CN117802227A - 血液胞外囊泡microRNA在鉴别卵巢肿瘤良恶性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血液胞外囊泡miRNA，hsa‑miR‑203a‑3p可以作为鉴别卵巢肿瘤良恶性的生物标志物，从而能够用于制备鉴别卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒。利用该miRNA作为生物标志物能够提高卵巢癌早期诊断的特异性，降低其假阳性，从而对卵巢病变的良恶性鉴别以及卵巢癌的早期诊断具有潜在的良好临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是鉴别卵巢肿瘤良恶性的血液胞外囊泡miR-203a-3p及其应用。
背景技术
卵巢癌(ovarian cancer，OC)是全球第三大最常见的妇科恶性肿瘤，但在妇科恶性肿瘤中死亡率最高。由于卵巢癌早期病变无特异性的症状，且缺乏有效的筛查方法，导致大多数患者诊断时已处于晚期。卵巢癌患者5年生存率约30％，预后较差，而I期卵巢癌患者大部分可通过手术治愈，5年生存率高达90％。因此，迫切需要高敏感性、高特异性的早期诊断生物标志物，助力我国卵巢癌的早诊，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。
目前，卵巢癌的诊断方法包括组织病理学检查、细胞学检查、影像学检查、肿瘤标志物测定等。组织病理学活检是确诊卵巢癌的金标准，而对于不适合穿刺活检的患者可抽吸盆腔肿块或腹水进行细胞学检查。但穿刺活检会引起癌细胞的扩散和转移，而细胞学检查的敏感性只有穿刺活检的75％。影像学检查方法包括胸部、腹部、骨盆的电子计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、PET-CT、经阴道超声检查(TVS)、磁弛豫法(MRX)等，但影像学检测方法如CT对直径小于1cm肿块的灵敏度仅为25-50％，容易漏检早期的卵巢癌。肿瘤标志物测定包括CA125、HE4、CA72.4、CA15.3等，有报道显示，在晚期卵巢癌中CA125水平升高的患者约占80％，而在早期卵巢癌中CA125水平升高的患者仅占50％，且月经或怀孕等生理条件下CA125水平也会升高。现有卵巢癌的诊断方法各有利弊，均有一定的局限性。
因此，开发高效特异性的生物标志物用于卵巢癌的早期诊断是非常必要且具有重要临床价值和意义的。
发明内容
本发明旨在通过二代测序技术，发现并验证高敏感性、高特异性的血液胞外囊泡miRNA生物标志物，应用于卵巢癌的早诊，弥补现有诊断方法，如组织病理学检查、细胞学检查、影像学检查、肿瘤标志物测定等在卵巢癌早期诊断上的不足，为临床提供微创的早期诊断方法，提高我国卵巢癌早期诊断的准确性，减轻卵巢癌患者的经济负担、减少患者的痛苦，提高患者的存活率。
为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别。
本发明还提供了能够对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的芯片和试剂盒。
本发明还提供了利用所述生物标志物对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的方法。
在第一方面，本发明提供血液胞外囊泡miRNA在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。
在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在第二方面，本发明提供一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合miRNA；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
在具体的实施方式中，所述miRNA芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第三方面，本发明提供第二方面所述的miRNA芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。
在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测miRNA的检测试剂；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA；
或者，所述检测试剂盒装有第二方面所述的miRNA芯片。
在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第六方面，本发明提供一种鉴别卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；
所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。。
