CN115948545B

CN115948545B - 一种基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒

Info

Publication number: CN115948545B
Application number: CN202210889593.6A
Authority: CN
Inventors: 赵连梅; 王耀杰; 李晓亚; 魏思思; 白函瑜; 单保恩
Original assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Current assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2042-07-27
Also published as: CN115948545A

Abstract

本发明涉及一种基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒，通过对标志物miR‑636、miR‑7641、miR‑28‑3p和miR‑1246进行实时荧光定量PCR，能够早期诊断ESCC，敏感度和特异度较高。

Description

一种基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒。

背景技术

食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在全球癌症发病率中排名第七，在癌症死亡率中排名第六，是中国第四大恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已处于晚期，肿瘤恶性程度高，病死率高。ESCC患者在诊断时往往处于淋巴结转移的阶段，其5年生存率约为20％。ESCC患者发病后多可见进行性吞咽困难症状，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水及唾液也难以咽下，因此，尽早明确诊断，及时开展有效的治疗，提高患者的5年生存率是至关重要的。

目前，ESCC的诊断手段主要包括以下三类：影像学检查，内镜活检和实验室检查。

1)影像学检查：包括X线食管钡剂或钡气双重对比造影、CT扫描等，是诊断中晚期ESCC的首选手段。食管造影对临床患者的检出准确率＜50％，对筛查发现早期ESCC的价值有限，是基层医院采用的筛查和诊断方法。

2)内镜检查：随着内镜检查、病理活检的普及和技术的发展，早期ESCC的发现率和诊断率明显提高。目前出现了一些新的内镜系统，包括色素内镜、超声内镜、显微内镜、光学相干断层成像等技术，也使ESCC的检出率得到了很大的提高。

3)实验室检查：可用于ESCC筛查和聚焦高危目标人群进一步精查，提高筛查率和早期癌症的检出率，主要包括以下项目：

①血清肿瘤标志物检测：在组织器官发生形态学变化之前检测血清中肿瘤标志物，是早期发现无症状微肿瘤灶的唯一途经，可用于早期癌症的预警，引导进一步检查；也是检出早期癌症和辅助诊断的简便、经济、快速、无创和监测评估的参考指标。

②液体活检技术：是一种通过人体的血液、唾液、尿液等体液检测用于肿瘤诊断的新兴无创技术。目前针对ESCC的液体活检项目主要是血液中的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA(ctDNA)、微小RNA(miRNA)和外泌体等液体活组织检查，敏感度可达60％以上，具有取材简便、微创、可重复性和实时动态监测、克服肿瘤的异质性、检测信息全面等优势，在肿瘤风险预警、筛查、早期辅助诊断、精准靶向诊疗和疗效监测、预后评估中有潜在应用价值；其中ctDNA可获得肿瘤的基因信息，减少肿瘤异质性，有助于筛查和早期诊断，对ESCC的敏感度可达到75％～90％；循环肿瘤细胞反映肿瘤的恶性程度，可作为监测肿瘤进展和判断预后的精准敏感指标。

近些年来，miRNA能够作为疾病诊断的生物标志物这一发现引起众多科学工作者的兴趣，尤其是作为肿瘤诊断标志物方面更是备受关注。miRNAs是一类约有19～25个核苷酸的短的非编码RNA，具有转录后调控能力的小分子，单个microRNA能够通过抑制复合物与多个mRNA结合，阻断整个生物途径。成熟的miRNA被包裹在脂质泡中以外泌体或蛋白复合物的形式存在，作为肿瘤抑制因子或致癌因子，miRNA在癌症的临床诊断中发挥一定作用。Liu等人发现，miR-455-3p在各种癌症中显著上调，并且在ESCC的发生发展过程中发挥着重要的作用。Zhang等人研究发现，miR-644a的下调在促进ESCC细胞的侵袭性方面发挥重要作用。He等人研究发现miR-143-3p在ESCC中作为抑癌因子，通过靶向QKI-5调控细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化。Liu等人研究发现，3-miRNA panel(miR-30e-3p、miR-146a-5p、miR-148a-3p)能够作为诊断结直肠癌患者的生物标志物。另外，Dai等采用测序技术检测ESCC患者血清miRNA的表达，发现miR-1290可作为ESCC早期诊断的无创性肿瘤生物标志物，并且miR-1290是ESCC预后的独立危险因素。血清标志物的检测与食管造影和超声内镜检査相比更为方便，血液检测避免了内镜检查可能出现的食管损伤等风险。并且基于血液的分析可以合并到常规血液检查中，这可以显著减少临床检查所用时间。

