CN116751857A - 定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用 - Google Patents
定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用。该应用中的外泌体miRNA分子标志物为hsa‑miR‑1972,hsa‑miR‑4274,hsa‑miR‑4701‑3p,hsa‑miR‑6126,hsa‑miR‑1268a和hsa‑miR‑4505中的至少一种;这6个miRNA是通过直接对食管癌患者的唾液外泌体进行miRNA芯片筛选所得到的,为全新的外泌体miRNA标志物,是本发明人首次发现,对于食管癌的标志物和疾病进展机制研究均有重要意义。本发明提供的包括外泌体miRNA分子标志物的肿瘤诊断试剂盒是一种具有非侵袭性、高敏感性、高特异性、适用于普查或筛查的液体诊断监控试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤液体活检和分子诊断领域,具体涉及定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用。
背景技术
癌症一直威胁着人类的健康,目前每年全世界约有700万人死于癌症,其发病隐匿,进展迅速,在出现临床症状或于医院就诊时,往往已经发展到了晚期,大多数患者在确诊后数年内死亡。以食管癌为例,我国是食管癌高发的国家,我国的食管癌多为鳞癌。食管癌早期无明显症状,中晚期出现吞咽梗阻,绝大多数病人就诊时已经处于晚期,错过了最佳治疗时间。而有调查证据表明相对于晚期治疗,早期治疗可使病人的5年生存率从20%-30%提高到60%-80%。
目前食管癌的诊断依赖于影像学和组织病理学,前者只能检测到足够大的肿瘤,而后者需要采用食管内镜或者外科手术的方法从患者身上获取肿瘤组织。上述两种手段存在诸多不足,如灵敏性差,侵入式检查往往使得患者依从性差,成本较高,检查效率低,无法大批量开展筛查、普查,而且还受到医生的技术水平以及病人的身体状况等诸多因素的影响,难以用在早期筛查。所以食管癌的早期诊断需要使用敏感性好,无创或微创,基于肿瘤特异性标志物的诊断技术。
现有的肿瘤的标志物包含DNA、RNA、蛋白质、非编码RNA等多种类型,从标志物的表现形式可分为基因突变、扩增、高表达等。近年来一些小非编码RNA逐渐被发现可作为肿瘤的标志物,如miRNA、piRNA、snoRNA、小非编码RNA、tsRNA以及一些未命名的非编码RNA等。这些不同类型的小非编码RNA在细胞内参与多种生物学调控过程,并可参与细胞间的交流、调控。研究表明,在肿瘤发生时,细胞的多种类型的小RNA表达量均会发生不同程度的改变,并参与到肿瘤进展过程或作为肿瘤发生发展的产物。其中miRNA是研究最多的小RNA,miRNA可靶向mRNA从而抑制mRNA的翻译,进而调控基因表达,在肿瘤的发生发展中起到重要作用。但是由于食管癌是我国特别高发的消化道肿瘤,在西方国家的发病率较低,所以目前世界上尚未有针对食管癌的分子标志物。
目前液体活检标志物的来源主要包括CTC、ctDNA和外泌体。CTC和ctDNA主要来源是血液,研究较早,但各有其局限性,CTC是实体瘤释放到外周血中的循环肿瘤细胞,ctDNA是肿瘤细胞释放到外周血中的DNA,二者虽有一定优势,但是这两种检测基因突变的方法都存在缺陷和瓶颈。ctDNA偏前端,主要通过检测突变和DNA甲基化用于癌症早期筛查,个性化用药指导和耐药性分析,但其在血浆中含量有限(10-20ng/mL),如何有效的富集仍是相关分析的最关键步骤和难点。CTC偏后端,主要用于癌症的实时监测,判断预后等,但也存在诸多问题。比如目前检测方法只能找到少量肿瘤细胞,起不到指导个体化用药的目的;而且循环肿瘤细胞有很多个分型,目前检测方法只能检测到很少几个分型,漏检率高,且检测费用高。
相比于CTC和ctDNA,外泌体作为液体活检标志物的新兴载体在疾病诊断中正扮演着越来越重要的角色。外泌体可由B细胞、T细胞、树突细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等机体内几乎各种细胞分泌释放,且存在于血液、唾液、尿液、腹水、脑脊液和母乳等多种体液中,其中含有蛋白质、核酸和代谢产物等多样性内容物,与各种疾病的发生与进程密切相关。
唾液是液体诊断的重要组成部分,近年来得到了越来越多的关注,在疾病早期诊断中具有明显的作用。唾液腺血供丰富,唾液被认为是血循环的末端产物,很多血液中的分子物质也见于唾液中。唾液被称为血液的超滤液,比起血液更加纯净,去掉了血液中的很多有型成分。相较其他液体而言,唾液具有易操控,不易凝结,消除了抗凝处理对检验结果的影响。同时,唾液采集具有非侵袭性,受试者无痛苦和不适,具有可重复性,安全而廉价。另外,血液中成分复杂,来源多样,信息斑驳,在检测分析的过程中可能会引起非特异性及受到流体动力学作用的干扰,血液中的大量细胞具有数秒至数周或一个月以上的半衰期,也可能对分析结果产生影响,而唾液则不存在这些问题。总之,唾液作为液体活检标志物的来源较之其他体液具有较明显的优势。