在优选的实施方式中，所述参比值为4.30。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是分离自人的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的miRNA是血液胞外囊泡miRNA。
在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成所述的miRNA。
在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成所述的miRNA。
在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的miRNA或所述的多核苷酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了胞外囊泡的透射电镜鉴定结果；
图2显示了胞外囊泡的特征性蛋白的表达情况；
图3显示了训练队列中候选分子标记物的表达量；
图4显示了训练队列的ROC曲线；
图5显示了验证队列的ROC曲线。
具体实施方式
由于卵巢位于女性盆腔深部，导致早期病变无特异性症状。目前单一传统的筛查或诊断方法对早期卵巢癌的诊断率不高，超过2/3的卵巢癌患者在就诊时已进展到晚期。而现有的卵巢癌早期诊断生物标志物如CA125存在一定的假阳性率，同时敏感性、特异性较低。现有卵巢癌早诊的肿瘤生物标志物如CA125和HE4敏感性、特异性较低，尚没有高敏感性、高特异性的生物标志物可以提高卵巢癌早期诊断的准确性，降低假阳性率。
TVS由于其非侵入性、经济、快捷的特点而成为卵巢癌诊断、分期、随访的首选影像学检测方法，但不易测出直径＜1cm的实性肿瘤。PET-CT和CT检测时，假阳性率较高，对于＜5mm的病变假阴性率也较高。
对于现有技术中存在的问题，本发明提供卵巢癌早期诊断，特别是在临床上鉴别卵巢肿瘤良性和恶性的方法，具体分为如下两部分：
(1)研究卵巢癌早诊的血液胞外囊泡microRNA(miRNA)生物标志物，发现高特异性、高阳性预测值的生物标志物；
(2)进一步验证所发现的血液胞外囊泡miRNA生物标志物的检测效果，验证其特异性、阳性预测值等。
通过(1)、(2)发现并验证可用于卵巢癌早诊的血液胞外囊泡miRNA生物标志物。
定义
本文所用的科学和技术术语与本领域技术人员常规理解的一致。为便于理解本发明，现对相关术语解释和定义如下：
胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是一种膜性小泡，其中直径约30-150nm来源于晚期内吞体(multivesicular bodies,MVB)，通过和细胞膜融合后释放到胞外的囊泡又称外泌体。人体在正常或异常的生理状态均能持续不断的分泌胞外囊泡，且胞外囊泡内容物很丰富，有核酸(mRNA、lncRNA、miRNA等)、蛋白、脂质等。目前，越来越来多的学者在探讨胞外囊泡在肿瘤早诊、免疫治疗、靶向用药、术后监测等方面的应用价值，有研究发现在健康人群与卵巢癌患者中，二者血液胞外囊泡miRNA的表达水平存在差异。
然而，基于二代测序平台筛选可用于卵巢癌早期诊断的血液胞外囊泡miRNA生物标志物的研究较少，也没有发现并验证可用于提高卵巢癌早诊特异性的生物标志物。
本发明人采用现有临床技术手段判定疑似为卵巢癌的患者血清作为研究样本，应用上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发的，外泌体提取试剂L3525分离卵巢癌患者血清中的外泌体，随后基于small RNA sequencing的二代测序技术，检测卵巢癌患者血清中胞外囊泡miRNA的表达情况，最后在两个独立的队列中发现并验证可用于卵巢癌早期诊断的血液胞外囊泡miRNA生物标志物。
本发明的血液胞外囊泡miRNA
目前，临床上广泛应用的血清肿瘤生物标志物CA125和HE4对区分良性和恶性卵巢肿瘤的敏感性和特异性有限，无法作为有效的卵巢癌早期诊断生物标志物。本领域关于卵巢癌早期诊断生物标志物的研究存在如下特征：a.真正聚焦良性与恶性卵巢肿瘤鉴别诊断的研究较少；b.胞外囊泡内容物作为卵巢癌早期诊断生物标志物，且经过另一组数据验证的研究较少；c.基于二代测序技术研究胞外囊泡miRNA的报道数量较少。
针对目前研究的不足，本发明人纳入真实世界中多种良性病变卵巢疾病患者样本作为对照，采用自主研发的提取试剂L3525分离血液胞外囊泡，进一步利用small RNAsequencing检测血液胞外囊泡miRNA的表达，最终发现并验证了具有高特异性、高敏感性的血液胞外囊泡miRNA生物标志物。
本发明首次提出并验证了血液胞外囊泡hsa-miR-203a-3p作为生物标志物，区分良性和恶性卵巢肿瘤患者时具有高特异性、高敏感性、高阳性预测值，这有希望提高卵巢癌早期诊断的敏感性和特异性，降低假阳性率。具体地说，本发明人纳入了41例卵巢疾病(卵巢癌和卵巢良性肿瘤)患者，分成训练队列和验证队列来确认血液胞外囊泡miR-203a-3p鉴别诊断良性肿瘤和恶性肿瘤的效果，训练队列中血液胞外囊泡miR-203a-3p特异性、敏感性和AUC分别是90.0％、90.0％、0.920，验证队列中分别是90.0％、81.8％、0.900，这些结果均优于已有的研究，因此，本发明的标志物血液胞外囊泡miR-203a-3p具有较高的实用价值。