但是，体液中游离存在的miRNA易受到RNA酶的影响而发生降解，导致miRNA不能稳定存在于血浆中，阻碍了其成为疾病诊断的生物标志物。

作为miRNA在循环体液中存在的另外一种形式，外泌体作为疾病诊断的生物标志物也已经逐渐成为临床的研究热点。外泌体是膜包裹的纳米级颗粒，包含细胞来源的生物分子，如蛋白质、脂质、RNA和DNA等，外泌体在各种生物液体和组织中是稳定存在的，并通过转移功能性miRNAs和蛋白质，在细胞间的信息传递中起着重要的作用。外泌体包含多种类型的RNA，如mRNA、核糖体RNA(rRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)、miRNAs和其他未知的RNA。作为一种循环分子，miRNA是外泌体中研究最多也是被认为最有诊断价值的小RNA生物标志物，研究发现，外泌体来源的miRNA在调节基因表达、肿瘤生长和肿瘤治疗耐药性等方面发挥着关键作用。另外，越来越多的证据证明外泌体来源的miRNA参与了ESCC的生物学进程。例如，外泌体miR-154-5p可以通过靶向驱动蛋白家族成员14(KIF14)减弱ESCC的进展和血管生成能力。人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过递送microRNA-375下调ENAH，从而延缓ESCC的进展。外泌体来源的miR-339-5p通过下调Cdc25a介导了ESCC的放射治疗敏感性。

但目前基于外泌体miRNA检测技术的敏感度和特异度相对较低，技术条件和成本较高，尚未标准化，有待进一步研究与探索。

发明内容

本发明的目的是提供一种敏感度和特异度较高，能够早期诊断ESCC的基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒。

本发明采用如下技术方案：

一种标志物miR-636、miR-7641、miR-28-3p和miR-1246在制备ESCC诊断试剂或试剂盒中的应用。

一种ESCC诊断试剂盒，其特征在于，其包括用于对标志物miR-636、miR-7641、miR-28-3p和miR-1246的表达水平进行检测的实时荧光定量PCR引物。

其中，用于miR-636的表达水平进行检测的实时荧光定量PCR引物对如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

其中，用于miR-7641的表达水平进行检测的实时荧光定量PCR引物对如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示。

其中，用于miR-28-3p的表达水平进行检测的实时荧光定量PCR引物对如SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所示。

其中，用于miR-1246的表达水平进行检测的实时荧光定量PCR引物对如SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14所示。

进一步的，所述标志物miR-636、miR-7641、miR-28-3p和miR-1246提取自外周血。

进一步的，所述标志物miR-636、miR-7641、miR-28-3p和miR-1246提取自外周血中的血浆外泌体。

本发明的有益效果在于：本发明通过采集患者血浆，进行外泌体及其miRNA的提取，利用荧光定量PCR的方法检测外泌体源性的miR-636，miR-7641，miR-1246和miR-28-3p的表达含量，获得精确的数值，从而进行ESCC的诊断，解决了由于侵入性检查手段给患者带来的不适，以及由于肉眼对形态判断的不准确而出现的误诊的问题，为进一步研发ESCC检测产品奠定实验基础，为降低ESCC的危害做出贡献。

作为ESCC最主要的转移途径，淋巴结转移状态己成为影响患者预后的关键因素，并且术前预测ESCC淋巴结转移状态可有效辅助临床医生对手术方式做出最优选择。因此我们不仅在ESCC差异表达miRNA中选择了候选标志物，还在不同淋巴结转移分期的差异表达miRNA中筛选miRNA作为诊断食管癌的标志物。

附图说明

图1为血浆外泌体的分离过程图。

图2为外泌体的鉴定方法图。

图3为差异表达的miRNA分析图。

图4为在训练队列和测试队列中候选miRNA的表达情况。

图5为ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例和附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