虽然液体活检正在发展,但目前还需要完善。一是液体的种类,二是检测指标。选择合适的体液进行检测对于液体活检的临床效能至关重要,目前大部分液体活检主要以血液为检测对象,但是血液中细胞成分复杂,血液中的部分游离DNA、外泌体等来源于血细胞(如血小板),会对检测结果造成较大影响。此外,合适的检测指标也是提高液体活检灵敏度与特异度的重要因素,液体活检指标首先要易于保存,稳定性强,不易受酶或外界因素的影响而降解,其次要有疾病特异性,可准确反应体内疾病的进展状态。
综上,现有技术往往存在以下缺点:1)目前用在临床上的ctDNA和CTC为主的检测手段,因其局限性难以做到恶性肿瘤的早期诊断;2)目前以血液为采集标本的液体活检手段除了凝血问题之外,还有一定的创伤性,给患者带来不适,存在患者依从性不好等问题,不利于实现连续监测;3)目前的检测手段缺乏足够的敏感性与特异性;4)取材不方便且不易于存放;5)操作的进行对医生要求较高。目前尚未见有能够很好地解决上述问题的技术。
目前,在临床上尚未有将外泌体miRNA分子标志物用于食管癌诊断的产品。
发明内容
针对现有技术中存在的缺点与不足,本发明的目的在于提供新的外泌体miRNA分子标志物在制备食管癌诊断工具中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用;
所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505中的至少一种。
进一步地,所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505的组合物。
进一步地,所述的外泌体miRNA分子标志物优来自于唾液外泌体。
进一步地,所述的食管癌包括食管鳞癌。
进一步地,所述的定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品包括荧光定量PCR检测外泌体miRNA分子标志物的表达水平的试剂。
一种食管癌诊断试剂盒,所述的试剂盒含有定量检测外泌体miRNA分子标志物的试剂;所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505中的至少一种。
进一步地,所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505的组合物。
进一步地,所述的定量检测外泌体miRNA分子标志物的试剂包括荧光定量PCR检测外泌体miRNA分子标志物的表达水平的试剂;
更进一步地,所述的荧光定量PCR检测外泌体miRNA分子标志物的表达水平的试剂包括上述外泌体miRNA分子标志物的特异性引物和通用反向引物;
再进一步地,hsa-miR-1972的特异性引物的序列为:
5'-TCAGGCCAGGCACAGTGGCTCA-3';
hsa-miR-4274的特异性引物的序列为:5'-CAGCAGTCCCTCCCCCTG-3';
hsa-miR-4701-3p的特异性引物的序列为:5'-TTGGCCACCACACCTACCCCTT-3';
hsa-miR-6126的特异性引物的序列为:5'-GTGAAGGCCCGGCGGAGA-3';
hsa-miR-1268a的特异性引物的序列为:5'-CGGGCGTGGTGGTGGGGG-3';
hsa-miR-4505的特异性引物的序列为:5'-AGGCTGGGCTGGGACGGA-3';
通用反向引物的序列为:5'-CCAGTGCACGCACCGAGGTA-3'。
进一步地,所述的食管癌诊断试剂盒还含有外泌体RNA提取组分和外泌体miRNA反转录组分。
更进一步地,所述的外泌体RNA提取组分包括外泌体RNA提取液、外泌体RNA除杂液、外泌体RNA沉淀液、外泌体RNA洗涤液和外泌体RNA富集液。
更进一步地,所述的外泌体miRNA反转录组分包括5×miRNA反转录缓冲液、miRNARTase混合液、miRNA polyA多聚酶、DEPC水和总RNA。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果:
(1)本发明人意外发现hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-6126在食管癌患者的唾液外泌体中显著下调,而hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505在食管癌患者唾液外泌体中显著上调,并应用了Q-PCR进行了大样本的验证。因此,本发明所提供的唾液外泌体hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505具有严谨的科学基础与良好的科学意义,保证了hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505作为食管癌标志物和在诊断试剂盒中的应用的科学性与普适性,且hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505联合作为标志物提高了检测的敏感性以及特异性。本发明中的hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505在食管癌患者唾液外泌体中的表达是本发明人首次发现的,对于食管癌的标志物和疾病进展机制研究均有重要意义。