在具体的实施方式中，本发明提供了一种血液胞外囊泡miRNA，所述的血液胞外囊泡miRNA能够用于鉴别卵巢肿瘤良恶性。所述血液胞外囊泡miRNA是序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA(GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG)；或者与SEQ ID NO:1所示的miRNA序列互补的miRNA。
在进一步的实施方式中，可以利用所述血液胞外囊泡miRNA制备芯片、检测试剂或检测试剂盒以便鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性。例如，所述的miRNA芯片可以包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合所述miRNA。在优选的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有互补结合区；和/或，与固相载体相连的连接区。
在具体的实施方式中，本发明还提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测所述miRNA的检测试剂，或者，所述检测试剂盒装有所述的miRNA芯片。
本发明采用血液胞外囊泡的内容物miRNA作为生物标志物建立模型来提高卵巢癌早诊的准确性。然而，胞外囊泡的内容物还有许多，如LncRNA、蛋白质、mRNA等，这些血液胞外囊泡内容物也可能构建生物标志物模型来达到血液胞外囊泡miRNA类似的效果。除此之外，患者血液中多种成分，如蛋白生物标志物、ctDNA(Circulating tumor DNA)、CTC(Circulating tumor cell)、其他核酸生物标志物等都可能应用于辅助卵巢癌早期诊断。
本发明的方法
基于本发明的血液胞外囊泡miRNA，本发明还提供了利用该miRNA的各种方法。
例如，可以利用该miRNA鉴别卵巢肿瘤良恶性，包括以下步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌。
在优选的实施方式中，所述参比值为4.30。
本发明的优点：
(1)本发明选择多种良性病变的卵巢疾病患者作为对照组，更贴近临床上良性卵巢疾病的发病情况，更能反映真实世界的情况。
(2)本发明提出采用血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物建立高效能模型来区分良性和恶性卵巢肿瘤患者，从而提高卵巢癌早期诊断的准确性。
(3)本发明应用上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发的外泌体提取试剂L3525抽提血液胞外囊泡，进行后续胞外囊泡miRNA检测。
(4)本发明采用limma分析包中拟合线性模型首次发现了血液胞外囊泡hsa-miR-203a-3p，能够建立具有高特异性和高敏感性的风险预测模型用来区分良性和恶性卵巢肿瘤。
(5)本发明利用另一批独立数据验证了血液胞外囊泡hsa-miR-203a-3p区分良性和恶性卵巢肿瘤的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
材料
以下实施例中利用的材料均属于可商品化购得的。
方法
1.研究队列及临床信息
本研究共纳入两个研究队列共计41例经肿瘤标志物(如CA125、HE4等)、影像学检查(如超声检查、腹盆腔CT扫描等)，检测结果疑似卵巢癌的患者，于术前采集患者的血液样本。入组的疑似卵巢癌的患者均在术后，根据病理检测结果给出准确的诊断。
2.血液胞外囊泡的提取和特征鉴定
1)血液收集和胞外囊泡的提取
本研究涉及的良性和恶性卵巢肿瘤患者，在手术前、药物治疗前采集血液样本到10ml真空采血管中(REF367820,BD,USA)，缓慢柔和地上下翻转几次，将采血管竖直放置，室温静置1-2小时，待血块凝固后，首次2000g常温低速离心10min，离心后判定样本的溶血等级，将小于4级的样本用于后续研究。转移第一次离心后的上清液到1.5ml离心管中，8000g，低温4度离心10min。离心结束后转移1ml上清液到1.5ml离心管中，将分离好的血清样本保存在负80度冰箱待用。将保存的血清样本放入37℃水浴锅中，待样本完全融化后，12000g，4℃离心10min，吸取500μl上清液至0.45μm tube filter(Costar,CLS8163-100EA,Corning,USA)，12000g，4℃离心5min，转移血清过滤液至0.22μm tube filter(Costar,CLS8161-100EA,USA)，12000g，4℃再次离心5min。收集过滤液到1.5ml离心管中，加入1/4体积的L型外泌体沉淀剂(L3525,3DMed,Shanghai,China)，涡旋混匀，将混匀液放置于4℃冰箱，孵育30min，孵育完成后，4700g，4℃离心30min，吸弃上清液尽量不要有残液，加入200μl PBS(phosphate buffer saline)吹打重悬胞外囊泡。