1、血浆收集

从河北医科大学第四医院收集血液样品(2-3mL)199例(59例HC和140例ESCC患者)(如表1所示)，将血液收集到EDTA收集管中并轻轻混合。

两步法离心收集血浆：

1)血液在4℃下1500×g离心20分钟以除去细胞，收集上清液；

2)将第一步收集的上清液在4℃下3000×g再次离心15分钟以收集血浆样品。

将血浆样品保存在-80℃或立即使用。

表1临床信息

2、血浆外泌体的分离

如图1所示，用排阻色谱法提取59例HC和140例ESCC患者血浆外泌体。使用前首先检查排阻色谱柱内是否存在气泡，并在使用前测量流速。将1mL血浆样品经过0.22μM的过滤器进行过滤，以除去大于200nm的微囊泡和凋亡小体，收集上清液，并将其加入到排阻色谱柱的顶部，在样品完全进入柱后，加入磷酸盐缓冲盐水以分离外泌体和其他颗粒。收集外泌体并将其加入到100kDa的超滤管中进行浓缩。最后，将外泌体重悬于100μL的磷酸盐缓冲盐水中。

3、外泌体的鉴定

通过电镜观察外泌体为杯状的双层脂质膜结构(如图2A)；蛋白免疫印迹法确定外泌体表面阳性标记物HSP90、TSG101和CD9，以及阴性标记物calnexin(如图2B)，表明没有内质网蛋白的污染；纳米流式细胞术分析鉴定外泌体的直径在30～150nm之间(如图2C)。以上实验证明我们所分离的物质是外泌体。

4、血浆外泌体中miRNA的提取及测序分析：

利用miRNA提取试剂盒进行血浆外泌体miRNA的提取，利用测序技术进行miRNA的测序，根据p值和log₂FC从差异表达的miRNA表达谱中筛选候选miRNA进行后续的PCR验证。

5、筛选miRNA作为ESCC的候选生物标志物

对22例ESCC患者和10例HC的血浆来源的外泌体进行下一代测序。对差异表达的miRNA进行分析显示(|Log₂FC|≥1，P≤0.05)，与HC相比，在ESCC血浆来源的外泌体中，有69个miRNA表达下调，14个miRNA表达上调(图3A，表2)。

表2 HC血浆外泌体与ESCC血浆外泌体的83个差异表达的miRNAs

根据P值和log₂FC，以及文献调研，我们确定了两个生物标志物：miR-636(P＝0.0026；log₂FC＝-2.278)和miRNA-28-3p(P＝0.038；log₂FC＝1.657)。文献报道，miR-636可以通过靶向宫颈癌中的CDK6/Bcl-2抑制细胞存活，通过靶向转录因子Gli2抑制EMT、细胞增殖和细胞周期，通过下调KLF9促进膀胱癌的进展。总之，miR-636在癌症中显著下调，调节癌症的进展，并可作为诊断ESCC的候选miRNA。

表3不同N分期患者血浆外泌体中的108个差异表达的miRNAs

在不同N分期的ESCC血浆源性外泌体的RNA测序数据中，我们发现了108个差异表达的miRNA(图3B，表3)。在这些miRNA中，通过实验进一步发现miR-7641(P＝0.028)和miRNA-1246(P＝0.042)可确定为诊断ESCC的候选标志物。

6、在ESCC和HC血浆外泌体中验证候选miRNA

将59例HC和140例ESCC患者按照1∶1的比例将其分为训练队列(HC＝36，ESCC＝64)和测试队列(HC＝23，ESCC＝76)。提取血浆外泌体中的miRNA，利用TAKARA逆转录和实时荧光定量PCR试剂盒在训练队列和测试队列中检测候选miRNA的表达情况。