(2)本发明提供的包括外泌体miRNA分子标志物的肿瘤诊断试剂盒是一种具有非侵袭性、高敏感性、高特异性、适用于普查或筛查的液体诊断监控试剂盒。
(3)通过检测肿瘤源性外泌体来源的miRNA的表达,提供一种能够利用体液等生物样本进行食管肿瘤诊断的,稳定性高、定量精确的试剂盒和系统,并由于其微创,易于检测,便于反复多次取样的特点,有助于实时反映动态检测食管癌患者的疾病状态,有助于临床医生迅速掌握患者病情,从而及时制定更具有个体化的治疗措施。
(4)本发明开发了一种肿瘤诊断试剂盒通过检测外泌体中的hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505的表达量,这些分子标记物都能够单独或者联合起来用于食管癌的诊断及预测预后,具有稳定性好,重复率高,获取简单,灵敏性和特异性均优于现有技术的特点,解决了食管癌缺乏一种明确的诊断和预后标志物的难题。
(5)本发明中的分子标志物对食管癌的预测效率(敏感性、特异性和AUC)比现有的分子标志物(HOTAIR标志物、YKL-40+SCCA标志物、IL-8标志物、miR-155标志物)更高。
(6)本发明以唾液为标本,利用唾液诊断效果优于血液和其他体液的特点,提供了一种基于外泌体的液体活检方法,该方法弥补了传统活检的不足,相较于目前使用的CTC和ctDNA,本发明中的外泌体检测miRNA更能反应肿瘤状况。本发明中的miRNA具有比ctDNA更稳定,并更能反映肿瘤细胞的内在生物信息,并且检测方便,一次采样可以检测多个标志物,可以定量,便于统一标准,另外本发明是通过高通量芯片筛选出的一组外泌体miRNA,可以通过组合来更全面准确地反映肿瘤细胞的细微变化。另外,本发明利用外泌体miRNA能够有效避免直接检测裸露的DNA和RNA造成的损失和降解。
附图说明
图1为实施例1中所提取唾液外泌体的鉴定结果图;其中,A图为透射电镜图,B图为纳米粒径分布图,C为免疫印迹结果图。
图2为实施例1中通过miRNA芯片筛选到的差异miRNA结果图;其中,A图为miRNA芯片从29例健康志愿者和25例食管癌患者唾液外泌体样本中筛选到的56个差异表达miRNA的结果图,B图为LASSO回归分析结果图。
图3为实施例1中miRNA芯片筛选出的7个miRNA的差异表达情况和小样本验证结果图;其中,A图为7个miRNA聚类分析的热图,B图为6个miRNA在36例食管癌唾液样本和36例健康人样本中的表达情况图。
图4为实施例1临床研究中6个miRNA在三个研究组中的表达情况及在训练组中的诊断ROC曲线图,其中a-f分别代表6个miRNA,a:hsa-miR-1972;b:hsa-miR-4274;c:hsa-miR-4701-3p;d:hsa-miR-6126;e:hsa-miR-1268a;f:hsa-miR-4505。
图5为实施例1中三个研究组的食管癌患者生存曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例中的试剂若非特别说明,均可通过市购得到。
实施例1:通过检测唾液外泌体中特定miRNA的含量对食管癌患者进行诊断
1.唾液的收集、保存以及运输
(1)收集:于早晨8-10点,采用非刺激性滴取法于安静舒适的环境下,对满足下列条件受试者进行全唾液收集:1)空腹,未进行剧烈运动;2)嘱咐受试者用约20-60mL左右漱口液,以清除口腔内食物等残渣,吐尽残留液体,头部微下垂,静坐后待唾液自然流出,收集其非刺激性全唾液于收集皿中,以唾液铺满培养皿为宜,约250-900μL,而后迅速分装至无菌保存管。
(2)保存:采集的唾液在保存管离心后,-80℃可长期保存。
(3)运输:如需运输,可置于运输盒进行运输,以保证后续实验免受唾液中各种微生物或酶的影响。
发明人多年来在国内多家医院收集大量肿瘤患者和正常人的用于外泌体检测的唾液样本(均按上述标准进行收集、保存及运输),并且对所有患者进行随访,每三月随访一次,并详细记录患者的生存状态和复发情况,建立完整的病例随访资料。
2.唾液外泌体提取、保存及运输
(1)唾液外泌体的提取:取等体积步骤1所得唾液500μL(未进行离心处理的唾液),300g离心10min,转移上清至新的离心管中,2000g离心10min,转移上清至新的离心管中,5000g离心20min,用移液器将离心所得上清移至新的1.5mL的EP管中,得约450-470μL澄清上清;按澄清上清:外泌体沉淀试剂=250:63的体积比加入外泌体沉淀试剂混匀,4℃静置孵育过夜,1500g、4℃离心30min,3000g离心5min后弃上清,收集沉淀物,将沉淀物用适量1×外泌体悬浮液重悬得到外泌体重悬液。所得外泌体可通过透射电镜、纳米粒径分析和免疫印迹鉴定,见图1。
