CN117778570A - 血液胞外囊泡microRNA在鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血液胞外囊泡miRNA，hsa‑miR‑21‑3p可以作为鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的生物标志物，从而能够用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒。利用该miRNA作为生物标志物能够提高卵巢癌早期诊断的特异性，降低其假阳性，从而对卵巢病变的良恶性鉴别以及卵巢癌的早期诊断具有潜在的良好临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的血液胞外囊泡hsa-miR-21-3p及其应用。
背景技术
卵巢癌是女性常见的三大恶性肿瘤之一，也是女性妇科疾病中最致命的疾病。卵巢癌由于缺乏代表性临床症状和有效的诊断方法，超过70％的患者出现盆腔外病变，诊断时已为晚期(FIGO分期III期或IV期)。在过去的几十年尽管在治疗方面取得了进展，晚期患者的5年生存率仍然很低(<30％)，而早期(FIGO分期I期或II期)患者的5年生存率更长，可达70-90％。针对卵巢癌，尤其是卵巢癌中最常见的病理类型--上皮性卵巢癌，准确有效的良恶性鉴别对于临床干预卵巢癌，提高干预效果和改善预后具有巨大价值。因此，早期发现并准确进行良恶性鉴别是卵巢癌患者获得高治愈率的关键途径。
目前，卵巢癌的筛查方法主要包括影像学检查和肿瘤生物标志物检测，或二者联合检测等形式，但临床实践表明，这些方法均有一定的局限性。影像学诊断方法主要有经阴道超声、CT扫描、磁共振成像(MRI)等。影像学诊断是临床肿瘤诊断的常用方法，但由于影像设备的各种缺陷，如超声准确率较低、CT电离辐射等，通常是将几种技术结合起来进行诊断；此外，影像学诊断敏感性和特异性较低，常用于高危人群的诊断，而不是早期发现。血清标志物检测常有CA125(糖类抗原)、HE4(human epididymis protein 4，人附睾蛋白4)等。CA125在卵巢癌的诊断中有许多局限性，如敏感性低，I、II期患者术前诊断敏感性50-60％，晚期患者敏感性为70-90％，同时诊断特异性较差，CA125不仅在妇科疾病中升高，在肺癌、内分泌和消化疾病、营养代谢疾病中也升高。HE4仅在大约60-75％的卵巢癌患者的血清中升高，且对原发性腹膜癌、原发性输卵管癌等腹腔多发肿瘤的敏感性，限制了对卵巢癌的诊断。CA125和HE4这两种生物标志物在卵巢癌诊断及治疗和复发的随访监测中被广泛应用，但由于其诊断特异性和敏感性较差，仍远未达到最佳效果。
针对血液胞外囊泡miRNA生物标志物应用于卵巢癌早期诊断的研究没有验证可用于卵巢癌早诊的生物标志物，同时也未建立高特异性的血液胞外囊泡miRNA生物标志物诊断模型。目前，能够用于良、恶性上皮性卵巢肿瘤鉴别的高特异性的血液胞外囊泡miRNA生物标志物更是未见研究和报道。具体地说，现有技术中存在以下缺点：1)临床上广泛使用的影像学检查(如经阴道超声)和肿瘤标志物检测(如CA125)，对卵巢癌的诊断缺乏特异性，易出现假阳性。并且这些指标并不能够用于上皮性卵巢肿瘤良恶性鉴别判断；2)尚没有可辅助经阴道超声和CA125的高特异性生物标志物，以提高卵巢癌诊断特异性，从而降低假阳性率；3)目前临床上尚未有成熟的基于血液外泌体miRNA鉴别良恶性上皮性卵巢肿瘤的产品或诊断试剂盒；和4)目前临床上缺乏基于血液外泌体对上皮性卵巢癌进行有效诊断鉴别的液体活检技术方案。
因此，在卵巢癌常规诊断方法的基础上，迫切需要开发新的生物标志物来提高卵巢癌诊断鉴别效能。
发明内容
本发明旨在发现并验证可用于上皮性卵巢肿瘤良恶性鉴别诊断的、特异性高的血液胞外囊泡miRNA生物标志物及诊断模型。同时，该液体活检鉴别技术可以结合影像学检查和CA125水平检测来提高上皮性卵巢癌诊断鉴别特异性，降低假阳性，避免医疗过度，减轻患者痛苦，节约医疗资源。
为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别。
本发明还提供了能够对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的芯片和试剂盒。
本发明还提供了利用所述生物标志物对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的方法。
在第一方面，本发明提供一种血液胞外囊泡miRNA在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。
在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在第二方面，本发明提供一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合miRNA；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
在具体的实施方式中，所述miRNA芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第三方面，本发明提供第二方面所述的miRNA芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。