2)血液胞外囊泡的特征
为了检测良性和恶性卵巢肿瘤患者血清胞外囊泡的特征，本发明采用透射电镜检测胞外囊泡的形态，同时利用全自动外泌体荧光检测分析系统检测胞外囊泡特征蛋白的表达水平。胞外囊泡形态特征鉴定：首先将分离得到的胞外囊泡用PBS吹打混匀，然后加入4％多聚甲醛对胞外囊泡进行固定，之后转移胞外囊泡到碳包覆的200目电子显微镜铜网上。先用PBS清洗铜网2次，随后新鲜配置含甘氨酸(50mM)的PBS并清洗铜网3min，之后新鲜配置含0.5％BSA的PBS再次清洗铜网10min，最后用2％醋酸铀酰对铜网进行染色，染色完成后采用透射电镜(H-7650,Hitachi High-Technologies,Japan)对胞外囊泡形态进行特征分析。
胞外囊泡特征蛋白检测：将胞外囊泡用PBS吹打混匀，使用1X样品缓冲液稀释胞外囊泡到1*10^7-1*10^8/ml。吸取稀释后胞外囊泡50μl加入到ExoView外泌体检测试剂盒的芯片上，注意不要让枪头接触芯片，避免产生气泡，加入的液体会覆盖整个芯片，室温孵育16h。向芯片每个孔中加入1000μl 1X缓冲液A，转移芯片到24孔板中以500rpm水平震荡3min，如果芯片剧烈撞击孔壁则适当降速，吸弃芯片孔中750μl液体并加入750μl 1X缓冲液A，500rpm水平震荡3min，如果芯片剧烈撞击孔壁则适当降速，重复操作两次。加入配置好的CD9、CD63、CD81染色液每孔250μl，将24孔板用锡纸包裹避光，放置在摇床上缓慢摇动1h，芯片不可撞击孔壁。随后清洗芯片，将清洗好的芯片置于吸水纸上晾干。最后用全自动外泌体荧光检测分析系统(ExoView R100,NanoView Biosciences,USA)上机检测。
在本发明中，采用上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发的外泌体提取试剂L3525抽提血液胞外囊泡。然而，本领域技术人员知晓其它提前胞外囊泡的替代方案。这些替代方案包括但不限于：a.超速离心法；b.超滤离心法；c.密度梯度离心法；d.免疫磁珠法；e.尺寸排阻色谱法；f.微流控芯片法g。还可采用其他商品化外泌体分离提取试剂。
3.胞外囊泡miRNA抽提和表达量检测
1)血液胞外囊泡miRNA抽提
良性和恶性卵巢肿瘤患者血清胞外囊泡miRNA的抽提，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(217184,QIAGEN,Shanghai,China)进行total RNA的分离，具体的操作流程参照试剂盒产品说明书。抽提好的血清胞外囊泡miRNA的产量和片段分布，用安捷伦2100分析仪及配套的芯片和试剂(5067-1548,Agilent,USA)进行检测。
2)血液胞外囊泡miRNA的表达检测
本发明采用small RNA sequencing检测良性和恶性卵巢肿瘤患者血液胞外囊泡miRNA的表达水平。采用NEBNext,Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina(E7300L,NEB,USA)试剂盒完成胞外囊泡miRNA文库的构建，具体的操作流程参照试剂盒产品说明书。简略步骤如下：每个血清胞外囊泡miRNA样本上样量为100ng，但总体积不超过6μl，依次进行连接3’接头、杂交反转录引物、连接5’接头、反转录、PCR扩增等流程。构建好的文库采用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(740609.50,MACHEREY-NAGEL,Germany)试剂盒进行纯化，具体的操作流程参照试剂盒产品说明书。文库的产量采用Qubit3.0荧光定量仪，及配套的试剂(Q32854，Thermo Fisher，USA)检测，文库的片段分布采用GXTouchTMHT核酸分析仪，及配套的芯片(CLS138948,PerkinElmer,USA)和试剂(CLS760672,PerkinElmer,USA)检测。最后将20-25个文库按照等摩尔比进行混合包lane测序，采用Illumina HiSeq PE150 analyzer进行测序。
在本发明中，利用二代测序技术-small RNA sequencing检测血液胞外囊泡miRNA的表达。然而，本领域技术人员知晓其它替代方案，包括但不限于：a.芯片检测；b.Q-PCR检测；c.其他二代测序方法；d.三代测序方法。
4.测序数据分析流程
基于small RNA sequencing检测技术，获得患者外周血胞外囊泡中miRNA的表达量。测序数据的分析流程如下：
1)测序数据比对。去除small RNA sequencing数据测序接头后，使用BWA软件(版本：0.7.12-r1039)将测序数据比对到人类参考基因组hg19(基因组下载链接：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)，并统计比对到miRNA上的reads数量。