(1)逆转录

1)使用TAKARA逆转录试剂盒进行制备。

最终得到总体积为10μL的混合试剂。

2)将上述反应体系混合均匀，37℃59min；85℃5s；4℃冷却，反应结束后得到cDNA，可放置于-20℃保存。

(2)实时荧光定量PCR

本实验采用TaqMan荧光探针法进行扩增，选用U6作为内参基因，每组设置3个复孔，反应体系如下：

95℃预变性30s。随后按如下程序进行40个循环：

然后，40℃冷却2min。待程序结束后，观察扩增曲线，以及复孔间扩增曲线的拟合程度，确定重复性良好，产物特异。随后通过2^-ΔCT计算表达量。

(3)引物序列如下：

1)miR-636引物序列

上游引物(SEQ ID No.1)：CTGTGCTTGCTCGTCCC

下游引物(SEQ ID No.2)：GTGCAGGGTCCGAGGT

探针引物(SEQ ID No.3)：TATTCGCACTGGATACGACTGCGGG

逆转录引物(SEQ ID No.4)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCGGG。

2)miR-7641引物序列

上游引物(SEQ ID No.5)：CGCGTTGATCTCGGAAG

下游引物(SEQ ID No.6)：GTGCAGGGTCCGAGGT

探针引物(SEQ ID No.7)：TAAGCGTCGTATCCAGTGCGAA

逆转录引物(SEQ ID No.8)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAG。

3)miR-1246引物序列

上游引物(SEQ ID No.9)：ACGGAGCGAATGGATTTTTGG

下游引物(SEQ ID No.10)：CAGTGCAGGGTCCGAGGT

探针引物(SEQ ID No.11)：CAGAGCCACCTGGGCAATTT

逆转录引物(SEQ ID No.12)：CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTGCT。

4)miR-28-3p引物序列

上游引物(SEQ ID No.13)：ACGGAAGGAGCTCACAGT

下游引物(SEQ ID No.14)：GTGCAGGGTCCGAGGT

探针引物(SEQ ID No.15)：TTCGCACTGGATACGACCTCAATAG

逆转录引物(SEQ ID No.16)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCAAT。

5)内参基因U6引物序列

上游引物(SEQ ID No.17)：CTCGCTTCGGCAGCACA

下游引物(SEQ ID No.18)：AACGCTTCACGAATTTGCGT

探针引物(SEQ ID No.19)：AGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCA

逆转录引物(SEQ ID No.20)：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

分别在血浆外泌体中检测4个miRNA的表达水平，首先保证每个miRNA的Ct值范围应在15～35之间，接着计算每个miRNA的2^-ΔCT值。

其中，ΔCT＝待测样本目的基因的CT的平均值-待测样本内参基因的CT平均值。

根据每个miRNA的2^-ΔCT值，计算每组样本的均数和标准差(见表4)。检测到与59例HC相比，140例ESCC的hsa-miR-636表达量显著降低(P＝0.0013)，而hsa-miR-7641(P<0.001)，hsa-miR-1246(P＝0.0037)和hsa-miR-28-3p(P＝0.0086)的表达量均显著升高，差异具有统计学意义。

表4候选miRNA表达量结果

实验发现(图4所示)，无论是在训练队列还是在测试队列中，与HC相比，ESCC患者中miR-636的表达均显著下调，而miR-7641、miR-1246和miR-28-3p均显著上调，与miRNA测序结果一致。

7、候选miRNA的诊断性能评估

为了研究这四种miRNA对ESCC的诊断价值，进行ROC曲线分析。

表5候选miRNA的诊断性能

表5展示了1～4个候选miRNA的模型的最佳性能，图5展示了4个miRNA模型的ROC曲线图，如表5所示，这4个候选miRNA的曲线下面积(AUC)范围在0.555～0.72之间。然后，使用2个或4个miRNA构建诊断模型进行ROC曲线分析。发现在训练队列中由2个miRNA组成的诊断模型的AUC在0.602～0.776之间，在测试队列中为0.602～0.752；由3个miRNA组成的诊断模型的AUC在0.756～0.829之间，在测试队列中为0.756～0.794；而在训练队列中由4个miRNA组成的诊断模型的AUC为0.834(95％CI：0.756-0.911)(图5A)，在测试队列中为0.802(95％CI：0.71～0.894)(图5B)。这些结果表明，联合miRNA模型比任何单一miRNA具有更好的诊断性能，可以作为诊断ESCC的生物标志物。

Claims

1.一种联合四种基于外周血血浆外泌体miRNA标志物的miR-636、miR-7641、miR-28-3p和miR-1246在制备ESCC诊断试剂或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于miR-636的表达水平进行检测的引物序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于miR-7641的表达水平进行检测的引物序列如SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于miR-1246的表达水平进行检测的引物序列如SEQ ID No.9~SEQ ID No.12所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于miR-28-3p的表达水平进行检测的引物序列如SEQ ID No.13~SEQ ID No.16所示。