在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测miRNA的检测试剂；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA；
或者，所述检测试剂盒装有权利要求3或4所述的miRNA芯片。
在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第六方面，本发明提供一种鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；
所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在优选的实施方式中，所述的参比值为4.09。
在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成所述的miRNA。
在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成所述的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的miRNA或所述的多核苷酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了胞外囊泡的电镜结果；
图2显示了胞外囊泡特征性蛋白的表达情况；
图3显示了训练队列候选分子标记物的表达量；
图4显示了训练队列的ROC曲线；
图5显示了验证队列的ROC曲线；
图6显示了采用qRT-PCR方法检测miR-21-3p的表达水平。
具体实施方式
目前临床上对卵巢癌的诊断普遍采用影像学检查(如经阴道超声)联合肿瘤生物标志物(如CA125)，但存在特异性和阳性预测值较低的问题。临床上85％-90％的恶性卵巢癌属于上皮性卵巢癌，由于缺乏有效的鉴别手段，大部分上皮性卵巢癌在确诊时已错失最佳治疗窗口，导致治疗效果和患者预后受到极大的影响。鉴别良恶性上皮性卵巢肿瘤对于干预上皮性卵巢癌具有重大意义，但目前临床尚缺乏有效手段。
为此，本发明提供了临床鉴别上皮性卵巢肿瘤良性和恶性的方法，具体是：
(1)基于对血液胞外囊泡microRNA(miRNA)的研究，发现良恶性上皮性卵巢肿瘤鉴别的生物学标志物；
(2)对发现的胞外囊泡miRNA标志物良、恶性鉴别效果进一步验证，以评估其特异性及鉴别效能。
通过上述(1)、(2)，本发明人发现并证实血液外泌体来源的miR-21-3p可以有效鉴别上皮性卵巢肿瘤的良、恶性，同时证实miR-21-3p在辅助临床上皮性卵巢癌鉴别干预方面具有巨大的发掘潜力。
定义
本文所用的科学和技术术语与本领域技术人员常规理解的一致。为便于理解本发明，现对相关术语解释和定义如下：
小型胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)，又称外泌体，近年来得到了广泛的研究，它是一种脂质双分子层包裹的直径约30-150nm的囊泡。胞外囊泡可由多种细胞类型主动分泌释放至细胞间隙，存在于血液、尿液、腹水等各种体液中。胞外囊泡是一种信息囊泡，携带其来源细胞的脂类、蛋白质和核酸(DNA、mRNA、miRNAs等)。EVs通过释放内含的生物活性分子，与受体细胞膜融合或与细胞表面受体结合，介导了正常细胞和癌细胞之间的双向通信。EVs的分子组成反映其细胞或组织来源的生理或病理变化，作为疾病诊断的生物标志物具有重要的潜力。
然而，现有技术进行的研究缺少独立的验证试验，基于miRNA芯片或qRT-PCR技术不能发现血液外泌体中未知的miRNA。特别是，目前临床上针对上皮性卵巢癌尚缺乏基于血液外泌体miRNA的良恶性液体活检鉴别模型。
本发明采用临床病理诊断结果为上皮性卵巢肿瘤患者的血液为研究样本，首先利用胞外囊泡(外泌体)抽提试剂L3525(上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发)提取血液外泌体，随后提取外泌体总RNA并制备small RNA文库，利用NGS测序检测良性、恶性患者血液外泌体miRNA的表达水平，通过数据建模，发现并验证可用于卵巢癌早期诊断的高特异性外泌体miRNA生物标志物诊断模型。
本发明的血液胞外囊泡miRNA
目前，临床上卵巢癌早期诊断广泛应用的经阴道超声和CA125水平检测，特异性较差，造成假阳性。尚没有高特异性的生物标志物应用于卵巢癌的早期诊断，也没有生物标志物结合经阴道超声和CA125应用于临床来提高诊断的特异性，以降低诊断假阳性率。针对卵巢癌早诊生物标志物的研究有以下几个特征：a.外泌体内含物用于卵巢癌早诊生物标志物同时经过另一组独立数据验证的研究稀少；b.基于NGS测序平台的研究较少；c.未见到提出具有高特异性生物标志物结合经阴道超声和CA125来提高卵巢癌诊断特异性的相关研究。
针对上述不足，本发明纳入真实世界中多种良性卵巢肿瘤患者为对照，应用自主研发的分离试剂L3525对血液胞外囊泡进行抽提，然后提取胞外囊泡的总RNA，随后利用small RNA sequencing检测血液胞外囊泡miRNA的表达水平，发现并验证了具有高特异性的血液胞外囊泡miRNA生物标志物。本发明首次发现并验证了血液胞外囊泡miRNA用于生物标志物结合经阴道超声和CA125可提高卵巢癌早期诊断的特异性，降低了假阳性率。