2)miRNA注释。利用Gencode v25和miRBase v21数据库对miRNA进行注释，保留注释为已知的成熟miRNA，用于后续分析。
3)miRNA过滤。对于训练队列，保留长度小于等于30nt且在训练队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析；对于验证队列，保留由训练队列筛选所得的miRNA且在验证队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析。
4)miRNA表达量标准化。使用R语言中limma分析包中的M值加权截尾均值方法(TMM，trimmed mean of M-values)及limma-voom方法分别对训练队列样本和验证队列样本进行miRNA表达量标准化处理。
在本发明中，采用的分析方法是limma分析包中拟合线性模型。然而，本领域技术人员还知晓其它替代方案，包括但不限于：a.线性回归；b.支持向量机；c.最小绝对收缩和选择算子LASSO；d.神经网络。
5.生物标记物的发掘
基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分良性病变、恶性卵巢肿瘤的miRNA作为生物标志物。
过程如下：
1)训练队列分组。依据病理检测结果，将训练队列中患者分为两组，良性病变患者组和恶性肿瘤患者组。
2)候选分子标记物。使用R语言limma分析包中拟合线性模型(limma-voom)方法分析良恶性两组患者表达量存在显著上调差异的miRNA，标准化后表达量大于2、两组间变化量在1.5倍以上且检验结果P值小于等于0.05的miRNA，作为候选分子标记物。
6.卵巢肿瘤良、恶性风险分类模型
利用训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良、恶性风险分类模型。模型由分子标记物表达量及参比值两部分组成。过程如下：
1)分子标记物。在训练队列中，以分子标记物表达量为变量。
2)参比值。在训练队列中，根据每个病人的分子标记物表达量的中位值，确定参比值为4.30。当风险值小于或等于参比值时，该样本被预测为良性病变；否则预测为恶性肿瘤。
3)效能评估。根据训练队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制训练队列的ROC曲线。以参比值4.30为准，将训练队列样本分为低风险组(即被预测为良性病变)和高风险组(即被预测为恶性肿瘤)。以病理检测结果为真值，评估模型预测效能。模型预测效能评估方法，包括特异性(取值范围0～1)、敏感性(取值范围0～1)和准确性(取值范围0～1)，值越高效果越优。
7.风险评分模型预测效能验证
在验证队列中，根据训练队列中确定的风险分类模型及参比值，对模型预测良恶性的效能进行验证。过程如下：
1)分子标记物。在验证队列中，以分子标记物的表达量为变量。
2)模型效能验证。根据验证队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制验证队列的接受者操作特性曲线(ROC曲线，receiver operating characteristiccurve)。以参比值4.30为准，将验证队列患者分为低风险组(同训练队列)和高风险组，并评估模型预测效能，包括特异性、敏感性和准确性，值越高效果越优。
8.卵巢肿瘤良、恶性风险评分模型的应用
1)采集临床诊断结果疑似为卵巢癌患者的外周血，获得外周血胞外囊泡，使用small RNA sequencing获得生物标志物的表达；
2)使用风险评分模型，获得每一位疑似卵巢癌患者的风险值；
3)将风险值与模型参比值比较，给出每一位疑似卵巢癌患者罹患卵巢癌风险的预测结果。
实施例1
在本实施例中，研究队列及临床信息为：
训练队列患者共20例，包括10例良性病变患者，10例恶性肿瘤患者(表1)。验证队列患者共21例，包括10例良性病变患者，11例恶性肿瘤患者(表1)。良性病变样本有卵巢输卵管脓肿、子宫内膜不典型增生、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢粘液性囊腺瘤等。恶性肿瘤样本有低级别浆液性癌、高级别浆液性癌、黏液性癌等。表1展示了入组患者年龄与病理诊断的临床信息。分析结果表明，两组患者间的年龄、良性与恶性患者比例并无显著性差异。
表1.患者临床信息
实施例2.血液胞外囊泡的提取及其特征鉴定
在本实施例中，应用上海思路迪生物医学科技有限公司自主研发的，胞外囊泡(外泌体)提取试剂L3525抽提卵巢癌患者血清中的胞外囊泡。为了检测良性与恶性卵巢肿瘤患者血清胞外囊泡的特征，采用透射电镜检测胞外囊泡的形态，同时利用全自动外泌体荧光检测分析系统检测胞外囊泡特征蛋白的表达水平。透射电镜检测结果可见到胞外囊泡呈现典型的“马蹄状”形态(见图1)。全自动外泌体荧光检测分析系统检测结果表明，本专利提取的代表性样本中，胞外囊泡特征性蛋白CD9、CD63、CD81均有表达(见图2)。