根据Nanosight分析外泌体相应数量,结果如下表格所示:
表1:
样本量(μL) | 样本来源 | 所得外泌体数量(颗粒/mL) |
500 | 唾液 | 1~10×108 |
(2)唾液外泌体的保存及运输
获取的外泌体在保存管置于-80℃冰箱可以长期保存,其中含有的RNA、DNA、蛋白等都能较为稳定的保存。
3.唾液外泌体中RNA提取
向上述步骤2中得到的外泌体重悬液中加入250~500μL的外泌体RNA提取液,反复吹打后,室温裂解7~14min,混合均匀后加入相应miRNA的外参cel-miR-39用以后续分析标准化。加入60μL的外泌体RNA除杂液,涡旋充分混匀后,室温静置4~14min,10000~13000g离心4~14min,转上层水相到另一个新管,加入等体积的外泌体RNA沉淀液,上下颠倒混匀后室温静置4~14min,或者-20℃沉淀,10000~13000g离心4~14min后,弃去上清液,加入250~500μL-20℃预冷的外泌体RNA洗涤液洗涤沉淀,震荡混匀,12000g/5min,弃乙醇液体,超净台静置充分晾干沉淀。所得沉淀用外泌体RNA富集液溶解沉淀,运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测纯度及浓度,所得RNA封口膜密封,-80摄氏度保存。
上述试剂成分如表2所示:
表2:
试剂名称 | 主要成分 |
外泌体沉淀试剂 | 聚乙二醇6000 |
外泌体悬浮液 | 磷酸缓冲盐溶液 |
外泌体RNA提取液 | 苯酚和RNA酶抑制剂 |
外泌体RNA除杂液 | 氯仿 |
外泌体RNA沉淀液 | 异丙醇 |
外泌体RNA洗涤液 | 75%DEPC乙醇 |
外泌体RNA富集液 | 1×PBS溶液 |
运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测分析,唾液外泌体中RNA的浓度如表3所示:
表3:
样本量(μL) | 样本来源 | 所得总RNA浓度(ng/μL) | 所得总RNA体积(μL) |
500 | 唾液 | 50~300 | 25~30 |
发明人按照上述步骤提取所收集的唾液外泌体中的总RNA,根据总RNA浓度,送检适量体积的RNA进行miRNA array芯片分析实验,实验涉及广东省内25例食管癌肿瘤患者以及29例正常志愿者的唾液。严格控制两组之间的年龄、性别、有无吸烟因素没有显著差异。
唾液外泌体miRNA array实验筛选发现了56个差异表达的miRNA,见图2A。进一步利用LASSO回归分析筛选发现7个miRNA的组合可以得到最高的诊断效率,见图2B,图3A。
4.唾液外泌体中miRNA反转录
使用加尾法将miRNA反转录成cDNA,采用市面上已成熟的试剂盒:广州复能基因有限公司的All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection(QP015、QP016),按照说明书操作,所用的试剂具体如表4所示:
表4:
成份 | 剂量 |
5×miRNA反转录缓冲液 | 5μL |
miRNA RTase混合液 | 1μL |
miRNA polyA多聚酶 | 1μL |
总RNA | 1ng-5μg |
DEPC水 | 补足至25μL |
将表4中的各组分混合均匀后,简单离心置于PCR仪,37℃1h,85℃5min,所得产物cDNA置于-80℃冰箱备用。
5.Q-PCR验证6个miRNA对食管癌发病的诊断
使用SYBR GREEN法或者探针法对miRNA反转录所得cDNA进行检测,采用市面上已成熟的试剂盒:广州复能基因有限公司的All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection(QP015、QP016),按照说明书操作,以表5所示的比例配成20μL Real Time PCR反应体系:
表5:
成份 | 剂量 |
2×SYBR GREEN缓冲液 | 10μL |
通用反向引物 | 2μL |
特异性引物 | 2μL |
cDNA模板 | 2μL |
ROX试剂 | 0.1μL |
ddH2O | 3.9μL |
所用的miRNA特异性引物和通用反向引物的具体引物序列如下:
hsa-miR-1972特异性引物:5'-TCAGGCCAGGCACAGTGGCTCA-3';
hsa-miR-4274特异性引物:5'-CAGCAGTCCCTCCCCCTG-3';
hsa-miR-4701-3p特异性引物:5'-TTGGCCACCACACCTACCCCTT-3';
hsa-miR-6126特异性引物:5'-GTGAAGGCCCGGCGGAGA-3';