具体地说，本发明人发现了一种血液胞外囊泡miRNA，所述的血液胞外囊泡miRNA能够用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性。在具体的实施方式中，本发明的血液胞外囊泡miRNA是序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA(CAACACCAGUCGAUGGGCUGU)；或者与SEQ ID NO:1所示的miRNA序列互补的miRNA。
在进一步的实施方式中，可以利用所述血液胞外囊泡miRNA制备芯片、检测试剂或检测试剂盒以便鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性。例如，所述的miRNA芯片可以包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合所述miRNA。在优选的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有互补结合区；和/或，与固相载体相连的连接区。
在具体的实施方式中，本发明还提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测所述miRNA的检测试剂，或者，所述检测试剂盒装有所述的miRNA芯片。
本发明的方法
基于本发明的血液胞外囊泡miRNA，本发明还提供了利用该miRNA的各种方法。
例如，可以利用该miRNA鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性，包括以下步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；
所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的参比值为4.09。
本发明采用了血液胞外囊泡其中一个内容物miRNA建立的生物标志物模型结合影像学检查(如经阴道超声)和肿瘤标志物检测(如CA125)来提高卵巢癌早诊的特异性，降低假阳性率。然而，胞外囊泡的内容物还有许多，如蛋白质、脂质、小分子代谢物、lncRNA、circRNA、mRNA、piRNA等，这些血液胞外囊泡内容物也可能构建生物标志物模型来达到和miRNA类似的效果。除此之外，患者血液中多种成分，如CTCs(Circulating tumor cells)、ctDNA(Circulating tumor DNA)、细胞外游离核酸(cfRNA和cfDNA)、蛋白生物标志物等都可能结合影像学检查和肿瘤标志物检测来提高卵巢癌早诊的特异性，降低其假阳性率。
本发明的优点：
1.本发明首次发现并证实血液外泌体hsa-miR-21-3p可以作为一种鉴别上皮性卵巢肿瘤良性和恶性的生物学标志物；
2.本发明发现基于血液外泌体hsa-miR-21-3p对良性和恶性上皮性卵巢肿瘤的鉴别模型效能良好，临床验证组中模型的特异性为90.0％，敏感性为83.3％，准确性达到86.4％；
3.本发明提出采用血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物建立高特异性模型结合经阴道超声和CA125水平来区分上皮性卵巢肿瘤中的良恶性患者，从而提高上皮性卵巢癌鉴别诊断的特异性，以降低假阳性；
4.本发明采用公司自主研发的胞外囊泡(外泌体)分离试剂L3525(上海思路迪生物医学科技有限公司)提取血液外泌体，然后检测胞外囊泡miRNA的表达水平；
5.本发明采用拟合线性模型(limma-voom)统计分析方法，发现了1个血液胞外囊泡miRNA hsa-miR-21-3p，可以建立高特异性、高阳性预测值的风险预测模型；
6.本发明利用另一批独立研究组数据，验证了血液胞外囊泡miRNA hsa-miR-21-3p建立的风险预测模型能够进行高特异性、高阳性预测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
材料
以下实施例中利用的材料均属于可商品化购得的。
方法
1.研究队列及临床信息
本研究共纳入两个研究队列共计42例经肿瘤标志物(如CA125、HE4等)和影像学检查(如超声检查、腹盆腔CT扫描等)检测结果为上皮性卵巢肿瘤患者，于术前采集患者的血液样本。每个入组的患者于术后根据病理检查结果给出准确的诊断。
2.血液胞外囊泡的提取和特征鉴定
1)血液的收集和胞外囊泡的提取
患者血液样本的收集在手术或药物治疗前进行，保存在10ml的真空采血管中(REF367820,BD,USA)，缓慢地上下颠倒几下后竖直放置，室温静置1-2h，待血块凝固后进行常温离心，2000g离心10min，离心后根据标准判断样本的溶血等级并做好实验记录(后续研究使用小于4级的样本)，将上清转移至1.5ml EP管中，8000g离心10min(4℃条件下)，以清除残留的细胞碎片，将上清分装至EP管(每管1ml)储存于-80℃冰箱。