实施例3.生物标记物的发掘
在本实施例中，采用small RNA sequencing检测良性与恶性卵巢肿瘤患者血液胞外囊泡miRNA的表达水平。基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分良性病变、恶性卵巢肿瘤的miRNA作为生物标志物，候选分子标记物hsa-miR-203a-3p共计1个(图3)，用于后续分析。
实施例4.卵巢肿瘤良、恶性风险评分模型
为了构建卵巢肿瘤良、恶性风险分类模型，本发明人利用训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，将模型分为由分子标记物表达量及参比值两部分组成。在训练队列中，根据每个病人的分子标记物表达量的中位值，确定参比值为4.30。当风险值小于或等于参比值时，该样本被预测为良性病变；否则预测为恶性肿瘤。根据训练队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制训练队列的接受者操作特性曲线(ROC曲线，receiver operating characteristic curve)(图4)。模型预测效能的特异性、敏感性和准确性分别为90％、90.0％和90％(表2)。结果表明：在训练队列中，此风险分类模型具有较高AUC、特异性和敏感性,模型预测效能较优。
实施例5.风险评分模型预测效能验证
为了验证风险评分模型预测良恶性的效能，选择另外一组独立队列作为验证队列，根据训练队列中确定的风险分类模型及参比值，对模型的效能进行验证。以参比值4.30为准，将验证队列患者分为低风险组(同训练队列)和高风险组。根据验证队列中每个病人的分子标记物表达量及病理检测结果，绘制验证队列的接受者操作特性曲线(ROC曲线，receiver operating characteristic curve)(图5)。并评估模型预测效能的特异性、敏感性和准确性分别为90.0％、81.8％和85.7％(表2)。结果表明：在验证队列中，此风险预测模型同样具有较高特异性、敏感性和准确性，即模型预测效能较优。
表2.分子标记模型效能评估
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.血液胞外囊泡miRNA在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血液胞外囊泡miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
3.一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合miRNA；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
4.如权利要求3所述的miRNA芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
5.如权利要求3或4所述的miRNA芯片，其特征在于，所述miRNA芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
6.权利要求3-5中任一项所述的miRNA芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。
7.一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测miRNA的检测试剂；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA；
或者，所述检测试剂盒装有权利要求3-5中任一项所述的miRNA芯片。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。
9.一种分离自血液胞外囊泡的miRNA，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；
其中，所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
10.一种鉴别卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：
(a)根据训练队列miRNA表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；
(b)以待测对象miRNA表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；
所述的miRNA是：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的miRNA；或者
(ii)与(i)所述miRNA序列互补的miRNA。
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