hsa-miR-1268a特异性引物:5'-CGGGCGTGGTGGTGGGGG-3';
hsa-miR-4505特异性引物:5'-AGGCTGGGCTGGGACGGA-3';
通用反向引物:5'-CCAGTGCACGCACCGAGGTA-3'。
使用Bio-rad伯乐CFX Connect荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测,2-△CT法进行相对定量。
实时荧光定量PCR检测的反应条件为:预变性阶段:95℃10min;扩增循环阶段:95℃10s、60℃20s、72℃10s,40个循环。
6.临床研究
发明人首先对miRNA芯片选出的7个miRNA在小样本人群中进行验证,在36例食管癌患者和36例健康对照者的唾液样本中,食管癌患者唾液外泌体中hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-6126的表达显著低于健康对照者,而hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505的表达显著高于健康对照者(见图3B,其变化倍数见表6)。此外,hsa-miR-142-3p检测不到。因此最终确定了hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505作为食管癌的候选标志物。
表6:
miRNA名称 | p值 | 变化倍数 |
hsa-miR-1972 | <0.001 | 0.53 |
hsa-miR-4274 | <0.001 | 0.46 |
hsa-miR-4701-3p | <0.001 | 0.48 |
hsa-miR-6126 | <0.001 | 0.53 |
hsa-miR-1268a | <0.001 | 1.16 |
hsa-miR-4505 | <0.001 | 1.81 |
发明人利用选出的6个miRNA进行临床研究,在广东和河南两个食管癌高发区设置了3个组进行研究,分别为训练组,内部验证组和外部验证组。训练组入组了广东省内120例健康志愿者、100例早期食管癌患者和122例晚期食管癌患者;内部验证组入组了广东省内60例健康志愿者、62例早期食管癌患者和78例晚期食管癌患者;外部验证组入组了河南省内60例健康志愿者、56例早期食管癌患者和103例晚期食管癌患者。按照上述方法对6个miRNA进行PCR验证,2-△CT法进行相对定量。
结果如图4所示,hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-6126在食管癌患者的唾液外泌体中的表达明显低于正常人,而hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505在食管癌患者的唾液外泌体中的表达明显高于正常人。
对上述训练组的100例早期食管癌患者唾液和120例正常人唾液中的6个miRNA表达量利用ROC曲线分析显示,6个miRNA中的任何一个或多个组合作为食管癌的诊断标志物时,效果如下:
单个miRNA中AUC最高的是hsa-miR-4274(AUC=0.795),2个miRNA组合AUC最高的是hsa-miR-6126和hsa-miR-4505组合(AUC=0.872),3个miRNA组合AUC最高的是hsa-miR-6126、hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505组合(AUC=0.914),4个miRNA组合AUC最高的是hsa-miR-4701-3p、hsa-miR-6126、hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505组合(AUC=0.944),5个miRNA组合AUC最高的是hsa-miR-1972、hsa-miR-4701-3p、hsa-miR-6126、hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505组合(AUC=0.957),6个miRNA组合AUC为0.969,见图4D。此外,6个miRNA的所有可能组合及其AUC均在表7中列出,其中a-f分别代表6个miRNA,a:hsa-miR-1972;b:hsa-miR-4274;c:hsa-miR-4701-3p;d:hsa-miR-6126;e:hsa-miR-1268a;f:hsa-miR-4505。由此可见,筛选出的外泌体中的miRNA能较好对食管癌进行诊断,并且6个miRNA组合时诊断效果最好。
表7:
另外,利用SPSS 19.0软件,通过COX回归将6个miRNA的表达值联合得到一个风险评分,利用该风险评分的中位数作为分界点,将病人分为高风险组和低风险组,利用Kaplan-Meier法对高风险组和低风险组的病人进行生存分析,结果如图5所示。
由图5可知,在三个研究组中,6个miRNA组合均可有效预测食管癌患者的预后。