取出冻存的血清样本置于37℃水浴锅中解冻，12000g离心10min(4℃条件下)。将500μL上清液转移至0.45μm过滤柱中(Costar,CLS8163-100EA,Corning,USA)，12000g离心5min(4℃条件下)，随后将过滤液转移至0.22μm过滤柱中(Costar,CLS8161-100EA,USA)，12000g离心5min(4℃条件下)，收集过滤液至1.5ml EP管中。测量过滤液的体积，加入1/4体积的L型外泌体沉淀剂(L3525,3DMed,Shanghai,China)，充分混匀后4℃条件下孵育30min，4700g离心30min(4℃条件下)，弃除上清液，加入200μL PBS(Phosphate Buffer Saline)重悬胞外囊泡。
除了采用胞外囊泡(外泌体)分离试剂L3525抽提血液外泌体，还可以采用以下替代方案：a.离心法(差速离心法、密度梯度离心法)；b.沉淀法(PEG沉淀法、有机溶剂沉淀法)；c.粒径分离法(超滤法、排阻色谱法)；d.免疫亲和法；e.微流控技术；f.其他商业化外泌体分离试剂盒。
2)血液胞外囊泡的特征鉴定
为了检测血液胞外囊泡特征，本专利使用透射电子显微镜(TEM)检测胞外囊泡的形态，进一步利用免疫化学发光检测胞外囊泡特征蛋白的表达水平。胞外囊泡形态特征鉴定：胞外囊泡颗粒在PBS中重悬，取10μL悬浮液滴在碳涂层铜网格上。室温孵育5分钟后，用2％多聚甲醛固定胞外囊泡，用水冲洗2次。用10％醋酸铀酰对铜网格进行负染色10分钟，使用透射电子显微镜(H7650，HITACHI，Japan)观察、拍照。
胞外囊泡特征性蛋白检测：利用NanoView Biosciences公司的人外泌体检测试剂盒(Cat#EV-TETRA-C,Brighton,MA)检测胞外囊泡的表面蛋白。操作过程如下：使用1×样品缓冲液稀释外泌体浓度至1x107-1x108/mL，滴加50μL样品至预扫描的芯片上，室温条件下孵育16h；每孔内加入1000μL 1×缓冲液A，振荡混匀；每孔弃除750μL液体，加入750μL 1×缓冲液A，振荡混匀，此步骤重复三次；每孔弃除750μL液体，根据实验需要，以anti-CD9(HI9a,CF488A)、anti-CD81(JS-81,CF555),、anti-CD63(H5C6,CF647)每孔每种染料0.6μL和每孔封闭液300μL预混染色液，震荡混匀；每孔加入250μL染色液，染色1h；按照操作清洗芯片，进行后续上机检测。
3.胞外囊泡miRNA抽提和表达量检测
1)血液胞外囊泡miRNA抽提
参照产品说明书，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit(217184,QIAGEN,Shanghai,China)从胞外囊泡中提取总RNA，最后使用15μl RNase-free Water洗脱RNA。随后利用安捷伦2100生物分析仪及配套相应的小RNA分析试剂盒(5067-1548,Agilent,USA)，检测miRNA的浓度及片段分布情况。
2)血液胞外囊泡miRNA的表达检测
本专利采用small RNA sequencing技术对血液胞外囊泡中miRNA的表达水平进行检测。选用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina试剂盒(E7300L,NEB,USA)进行文库制备，操作步骤详见产品说明书。每个RNA样本的上样量为100ng(体积不超过6μL)，随后进行3’端接头的连接、反转录引物杂交、5’端接头的连接、反转录以及PCR扩增反应(通常扩增18个循环)。使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(740609.250,MN,Germany)试剂盒对PCR富集产物进行纯化，用30μL无核酸酶水洗脱DNA(文库)。使用Invitrogen Qubit 4荧光计及配套的试剂Qubit dsDNA HS Assay Kit(Q32854,Thermofisher,USA)定量DNA的浓度，使用Agilent 2100生物分析仪及配套的芯片和试剂Agilent High Sensitivity DNA Kit&Reagents(5067-4626,Agilent,USA)检测DNA片段分布情况，利用Illumina HiSeqX平台测序(测序策略为PE150)。
本发明采用二代测序技术：small RNA sequencing检测血液胞外囊泡miRNA的表达水平。然而，本领域技术人员知晓可以采用以下替代方案检测血液胞外囊泡miRNA的表达水平：a.miRNA芯片检测；b.qRT-PCR检测；c.其他二代测序技术；d.三代测序技术。
4.测序数据分析流程
基于small RNA sequencing检测技术，获得患者血液胞外囊泡中miRNA的表达量。测序数据的分析流程如下：
1)测序数据比对。去除small RNA sequencing数据测序接头后，使用BWA软件(版本：0.7.12-r1039)将测序数据比对到人类参考基因组hg19(基因组下载链接：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)，并统计比对到miRNA上的reads数量。
2)miRNA注释。利用Gencode v25和miRBase v21数据库对miRNA进行注释，保留注释为已知的成熟miRNA，用于后续分析。
