌体miR-484在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达差异。结果显示:血浆外泌体miR-484在乳腺癌筛查阳性和阴性人群中的表达有统计学差异,阳性组miR-484表达水平显著低于阴性组。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市慢性病防治中心(深圳市皮肤病防治研究所、深圳市肺部疾病防治研究所)
<120> 与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA及其应用
<130> 2022-04-19
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcaggctcag tcccctcccg at 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aaaagtaatt gcggtcttt 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tctctggtct tgccacccca g 21
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ggtcgctggt tcgtttccgg ctcgaaggac c 31
Claims (2)
1.一种定量检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA表达水平的试剂在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述外泌体SmallRNA包括外泌体miRNA和外泌体piRNA;其中,所述外泌体miRNA包括miR-484、miR-548ap-5p和miR-6824-3p,所述外泌体piRNA包括pir-36340;其中,miR-6824-3p在乳腺癌筛查阳性人群中高表达,miR-548ap-5p在乳腺癌筛查阳性人群中低表达,pir-36340p在乳腺癌筛查阳性人群中低表达,miR-484在乳腺癌筛查阳性人群中低表达。
2.根据权利要求1所述的定量检测与乳腺癌有关的外泌体SmallRNA表达水平的试剂在制备乳腺癌早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述试剂包括芯片法、测序法以及实时定量PCR反应中使用的试剂。
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