此外,我们还将本发明的标志物6个miRNA组合对食管癌的诊断效率与已知的标志物进行比较,如表8所示。
表8:
HOTAIR标志物已在Wang W et al.Serum HOTAIR as a novel diagnosticbiomarker for esophageal squamous cell carcinoma.Mol Cancer.2017.DOI:10.1186/s12943-017-0643-6中公开;
YKL-40+SCCA标志物已在Zheng X et al.Establishment of using serum YKL-40and SCCA in combination for the diagnosis of patients with esophagealsquamous cell carcinoma.BMC Cancer.2014.DOI:10.1186/1471-2407-14-490中公开;
IL-8标志物已在Huang Z et al.Serum interleukin-8as a potentialdiagnostic biomarker in esophageal squamous cell carcinoma.CancerBiomark.2020.DOI:10.3233/CBM-201687中公开;
miR-155标志物已在Zheng Y et al.MicroRNA-155acts as a diagnostic andprognostic biomarker for oesophageal squamous cell carcinoma.Artif CellsNanomed Biotechnol.2020.DOI:10.1080/21691401.2020.1773479中公开;
从表7可以看出:本发明的外泌体miRNA分子标志物对于食管癌的诊断效率比其他已知标志物更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用,其特征在于,所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505的组合物。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的外泌体miRNA分子标志物来自于唾液外泌体。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的食管癌为食管鳞癌。
5.一种食管癌诊断试剂盒,其特征在于,含有定量检测外泌体miRNA分子标志物的试剂;
所述的外泌体miRNA分子标志物为hsa-miR-1972,hsa-miR-4274,hsa-miR-4701-3p,hsa-miR-6126,hsa-miR-1268a和hsa-miR-4505中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的食管癌诊断试剂盒,其特征在于,所述的定量检测外泌体miRNA分子标志物的试剂包括荧光定量PCR检测外泌体miRNA分子标志物的表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的食管癌诊断试剂盒,其特征在于,所述的荧光定量PCR检测外泌体miRNA分子标志物的表达水平的试剂包括外泌体miRNA分子标志物的特异性引物和通用反向引物。
8.根据权利要求7所述的食管癌诊断试剂盒,其特征在于:
hsa-miR-1972的特异性引物的序列为:5'-TCAGGCCAGGCACAGTGGCTCA-3';
hsa-miR-4274的特异性引物的序列为:5'-CAGCAGTCCCTCCCCCTG-3';
hsa-miR-4701-3p的特异性引物的序列为:5'-TTGGCCACCACACCTACCCCTT-3';
hsa-miR-6126的特异性引物的序列为:5'-GTGAAGGCCCGGCGGAGA-3';
hsa-miR-1268a的特异性引物的序列为:5'-CGGGCGTGGTGGTGGGGG-3';
hsa-miR-4505的特异性引物的序列为:5'-AGGCTGGGCTGGGACGGA-3';
通用反向引物的序列为:5'-CCAGTGCACGCACCGAGGTA-3'。
9.根据权利要求5所述的食管癌诊断试剂盒,其特征在于,所述的肿瘤诊断试剂盒还含有外泌体RNA提取组分和外泌体miRNA反转录组分。
10.根据权利要求5所述的食管癌诊断试剂盒,其特征在于:
所述的外泌体RNA提取组分包括外泌体RNA提取液、外泌体RNA除杂液、外泌体RNA沉淀液、外泌体RNA洗涤液和外泌体RNA富集液;
所述的外泌体miRNA反转录组分包括5×miRNA反转录缓冲液、miRNA RTase混合液、miRNA polyA多聚酶、DEPC水和总RNA。
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