3)miRNA过滤。对于训练队列，保留长度小于等于30nt且在训练队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析；对于验证队列，保留由训练队列筛选所得的miRNA且在验证队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析。
4)miRNA表达量标准化。使用R语言中limma分析包中的M值加权截尾均值方法(TMM，trimmed mean of M-values)及limma-voom方法分别对训练队列样本和验证队列样本进行miRNA表达量标准化处理。
本发明采用的建模分析方法—拟合线性模型(limma-voom)。然而，本领域技术人员知晓可以采用以下替代方案进行建模和分析：a.线性回归；b.支持向量机；c.最小绝对收缩和选择算子；d.神经网络。
5.生物标记物的发掘
基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分良性病变、恶性肿瘤的miRNA作为生物标志物。过程如下:
1)训练队列分组。依据病理检测结果，将训练队列中患者分为两组，良性病变患者组和恶性肿瘤患者组。
2)候选分子标记物。使用R语言limma分析包中拟合线性模型(limma-voom)方法分析良恶性两组患者表达量存在显著上调差异的miRNA，表达量大于2、两组间变化量在1.5倍以上且检验结果P值小于等于0.05的miRNA，作为候选分子标记物。
6.良恶性风险分类模型
利用训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良、恶性风险分类模型。模型由分子标记物表达量及参比值两部分组成。过程如下:
1)分子标记物。在训练队列中，以分子标记物表达量为变量。
2)参比值。在训练队列中，根据每个病人的分子标记物表达量的中位值，确定参比值为4.09。当风险值小于或等于参比值时，该样本被预测为良性病变；否则预测为恶性肿瘤。
3)效能评估。根据训练队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制训练队列的接受者操作特性曲线(ROC曲线，receiver operating characteristiccurve)。以参比值4.09为准，将训练队列样本分为低风险组(即被预测为良性病变)和高风险组(即被预测为恶性肿瘤)。以病理检测结果为真值，评估模型预测效能。模型预测效能评估方法，包括特异性(取值范围0～1)、敏感性(取值范围0～1)和准确性(取值范围0～1)，值越高效果越优。
7.风险评分模型预测效能的验证
在验证队列中，根据训练队列中确定的风险分类模型及参比值，对模型预测良恶性的效能进行验证。过程如下：
1)分子标记物。在验证队列中，以分子标记物的表达量为变量。
2)模型效能验证。根据验证队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制验证队列的ROC曲线。以参比值4.09为准，将验证队列患者分为低风险组(同训练队列)和高风险组，并评估模型预测效能，包括特异性、敏感性和准确性，值越高效果越优。
8.血液胞外囊泡miRNA的qRT-PCR验证
挑选18例卵巢良性病变患者和19例卵巢恶性肿瘤患者抽提的血清胞外囊泡总RNA，使用qRT-PCR技术(TaqMan探针法)检测发现的miRNA hsa-miR-21-3p在卵巢良恶性病变患者中的表达水平。实验操作步骤如下：首先使用TaqMan Advanced miRNA cDNASynthesis Kit(A28007,ThermoFisher Scientific,USA)合成cDNA，每个样本取2μL外泌体总RNA，在miRNA 3’端添加poly-A尾巴，5’端连接接头，使用通用逆转录引物合成cDNA，利用通用miR-Amp引物和miR-Amp预混液对cDNA预扩增14个循环。随后使用TaqMan FastAdvanced Master Mix(4444556,ThermoFisher Scientific,USA)配合使用TaqManAdvanced miRNA Assays(针对hsa-miRNA-21-3p)进行miR-21-3p的定量qPCR检测，内参使用hsa-miR-30e-5p，每个实验反应重复3孔，运用荧光定量PCR仪ABI7500进行实时荧光定量。最后数据处理采用2-ΔΔCt法分析miR-21-3p的相对表达量。
实施例1
在本实施例中，共招募了两个研究队列。具体研究队列及临床信息如下所述：
训练队列患者20例，包括10例良性病变患者和10例恶性肿瘤患者(表1)。验证队列患者22例，包括10例良性病变患者和12例恶性肿瘤患者(表1)。良性病变样本的种类有卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢粘液性囊腺瘤、卵巢输卵管脓肿、子宫内膜不典型增生等。恶性肿瘤样本的种类有低级别、高级别浆液性癌和黏液性癌等。表1展示了患者年龄和病理诊断的临床信息。分析结果表明两组患者间的年龄和良、恶性患者比例无显著差异。
表1.患者临床信息
实施例2.血液胞外囊泡的提取及特征鉴定
在本实施例中，使用上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发的L型外泌体沉淀剂(L3525,3DMed,Shanghai,China)对胞外囊泡进行分离。为了检测血液胞外囊泡的特征，随后使用透射电子显微镜(TEM)检测胞外囊泡的形态，检测结果可见胞外囊泡典型的“马蹄状”形态(图1)。此外，本发明人进一步利用免疫化学发光检测胞外囊泡特征蛋白的表达水平。检测结果表明，分离的代表性样本中胞外囊泡特征性蛋白CD9、CD81和CD63均有表达(图2)。
实施例3.生物标记物的发掘
在本实施例中，采用small RNA sequencing技术检测良恶性卵巢肿瘤患者血液胞外囊泡miRNA的表达水平。基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分良性病变、恶性卵巢肿瘤的miRNA作为生物标志物，候选分子标记物hsa-miR-21-3p共计1个(图3)，用于后续分析。
实施例4.良恶性风险分类模型效能评估
在本实施例中，为了构建卵巢肿瘤良、恶性风险分类模型，利用训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，将模型分为由分子标记物表达量及参比值两部分组成。在训练队列中，根据每个病人的分子标记物表达量的中位值，确定参比值为4.09。当风险值小于或等于参比值时，该样本被预测为良性；否则预测为恶性。根据训练队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制训练队列的ROC曲线(图4)。模型预测效能的特异性、敏感性和准确性分别为90.0％、90％和90％(表2)。结果表明：在训练队列中，此风险分类模型具有较高ROC曲线下面积(AUC，Area under the curve)、特异性和敏感性,模型预测效能较优。
表2.分子标记模型效能评估
实施例5.风险评分模型预测效能验证
在本实施例中，根据验证队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制验证队列的ROC曲线(图5)。以参比值4.09为准，将验证队列患者分为低风险组(同训练队列)和高风险组，并评估模型预测效能，包括特异性、敏感性和准确性，分别为90.0％、83.3％和86.4％(表2)。结果表明：在验证队列中，此风险预测模型同样具有较高特异性、敏感性和准确性，即模型预测效能较优。
实施例6.血液胞外囊泡miRNA的qRT-PCR验证
挑选18例卵巢良性病变患者和19例卵巢恶性肿瘤患者抽提的血清胞外囊泡总RNA，使用qRT-PCR技术检测发掘的hsa-miR-21-3p在卵巢肿瘤良恶性患者中的表达水平。qRT-PCR分析结果显示在卵巢恶性肿瘤患者血浆外泌体miRNA中，miR-21-3p的表达水平较良性病变患者极显著升高(P<0.0001，图6),该结果和二代测序结果一致，进一步验证了卵巢良恶性肿瘤患者血清外泌体miR-21-3p的表达水平情况。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.血液胞外囊泡miRNA在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血液胞外囊泡miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
3.一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合miRNA；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
4.如权利要求3所述的miRNA芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
5.如权利要求3或4所述的miRNA芯片，其特征在于，所述miRNA芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
6.权利要求3-5中任一项所述的miRNA芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。
7.一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测miRNA的检测试剂；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA；
或者，所述检测试剂盒装有权利要求3或4所述的miRNA芯片。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
9.一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
10.一种鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；
所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
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